包涵體純化全過程

1、一、 包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)（二）關(guān)于包涵體的純化是一個(gè)令人頭疼的問題， 包涵體的復(fù)性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸， 關(guān)于包 涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化，內(nèi)容比 較龐雜。一、菌體的裂解1、怎樣裂解細(xì)菌？細(xì)胞的破碎方法1. 高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3 體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處， 開動開關(guān)后， 逐步加速至所需速度。 此法適用于動物內(nèi)臟組織、 植物肉質(zhì)種子等。2. 玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì) 胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。3. 超

2、聲波處理法： 用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液， 使細(xì)胞急劇震蕩破裂， 此法多適用于 微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理 10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時(shí) 間以及超聲間歇時(shí)間、 超聲時(shí)間可以自己調(diào)整， 超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮， 如果不放心可 以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。4. 反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在 -20 度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩 余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5. 化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷

3、基磺酸鈉（SDS、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1 mg/ml 。無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞， 都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中， 使大分DFP可以抑制或減慢自溶作子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（ 用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性， 加入苯甲磺酰氟化 物（PMSF也能清除蛋白水解酶活力， 但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時(shí)多加幾次； 另外， 還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。這是標(biāo)準(zhǔn)配方 :裂解液： 50mM Tris-HCl（pH8.59.0

4、）, 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。（溶菌酶在這個(gè)pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用）但我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)是 :如果你裂解細(xì)菌是為了提取蛋白的話 , 而且蛋白的分子量又小于 20kd 的話,盡量減少溶菌酶的用量，會引入溶菌酶這種雜蛋白 一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一 點(diǎn)就夠 . 判斷裂解好壞的標(biāo)準(zhǔn)是 , 溶液很粘 .protocol是10ml-50ml緩沖液（菌體洗滌液,裂解液等）/1g濕菌體.如果只做一個(gè)鑒定 ， 我覺得 100-200ml 菌就夠了 .但凡超聲 ,我都用 60ml 裂解液 , 因?yàn)槲覀兊某晝x （現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

5、技術(shù)錄象里的那種 ）很適合用100ml小燒杯，裝60ml裂解液，這樣能讓超聲頭離液面不高不低 ，不會冒泡泡，也不 會灑出來 . 菌多我就延長超聲時(shí)間 .沉淀，也就是包涵體沉淀了 ，如果要上柱純化，一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱 ， 只是跑跑電泳 ， 可以直接用 8M 尿素溶解以后 ， 離心取上清 ， 加入適量體積的 loading buffer.loading buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的 ."取200微升菌液，離心后直接加上樣 buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE.這個(gè)方法 到底能不能溶解細(xì)菌中的包涵體 ? "而樓主的

6、問題 ， 雖然 loading buffer 對于包涵體的溶解能力是較弱的 ， 但是我覺得你的做法只是在鑒定有無表達(dá) , 用 loading buffer是沒有問題的2、表達(dá)重組蛋白時(shí)，細(xì)菌裂解方法都有哪些？在表達(dá)重組蛋白時(shí)，誘導(dǎo)以后跑SDS-PAG改現(xiàn)表達(dá)都很好，但是在裂解細(xì)胞時(shí)遇到問題?？偸遣荒軓氐琢呀饧?xì)胞。首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細(xì)菌沒有裂解。我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細(xì)胞破碎儀，功率400W超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時(shí)再重復(fù) 99次。菌體來自 200 ml 培養(yǎng)液，用 20 ml PBS 重懸。 然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度

7、100 ug/ml ， 4C 半小時(shí)菌液不變粘，加大濃度至 1 mg/ml，半小時(shí)后仍無明顯變化。 因?yàn)槲矣玫腜BS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer ， 1 mg/ml溶菌酶，4C半小時(shí)仍無明顯變粘。因?yàn)檫@次使用的溶菌酶是前一天配 好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。 同時(shí)希望能介紹一下如何選擇細(xì)胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。溶菌酶在pH7.4時(shí)是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果細(xì)胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因?yàn)?/p>

