生物化學與分子生物學實驗技術

1、生物化學與分子生物學實驗技術實驗安全與實驗基本操作實驗室常用試劑的使用安全二甲苯 無色液體，有芳香氣味，易揮發(fā)。用來制造、染料、塑料和藥物。屬低毒類，對皮膚和黏膜有刺激作用，高濃度有麻醉作用。神經(jīng)系統(tǒng)會受損害，還會使腎和肝受時性損傷。 眼睛接觸：蒸氣會刺激眼睛，液體導致嚴重刺激，發(fā)紅腫脹和灼傷。通常影響是暫時性的。皮膚接觸：產(chǎn)生灼傷感、干燥?？梢杂梦氐木徛魉疀_洗至少20分鐘，用無摩擦性的肥皂有助于從皮膚上洗去二甲苯。 易燃，有爆炸危險。屬于甲類防火危險物質(zhì)。用二氧化碳或干粉或泡沫滅火劑，不宜用水。三氯甲烷 無色透明易揮發(fā)液體，有特殊的香甜氣味。沸點：61.2，醫(yī)藥上用作麻醉劑。也用作萃取劑

2、和溶劑。 有很強的麻醉作用，在光的作用下，能被空氣中的氧反應生成氯化氫和劇毒的光氣。通常加入12%乙醇，使生成的光氣與乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。 吸入高濃度蒸汽時，開始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，發(fā)生流淚、感覺麻醉、嘔吐、痙攣、直到昏睡、不省人事。 在空氣、水分和光的作用下，酸度增加，因而對金屬有強烈的腐蝕性乙醚 透明、無色、易揮發(fā)有芳香刺激性氣味的液體。沸點：34.6；對人體有麻醉性能。當吸入含量為3.5%時，3040分鐘就可失去知覺。 人體過量吸入，會引起嚴重的急性中毒。呼氣中帶醚味，并出現(xiàn)嘔吐、出汗、噴嚏、咳嗽、頭痛、記憶力減退、無力、興奮。 微溶于水，易溶于鹽酸，能與醇、醚、石

3、油醚、苯、氯仿等有機溶劑混溶。應儲存于陰涼、干燥、通風的低溫庫房內(nèi)，庫溫最好控制在25以下。遠離熱源、火種，避免陽光直射。 本品易燃。與強氧化劑反應能起火爆炸。在空氣中與氧長期接觸或受光照會生成不穩(wěn)定的過氧化物，受熱能自行著火爆炸。著火時，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土滅火。用水滅火無效，但可用水保持火場容器冷卻。乙醇 無色有酒味，易揮發(fā)的澄清液體。沸點78.5：用于溶劑、清洗劑、分析試劑等。屬微毒類，對眼睛黏膜有輕微刺激作用。 乙醇可使皮膚發(fā)干，長期受大劑量作用時，可使神經(jīng)系統(tǒng)、消化器官等發(fā)生嚴重的器質(zhì)性疾病。 易燃，手熱或遇明火有燃燒爆炸危險，燃燒時，發(fā)出蘭色火焰。蒸氣能與空氣形成爆炸性混

4、合物，在火場中，受熱的容器有爆炸的危險。著火時，用二氧化碳、霧狀水、干粉、1211或抗泡沫滅火。用水冷卻火場中的容器，驅(qū)散蒸氣，趕出溢出液體，使其稀釋成為不燃性混合物冰醋酸 有酸性氣味的無色透明液體，沸點：118.1。用于制造氯乙烯塑料、醋酐、有機醋酸酯、醋酸鹽（鉛、鋁、銅等）及醋酸纖維；也可用于染料、制藥、罐頭食品、食品防腐、色素生產(chǎn)等工業(yè)。 屬低毒類，可經(jīng)消化道、呼吸道、皮膚吸收，對眼、皮膚和上呼吸道有刺激作用。眼睛接觸：引起眼瞼水腫、結膜充血；皮膚接觸：輕者出現(xiàn)紅斑，重者出現(xiàn)化學灼傷，有水泡和疼痛。 吸入：當空氣中蒸氣濃度不明時，應佩帶有黃色色標濾毒盒（罐）的防毒面具。使用時應有良好的通