8、核酸被釋放出來。 而超聲破碎細(xì)胞，我覺得菌液是不會變粘的，因?yàn)槌暱梢园汛蠓肿雍怂岽蛩槌尚∑巍Ｎ遗袛嗉?xì)胞破碎不完全是因?yàn)?，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。 據(jù)此可以判斷細(xì)胞只是部分破碎。不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果還可以， 我覺得先用溶菌酶初步裂解細(xì)胞， 然后再用超聲進(jìn)一步破碎并斷裂 大分子核酸以降低粘度的細(xì)胞破碎策略可能比較好。 因?yàn)槌曈锌赡苁沟鞍鬃冃裕?但單用溶 菌酶不能確定是否完全破碎， 還要再加核酸酶降低粘度。 這種兩步法策略應(yīng)該還可以減少破 碎條

9、件優(yōu)化的時(shí)間。我用的溶菌酶放置時(shí)間比較長了， 有可能失活了。 我剛從生工又定了一支， 不過得后天到貨， 但愿它有用。如何觀察溶菌酶是否已裂解細(xì)胞，通過觀察粘度變化是否可以？ 只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細(xì)胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請務(wù)必保持PBS的pH> 8.0，同時(shí)溶菌酶的量一定要足！在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進(jìn)行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W工作2秒，間隔2秒，重復(fù)199次。菌體來自500 ml培養(yǎng)物，用30 ml PBS重懸， 超聲效率還是可以的。哪兒的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。 200m

10、l 菌液用 18 ml NaCl 重懸，加入 2 ml 25mMTris-HCI(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測 pH降低到5 -6，加20 ul 2MTris堿, 體系pH升到& 4C放置1小時(shí)，菌液上層變澄清，搖動發(fā)現(xiàn)體系沒有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時(shí)，還沒有變化，我簡直不知如何才好了。另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌酶處理1小時(shí)后超聲。條件：300W超5秒停5秒，重復(fù)99次。菌 液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲 400次，從外觀來看沒有太大區(qū)別。我簡直要說 tmd 了。 見鬼了。我的操作有什么地方不妥當(dāng)，請各位指正。溶菌酶的廠商要求是否很重要？ 我的誘導(dǎo)物

11、來自1 : 20過夜培養(yǎng)物接種，37C生長3小時(shí)后30C誘導(dǎo)2小時(shí)(0.8mM IPTG)。是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200 ml培養(yǎng)物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠稀？ 有人告訴我菌液應(yīng)該稀一些， 200 ml 用3040 ml 重懸。但實(shí)際操作也不夠理想。SDS-PAGE總是觀察到細(xì)胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。3、酵母的破碎酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱， 其成員分別屬于不同的真菌綱， 細(xì)胞壁成分是否會有較大差 別，這些都是做破碎酵母細(xì)胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法：1機(jī)械的方法：一般的 PROTOCC都是用glass b

12、eads :如sigma G-8772,加玻璃珠后超聲， 蛋白活性保持較好。2化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀(希望高手點(diǎn)評)3 尿素裂解液(尿素 8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0 )高壓勻漿。 (這個(gè)好象也該在方法 2中)4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認(rèn)為這種可能在小試中比較合適。5 溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質(zhì)體酶法裂解主要用兩種酶： 1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得； 2。 lyticase ，可以從 sigma 定購。這兩種酶解法都可以和上面的

13、幾種方法結(jié)合使用，尤其是glass beads 方法，效果很好。我用過化學(xué)裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀。此法的裂解效果 不錯(cuò)的，不妨試一下。篇文章是加尿素裂解液（尿素 8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L,2%SDS, PH值8.0 ),據(jù)說效果可以 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠， 就象 microbe 和 rongjunli 所說的那樣， 效率很高的，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應(yīng)該用這個(gè)方法。4、超聲破碎的條件選擇超聲破碎的條件不能一概而論， 要看你的實(shí)驗(yàn)要求， 有的是細(xì)菌

14、破碎， 有的是對組織細(xì)胞進(jìn) 行破碎， 要掌握好功率和每次超聲時(shí)間， 功率大時(shí)， 每次超聲時(shí)間可縮短， 不能讓溫度升高， 必要時(shí)在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。 至于每次超聲時(shí)是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問題， 這與你 超聲的量明顯有關(guān)。5、如何鑒定細(xì)菌超聲破碎的程度最簡單的方法：涂片 - 革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色 0.5 分鐘- 顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下6、細(xì)菌裂解的 DNaseI不同純度的酶換算標(biāo)準(zhǔn)不同， 所以你最好查查是哪個(gè)公司的酶？仔細(xì)看說明書， 可能會有換 算說明。另外看一下參考文獻(xiàn)所用的酶是哪個(gè)公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。我用過華美和 TAKARA勺DNA

15、酶，華美的是用 mg/ml。華美也有 RNasefree的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA勺兩種酶都是用活性單位定量的。我在超聲裂解細(xì)菌時(shí)加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取符合你需要的酶量。其實(shí)根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或 37度）。7、超聲裂解細(xì)菌是否完全？最簡單的方法：涂片 - 革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色 0.5 分鐘- 顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色二、包涵體的洗滌1、包涵體的洗滌問題通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M

16、,離心把沉淀和上清分別跑電泳， 如此類推可以一直稀釋到合適的濃度， 你可以找到一個(gè)合適去除雜質(zhì)的辦法， 其實(shí)這就 是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。包涵體一般難溶解， 所以你要注意未溶解的部分， 你可以跑電泳對比， 因?yàn)橛袝r(shí)候難溶解的就是你的目標(biāo)蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把目標(biāo)蛋白弄丟了。 此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點(diǎn)時(shí)間，也需要大量的溶劑。 如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。2、如何得到比較純的包涵體 對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。包涵體中主要含有重組蛋白，但也含有一些細(xì)菌成分，如一些外膜蛋白、質(zhì)粒D

17、NA和其它雜 質(zhì)。洗滌常用1河下的中性去垢劑，如 Tween Trit on、Lubel和NP40等加EDTA和還原劑 2-巰基蘇糖醇(DTT)、3 -巰基乙醇等反復(fù)多次進(jìn)行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強(qiáng)度升 高而加強(qiáng)，在洗滌包涵體時(shí)可加50 mM NaCL這樣提取的包涵體純度至少可達(dá)50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理?xiàng)l件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3 mM去垢劑如 Trit on X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿 素充分洗滌去除雜質(zhì)

18、，這一步很重要，因?yàn)榇竽c桿菌外膜蛋白OmpT(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性 ， 在包涵體的溶解和復(fù)性過程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。 對于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑， 易經(jīng)透析和超濾除去。 它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變 性作用，所需濃度尿素8-10M,鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時(shí)間較長或溫度較高時(shí)會裂解形成氰酸鹽， 對重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共 價(jià)修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白 質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。

19、鹽酸胍溶解能力達(dá) 95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾。但它也有成本 高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、 復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色 譜有干擾等缺點(diǎn)。包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層 析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯(cuò)，通常是一步就能達(dá)到純度為95%以上的包涵體。8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實(shí)驗(yàn)中遇到過 ; 開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題實(shí)驗(yàn)際溫度要 比設(shè)定溫度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不過我接著往下進(jìn)行 SDS-PAGE層析等

20、發(fā)現(xiàn)沒有什么不良影響。所以，你不用擔(dān)心也許你的蛋白也只是和你開了個(gè)玩笑呢！三、關(guān)于包涵體的溶解：1、請教GST包涵體溶解直接用8M的脲或6M胍融解，取上清，測濃度。直接稀釋后包被檢測相應(yīng)抗體。（由于快速稀釋相當(dāng)于復(fù)性過程，產(chǎn)物用于檢測沒有問題的）我所用的包涵體提取方法：1. PBS或生理鹽水洗滌誘導(dǎo)后菌體，Buffer A 重懸菌體，超聲波破碎至清亮2.4度，1 0 0 0 0 rpm離心10分鐘，棄上清3 .用PBS或生理鹽水洗滌沉淀2 3次4.往沉淀中加19.7ml Buffer A 及0.3 ml 2 0%的SKL（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置30分鐘至2小