5、風條件和有效的防護用品，如有醋酸的泄露或濺污，應以堿液中和，然后用水沖洗，經(jīng)稀釋的污水排入廢水系統(tǒng)。注 意 實驗過程中產(chǎn)生的廢氣、廢液、廢渣大多數(shù)是有害的，必須經(jīng)過處理才能排放。少量有毒氣體可以通過排風設備排出室外，被空氣稀釋。毒氣量大時，必須處理后再排出。如氧化氮、二氧化硫等酸性氣體用堿液吸收?？扇夹杂袡C廢液可于燃燒爐中通氧氣完全燃燒。 大家在實驗室里，接觸到的化學試劑多半都有危害性，所以每個人都應該注意保護自己，注意規(guī)范操作，同時對別人也是一種保護，而不能因為圖省事或者別的什么原因而放松對安全的注意。實驗誤差絕對誤差（absolute error）： 絕對誤差是測量值與真實值之差。 = x

6、 (：絕對誤差；x：測量值；：真實值） 絕對誤差是以測量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負值。測量值越接近真實值，絕對誤差越小。 真實值是一個可以接近而不可達到的理論值。上式可以寫成： = x- 說明在已知絕對誤差值的情況下，真實值可以從測定值減去絕對誤差而求得。相對誤差（relative error）： 為了反映誤差在測量結果中所占的比例，分析工作中經(jīng)常使用相對誤差。相對誤差是以真實值的大小為基礎表示的誤差值，沒有單位。 /=(x-)/ 通常以%， 或 ppm表示。 例如：測定純NaCl中Cl的百分含量為60.52%，而其真實含量（理論值）為60.66%。則絕對誤差=60.52%60.6

7、6% = -0.14% 相對誤差=（60.52% 60.66%） / 60.66% ×1000 = -2.3 如果不知道真實值，而知道絕對誤差值，則相對誤差也可以表示為： 相對誤差 = × 100% x 例如：用分析天平稱兩個重量，一個是0.0021g，另一個是0.5432g，兩個重量的絕對誤差都是0.0001g，可是相對誤差卻大不相同，一個是（1/21 ）×100%，另一個是（1/5432 ）×100%。 可見，由于兩個被測組分含量高低不同，即使絕對誤差相同，相對誤差也不同。對高含量組分測定的相對誤差應當要求小些，低含量組分測定的相對誤差要求允許大些。

8、 例如：用重量法和滴定法測量樣品主要成分，相對誤差需要達到千分之一，而用比色法測定樣品重微量成分時，相對誤差只要求達到百分之幾即可2. 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差（systematic error）也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向（正或負）和大小，重復測定時重復出現(xiàn)。根據(jù)系統(tǒng)誤差的來源，可分為： （1） 方法誤差 方法誤差是由于不適當?shù)膶嶒炘O計或所選方法不恰當所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點與化學計量點不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過大或有共沉淀等，都會產(chǎn)生誤差。 （2） 儀器或試劑誤差 是由于儀器未經(jīng)校準或試劑不合規(guī)格引起的。例 如：天平砝碼不準、容量儀器刻度

9、不準或試劑不純等，均能產(chǎn)生這種誤差。3） 操作誤差 操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者對滴定終點顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會產(chǎn)生誤差。 由于系統(tǒng)誤差是重復的以固定方向和大小出現(xiàn)，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測定次數(shù)的方法消除。3.隨機誤差（accidental error ): 也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測量條件、實驗室溫度、濕度等變動而未能得到控制的條件波動引起的，其大小和正負都不固定。 偶然誤差的出現(xiàn)看起來似乎沒有規(guī)律，但多次測量就會發(fā)現(xiàn)絕對值相同的正負偶然誤差出現(xiàn)的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過增加平行

10、測定次數(shù)，就可以減免測定結果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計學方法估計出偶然誤差值，并在測定結果中予以正確表達。 系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點的顏色變化時，有人總是偏深，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。但多次測定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。5.提高分析準確度的方法（1）選擇恰當?shù)姆治龇椒?不同方法的準確度和靈敏度不同。重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對常量組分的測定可以獲得比較準確的結果，一般相對誤差不超過千分之幾。但對于微量和痕量組分的分析，常常做不出來，談不上精確度。 儀器分析法對測定常量組分無法準確，但對測定微量和痕量組分靈敏度很高，盡管相對誤差較大，但絕對誤差不大，能符

11、合準確度的要求。 總之，必須根據(jù)分析對象，樣品情況以及對分析結果的要求，選擇恰當?shù)姆治龇椒?。?）減小測量誤差 為了保證分析結果的準確度，必須盡量減小各步的測量誤差。 例如：一般分析天平的稱量誤差為+0.0001g，用減重法稱量兩次，可能引起的最大誤差是+0.0002g，為了使稱量的相對誤差小于0.1%，取樣量就不能小于0.2g。 （3）消除測量中的系統(tǒng)誤差 A、校準儀器：對砝碼、滴定管和移液管進行校準。 B、做對照實驗：用含量已知的標準試樣或純物質(zhì)當樣品進行分析，由分析結果和其已知含量的差值，確定分析的誤差。 C、做空白實驗：在不加樣品的情況下，以與樣品相同的方法、步驟進行分析，把所得的結果

12、作為空白值從樣品分析結果中減去。這樣可以消除由于試劑不純或容器不符合要求所帶進的誤差。8.有效數(shù)字 有效數(shù)字是指分析工作中實際測到的數(shù)字，允許最后一個數(shù)字是可疑數(shù)，反映測量值的準確度，要與測量的方法相適應。 一般分析數(shù)據(jù)保留4位有效數(shù)字，保留的位數(shù)太多無實際意義，反而增加計算的麻煩。要注意0.0052的有效數(shù)字只有2位，3個0是用于定位的無效數(shù)字。 修約有效數(shù)字的原則是四舍六入五成雙。如23.455±0.546修約為23.46±0.55， 28.445±0.675修約為28.44±0.68，要避免出現(xiàn)0.00002±0.00001之類的數(shù)字，或

13、3658.2543±0.0058之類的數(shù)字。五、生物化學常用緩沖液（一）基本概念 Bronsted-Lowry酸堿理論（酸堿質(zhì)子理論）: 1923年由丹麥化學家J.N.Brnsted和英國化學家T.M.Lowry同時提出了酸堿質(zhì)子學說，認為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl-等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結合后，形成對應的酸，稱為該堿的共軛酸。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl- H+ HCl是酸，Cl-是它的共軛堿。 pH = pKa+l

14、og質(zhì)子受體/質(zhì)子供體 緩沖體系的設計： 1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的緩沖體系應具有以下特性： pKa值在6-8之間； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 鹽效應小； 離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??； 不與金屬離子生成復合物或沉淀； 該緩沖劑化學穩(wěn)定； 紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收??； 易制得高純度的鹽。（二）生物化學常用緩沖液 磷酸鹽緩沖液： 磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa

15、17.21， pKa212.32 配酸性緩沖液： 用NaH2PO4，pH1-4， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH6-8， 配堿性緩沖液： 用Na2HPO4，pH10-12。 用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因為SDS（十二烷基硫酸鈉）會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為： 容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的pH范圍寬； pH受溫度的影響?。?緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。其缺點為： 易與常見的鈣Ca+離子、鎂Mg+離子以及重金屬離子締合生成沉淀； 會

16、抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液： Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH7.5-8.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH5.0-9.0Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點是： 因為Tris的堿性較強，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液； 對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其

17、缺點是： 緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1； 溫度效應大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，例如：4時緩沖液的pH8.4，而37時的pH7.4，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0-4。 易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴密封。 此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 有機酸緩沖液： 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 有機酸緩沖液的缺點是： 所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物

18、，因而對生化反應過程可能發(fā)生干擾作用； 檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn+、Mg+等）結合而使緩沖液受到干擾； 這類緩沖液易與Ca+離子結合，所以樣品中有Ca+離子時，不能用這類緩沖液。 硼酸鹽緩沖液： 常用的有效pH范圍是：pH8.5-10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡合物，尤其是能與糖類的羥基反應生成穩(wěn)定的復合物而使緩沖液受到干擾。 氨基酸緩沖液： 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有： 甘氨酸-HCl緩沖液：pH=2.0-5.0， 甘氨酸-NaOH緩沖液：pH=8.0

19、-11.0， 甘氨酸-Tris緩沖液：pH=8.0-11.0，（廣泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.5-6.5， 此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。 其缺點是： 與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學反應過程，如代謝過程等。 試劑的價格較高。 六、 pH值的測定測定溶液pH值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。 廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。 精密pH試紙，可以較精確地測定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個pH單位，例如

20、有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等許多種，可根據(jù)待測溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。 測定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對照，估讀出所測pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。 紫外可見分光光度法一、基本原理（一）Beer-Lambert 定律 當一束單色光通過溶液時，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就會減弱。設入射光的強度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強度則減小。透射光強度與入射光強度的比值，稱為