21、時(shí)5.4度，1 0 0 0 0 rpm離心10分鐘，取上清6. 加20%PEG40002 1 0 ul至終濃度為0 .2%，加50 mM的氧化型谷胱甘肽4 2 0 ul至終濃度為1 mM加100mM的還原型谷胱甘肽4 2 0 ul至終濃度為2 mM靜置3 0分鐘至2小時(shí)（亦可4度復(fù)性過夜）7以PBS（ pH8.0）或TE（ pH8.0）透析，取出20度保存?zhèn)溆茫?Buffer A 配方：Tris-base 50mMEDTA 0.5mMNaCl 50mM甘油 5%DTT 5mM2、包涵體的溶解 十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時(shí)，可不可以互相代替？可以替換，調(diào) pH 不久沒什么區(qū)別了

22、嗎；兩者的功能團(tuán)相同，pH 不同，前者鈉鹽便于保存罷了3、有關(guān)包涵體的溶解問題強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCI 6M）,是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸 胍是較尿素強(qiáng)的變性劑， 它能使尿素不能溶解的包涵體溶解， 而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo) 致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長期保溫時(shí)。SDS正十六烷基三甲基銨氯化物、 SarkosyI 等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外， 對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)， 分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非

23、活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。 對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶， 有時(shí)還原劑的使用也是必要的， 可能 由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。4、 8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存？我在 4度放了半個(gè)月，目前沒出什么問題5、 8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題？BI 溶液在室溫放置 48小時(shí)，可能會對目的蛋白有影響，因?yàn)槟蛩卦趬A性條件下可使一些氨基酸?；?，因而早些處理 BI 溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。6、GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦?GST融合蛋白應(yīng)該不能用尿素等作用太強(qiáng)的變性劑，否

24、則GST融合蛋白是不能與 beads相結(jié)合的GST的Beads是應(yīng)用酶與底物結(jié)合的原理，所以要去除處理因素后才好結(jié)合，不知你的溫和 的去污劑是什么?做完裂解之后加 Trit onX 100輕搖3 0 min，蛋白溶解的會多些！四、包涵體的復(fù)性1 、包涵體如何復(fù)性包涵體的復(fù)性主要有兩種方式：1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑其中透析很適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但是時(shí)間長。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個(gè)以上的2硫鍵，很可能錯(cuò)誤形成配對，應(yīng)用還原劑。還有，復(fù)性的具體方法還要根據(jù)前期試驗(yàn)及篩選來確定！ 另外，你用多大體積的透析緩沖液?可能不夠，要更換幾次你家了多少蛋白呀 ?蛋白

25、量過大也會使復(fù)性困難。你用的透析代是否是新的，處理過沒有?新代有化學(xué)雜質(zhì)！ 最后，有些復(fù)性過程就是還有沉淀（透析方法的缺點(diǎn)）看看溶液中蛋白含量，說不定已經(jīng)夠 用了 包涵體的復(fù)性還要注意以下幾點(diǎn)：1. 首先要獲得較高純度的包涵體。2. 包涵體溶解要徹底，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。3. 透析前后均要離心4. 透析不能太快 .5. 純化的最佳條件要摸索。小技巧：1) 包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100.2) 包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性3) 復(fù)性液的組成很有講究，本人使用Oxidised Glutathione/ Reduced Glu

26、tathione 還加入一定的 L-Arginine-Hydrochloride 12-24h4) 復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析 12-24h5) 復(fù)性率的測定 據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定 (望有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友能更詳細(xì) 地講解)6) TritionX100 、SDS這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最后殘留量不能大于 0.5%吧，忘了。我用 Triton 洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng) 條件，再洗滌包涵體，有時(shí)可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4 條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很方便了。因?yàn)樯V柱的純化條件比較難 opt

27、imize 。這段文字可以參考：用Novagen公司pET System Manual提供的方法，分別進(jìn)行細(xì)菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細(xì)胞周質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)和包涵體中的分布。滲透休克 用1.2.3 方法誘導(dǎo)細(xì)菌( 10ml 體積)，測菌液 OD600， 10000 r/min 離心 0.5 min去上清，加入滲透休克溶液1 (V1 = OD600X V2/5 , V1為滲透休克溶液1, V2為培養(yǎng)新鮮菌液)， 冰浴10 min , 10000 r/min離心0.5 min，去上清。加 V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動冰浴 10 min ， 10000 r/min 離心0.5 min ，保