21、透光度(transmittance)，以T表示。實驗證明，當液層厚度b和溶液濃度c按算術級數(shù)增加時，透光度T按幾何級數(shù)減小，數(shù)學式為： A-lgTabc A：吸光度，又稱光密度“O.D”；T：透光度， TI / I。； a：吸光系數(shù)（L·mol1·cm1）；比例常數(shù)，稱吸光系數(shù) b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，則b=1cm； c：樣品濃度（mol/L）。吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學表達式為：A=abc 吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性： 即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該

22、波長下吸光度的算術和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎。 若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2×103 M-1cm，計算其摩爾濃度。 L）。 AbC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1×10-5 mol / L吸收池使用注意事項： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在 1洗潔凈液中

23、浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。 嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。三、分光光度法的定性與定量方法（一）定性方法： 一系列不同波長的單色光照射待測溶液，可測的一系列相應的吸光度。以吸光度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖，可以得到待測物質(zhì)的吸收曲線。通過與標準品比較而定性。 （二）定量方法： 根據(jù)比爾定律，物質(zhì)在一定波長處的吸光度與濃度之間有線性關系。因此，只要選擇一定的波長測定溶液的吸光度，即

24、可求出濃度。1.吸光系數(shù)法（絕對法）： 根據(jù)比爾定律A= c l ，若 l 和吸光系數(shù)或E1%1cm已知，即可根據(jù)測得的A，求出被測物的濃度。 C = A / l 通常或E1%1cm可以在手冊或文獻中查到。 示例見課本P10.2.標準曲線法: 在有些情況下，如單色光不純等情況，測得的吸光值隨所用儀器不同而有相當大的變化。若此時用吸光系數(shù)換算成濃度，將產(chǎn)生很大的誤差。 但如果只用一臺固定的儀器，則可認定在固定的工作狀態(tài)和測定條件下，濃度與吸光度之間的關系在許多情況下是線性關系或接近于線性關系。 A=KC(K只為比例常數(shù)，而非物質(zhì)常數(shù)） 依據(jù)上式的關系進行定量是分光光度法中比較簡便易行的方法。標準

25、曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標準溶液。（2）在測定條件相同的情況下，分別測定其吸光度。（3）以標準溶液濃度為橫坐標（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應的吸光度為縱坐標，繪制A-C關系圖。（4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出濃度。離心機的使用1.使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。 2.離心前必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭各孔內(nèi)有無異物。 3.若

26、要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預冷。4.裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。5.離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常

27、工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。 6.每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。 7.離心時不準開蓋，不準用手停止轉(zhuǎn)頭。移液器的使用 設定移液體積從大體積調(diào)節(jié)到小體積時，為正常調(diào)節(jié)方法，逆時針旋轉(zhuǎn)刻度即可；從小體積調(diào)節(jié)至大體積時，可先順時針調(diào)至超過設定體積的刻度，再回調(diào)至設定體積，這樣可以保證最佳的精確度。 裝配移液器吸頭 單道移液器，將移液端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動，上緊即可用移液器反復撞擊吸頭來上緊的方法是不可取的，這樣操作會導致移液器

28、部件 因強烈撞擊而松散，嚴重的情況會導致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡住。 多道移液器，將移液器的第一道對準第一個吸頭，傾斜插入，前后稍許搖動上緊，吸頭插入后略超過O型環(huán)即可。 養(yǎng)護： 1、如液體不小心進入活塞室應及時清除污染物； 2、移液器使用完畢后，把移液器量程調(diào)至最大值，且將移液器垂直放置在移液器架上； 3、根據(jù)使用頻率所有的移液器應定期用肥皂水清洗或用 60 的異丙醇消毒，再用雙 蒸水清洗并晾干； 4、避免放在溫度較高處以防變形致漏液或不準； 5、發(fā)現(xiàn)問題及時找專業(yè)人員處理。 注意事項 1、當移液器吸嘴有液體時切勿將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞； 2、正確使用移液器吸液、排

29、液，以達高精準度。尤其注意排液的 2) 、 3) 操作； 3、平時檢查是否漏液的方法： 吸液后在液體中停 1-3 秒觀察吸頭內(nèi)液面是否下降；如果液面下降首先檢查吸頭是否有問題，如有問題更換吸頭，更換吸頭后液面仍下降說明活塞組件有問題，應找專業(yè)維修人員修理。 4、 需要高溫消毒的移液器應首先 查閱所使用的移液器是否適合高溫消毒后再行處理。酪蛋白的制備原理：等電點沉淀（選擇性沉淀）利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的性質(zhì)。注意： 調(diào)節(jié)溶液到蛋白質(zhì)等電點時，可以使蛋白質(zhì)溶解度最低，但是并不意味著蛋白質(zhì)會沉淀出來。40水浴預熱10分鐘（HAC緩沖液同時預熱）用滴管加入HAC緩沖液約2ml（pH 4.8）離

30、心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘1、布朗運動加速蛋白分子的碰撞2、等電點附近蛋白質(zhì)的溶解度最低用4ml蒸餾水洗滌離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘除去沉淀中的可溶部分95%乙醇洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘除去沉淀中的脂類物乙醚2ml洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘脫水0.1N NaOH 2ml溶解加水至10ml酪蛋白是酸性蛋白質(zhì)，溶解于堿性溶液中，方便下次雙縮脲法測定牛乳2ml40水浴預熱10分鐘（HAC緩沖液同時預熱）用滴管加入HAC緩沖液約2ml（pH4.8）離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘清液沉淀清液沉淀清液沉淀清液沉淀用4ml蒸餾水洗滌離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘95%乙醇洗滌離心，2

31、500轉(zhuǎn)/分，10分鐘乙醚2ml洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘0.1NNaOH2ml加水至10ml待測雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度一、實驗目的1.學習分光光度法測定的原理和方法2.學習蛋白質(zhì)含量測定的原理和方法3. 掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對物質(zhì)進行定性分析2主要方法： （1）比較吸收光譜曲線 （2）比較最大吸收波長蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm，核酸的最大吸收波長為260nm（3）比較吸光度的比值（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進行定量分析1原理Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KC

32、L其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強度；I為透射光強度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度2常用方法（1）標準曲線法§ 標準曲線與樣品的測定條件必須一致。（2）標準管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX，可求得CX。（3）摩爾吸光系數(shù)法C=A/e（e為L=1cm，C為1 mol/L時的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。3.樣品測試操作 打開電源開關，使儀器預熱20分鐘 用“波長設置”按鈕將波長設置在您將要使用的分析波長位置上 打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路 蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“

33、100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測試方式設置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A 將被測溶液拉入光路中，此時，顯示器上所顯示是被測樣品的吸光度參數(shù)實驗完成后，關閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。肝臟DNA的粗提取n 破碎細胞n 提取核蛋白n DNA核蛋白和RNA核蛋白分離n 蛋白和核酸分離原則n 低溫：抑制DNA酶的活性n 操作柔和：防止DNA斷鏈DNA分離純化的原理n DNA或DNP在0.14MNaCl鹽溶液中溶解度很低，而RNA則溶

34、于0.14MNaCl鹽溶液，利用這一性質(zhì)可將生物組織中的DNA與RNA分開n DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復合物的形式存在的，因此提取脫氧核糖核蛋白復合物-DNP后，必須將其中蛋白去除n 其中蛋白質(zhì)部分可用SDS使之變性除去（同時破壞核酸分解酶）。n 進一步純化則利用氯仿-異戊醇震蕩除蛋白，震蕩時，蛋白質(zhì)變性，形成凝膠，并與DNA分開，DNA則留在水層中。n 利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇將DNA 從溶液中沉淀出來。離心機的使用n 平衡n 對稱放入，蓋上蓋n 設定轉(zhuǎn)速、時間n 離心開始n 完全停止后開蓋實驗步驟n 1、取新鮮豬肝4g，用0.14mol/L NaCl 0.15mol/LEDT

35、A溶液洗去血液，剪碎。加入10ml 0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，置勻漿器中研磨。（初步破碎細胞）。（已做）n 2、取一支5mlEP管，裝入糊狀物（基本裝滿），離心5min（10000rpm），棄去上清液n 沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/l EDTA溶液洗三次。每次加入溶液后用吸管吹打均勻再離心（同上），直到上清液無血細胞。n 棄上清液，所得沉淀為DNP（DNA蛋白復合物）粗制品n 3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液5ml，分裝于2支10mlEP管，然后每管滴加25%SDS溶液0.5mL，邊

36、加邊振蕩。加畢，置60水浴20min （不停振蕩），直至溶液變得粘稠并略透明，取出冷卻至室溫。此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。 n 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液1mL，蝴蝶形振蕩5min。加入約1倍體積的氯仿異戊醇混合液，蝴蝶形振蕩10min，離心10min（4000rpm）。 n 此步驟后溶液分三個相：上層水相（DNA）；中層變性蛋白質(zhì)相；下層有機相和殘余的RNA。 n 5、吸出上清液，棄去沉淀。向上清液中緩慢加入1.52倍體積的95%乙醇，DNA沉淀析出，離心（4000rpm）10分鐘n 用玻棒攪出的絲狀物則為粗DNA血糖的測定原理 無蛋白血濾液 葡萄糖 堿性銅試劑 Cu(OH) 2

37、 磷鉬酸試劑 磷鉬酸 葡萄糖 Cu(OH)2 Cu2O Cu2O 磷鉬酸 鉬藍鉬藍的藍色深淺與葡萄糖的含量成正比,用比色法可測定血糖的含量 操作 ?臨床意義 （mg/dl） 正常懷疑糠尿病 空腹血糖110110-139140 餐后兩小時血糖140140-199200 服糖后兩小時糖140140-199200 1、 無蛋白血濾液的制備：取干試管一支，準確加入蒸餾水3.5ml，血液0.1ml，2/3NH2SO40.2ml，10Na2WO4 0.2ml，混勻，待有澄清液出現(xiàn)后，過濾，收集濾液備用編號標準管測定管空白管標準葡萄糖液（1.0ml = 0.025mg）2.0無蛋白濾液（ml）2.0蒸餾水（

38、ml）2.0堿性銅試劑（ml）2.02.02.0充分搖勻，置沸水浴準確煮沸8分鐘，取出切勿搖動，置于冷水浴冷卻磷鉬酸試劑（ml）2.02.02.0混勻，放置3分鐘蒸餾水（ml）3.03.03.0 將各試管搖勻后，用紅色濾光片或620nm，以空白管校零點，比色。課后思考題 Folin-吳法測定血糖的優(yōu)缺點是什么？ 進行比色法測定時，如果測得樣品的A值超過100%，該如何處理，為什么？質(zhì)粒DNA的提取實驗目的l 掌握：質(zhì)粒DNA提取的原理和方法；l 熟悉：堿裂法提取質(zhì)粒的基本操作步驟；l 了解：質(zhì)粒小抽提取試劑盒的組成和實驗 原理。 實驗原理l 在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細

39、菌染色體DNA變性，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然氫鍵也發(fā)生斷裂，但兩條互補鏈仍會緊密纏繞結合在一起。 l 將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，質(zhì)粒DNA迅速復性，仍然為可溶狀態(tài)。l 通過離心，可去除大部分細胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，分離上清，用兩倍體積乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。實驗步驟加5mL培養(yǎng)物于10 mL EP管，12000 r/min×2min 除去上清，加入100 µL 溶液I，中懸浮細菌沉淀，并轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中。 加入

40、200µL 溶液II，快速顛倒數(shù)次，冰浴2 min 加入150µL 溶液III，溫和振蕩10s，冰浴5min，12000 r/min×5min轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿 /異戊醇，溫和振蕩，抽提2次，12000r/min×2min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無水冰乙醇（-20 冰箱中放置），顛倒混勻，12000r/min´10 min  棄上清，沉淀中加1 mL70%乙醇，12000g×2min 去上清，沉淀物于37 恒溫箱中干燥至透明狀，后于 - 20 保存、待用。主要試劑及作用溶

41、液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護、緩沖) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（懸浮細胞） EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用（保護作用） Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性) SDS：？ NaOH（pH>12）：破壞細胞膜，裂解細胞溶液III：HAc和 KAc組成的高鹽溶液 (復性，分離) HAc溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復性。 KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中

42、的DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。實驗結果及討論 l 。 PCR技術聚合酶鏈式反應（PCR）概述（一）概念 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技術，是近年來發(fā)展起來的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。 二、PCR反應的原理和步驟PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，

43、以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 2、模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3、引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。 重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的片段富集106109倍。所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈

44、指數(shù)上升。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺期。PCR反應體系的主要成分和作用l DNA聚合酶l 模板l 引物l dNTPl 緩沖體系（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶來源于嗜熱水生菌的重組體，與一般的聚合酶所不同的是在高溫狀態(tài)仍具有活性。 可分為兩大類： 1、具有校正功能的（有35核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （無3 5核酸酶活性） 比如：一般的Taq

45、 DNA聚合酶（二）模板 核酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 （三）引物 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。*(六）PCR反應標準體系 五、PCR的反應條件控制（

46、一）PCR反應的溫度和時間控制 1、變性溫度與時間 變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。2、退火(復性)溫度與時間 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復性溫度=Tm值-(510) 在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復