28、存上清、細(xì)菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀， 加1/10 體積1 00%TCA(w/v) ，渦漩 15 sec. ，冰浴 10 min，13000 r/min 離心 5 min , 100 ul 丙酮洗滌沉淀，干燥 1 h，力口 V1/2 體積 1X PBS ( pH 10) 溶解，-20 C保存，取10 ul加入等體積2 X SB進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系統(tǒng)照相。超聲波裂解細(xì)菌 滲透休克細(xì)菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20 mM Tris-HCI ( pH 7.5 , 0

29、C)重懸， 冰浴，超聲波裂解， 20%T作選擇，脈沖粉碎 1 min，然后13000 r/min 離心5 min , -20 C保 存上清、細(xì)菌沉淀。上清進(jìn)行 TCA沉淀，處理同上。沉淀用 Protein Extraction Reage nt( Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster.提供 )按 Novagen 公司 pET SystemManual提供方法反復(fù)處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100 X OD600/3 ul體積加1% SDS溶解，加等體積2 X SB,進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析，進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，計(jì)算融合蛋 白 Trx-

30、PrPC27-30 占細(xì)菌總蛋白的相對含量。1.2.7 重組融合蛋白的純化PrP-pET-32a (+)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 E.coli BL21(DE3), TB 培養(yǎng)基 中, 25C, AMP 200 ug/ml ,搖床(250 r /min)培養(yǎng)至OD60約為1.5，更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度 1 mM AMP200 ug/ml , 25 C, 4 h, 4000 g 離心收集菌體。按 Ni-NTA HiBi nd Purificati on Kit 使用說明溶解包涵體，純化融合蛋白。或使用筆者改進(jìn)方法，將 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說明

31、中 Buffer D 改成Wash-Buffer ，Buffer-E 改成 Elute-Buffer ，最后用 Buffer-E 重生 Ni-NTA HiBind RasinBinding- Buffer 平衡以后加 50%酒精保存，以免長菌。洗脫所得蛋白用 TCA 沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30 ，凍干保存。然后 12%SDS-PAG瞬膠電泳分析。3、包涵體復(fù)性 2精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對人可能不好。 另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。 對于疏水蛋白的可溶表達(dá)，可以降低誘導(dǎo)溫度（可以試試4度誘導(dǎo)過夜）和 IPTG 的量

32、，降低蛋白的表達(dá)速度，從而減少包涵體形成的速度， 增加正確折疊蛋白的量。或者換成GST融合 表達(dá)載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達(dá)。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復(fù) 性過程中， 在透析液中加入了 1%的甘氨酸和 5%的甘油， 有一定的助溶效果。 我想對于你的情 況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復(fù)性是一個(gè) 很難捉摸的過程，不同蛋白的復(fù)性條件也各不相同。5、包涵體復(fù)性問題包含體復(fù)性三大原則：1。低濃度2。平緩梯度3。低溫有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。 此外，透析的鹽濃度（比如 ura ）要平緩降低： 8m-6m-4m

33、-2m-pbs-H2O。6、包涵體復(fù)性形成聚集物 關(guān)鍵是蛋白在復(fù)性過程中凝聚了以后，調(diào)節(jié) PH 可以使其溶解，但是這樣復(fù)性好的蛋白有沒 有活性還是問題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！7、復(fù)性中蛋白析出！出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分，每隔1個(gè)PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時(shí)必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。若加變性劑尿素可加到 2M鹽酸胍可加到1-1.5M ;另外可將甘油濃度增加，范圍可在w30%且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。8、包涵體復(fù)

34、性液配方對于包涵體復(fù)性，一般在尿素濃度 4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到 2M左右時(shí)結(jié)束。對于鹽酸胍 而言，可以從4M開始，到1.5M時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒有明確的規(guī) 定， 這些需要你在實(shí)驗(yàn)過程中不斷試驗(yàn)， 確定合適的緩沖系統(tǒng)； 不過復(fù)性過程主要是注意以 下幾個(gè)問題：1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；2）溫度適宜選擇4 C;3） 復(fù)性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL ；4）復(fù)性時(shí)間一般為 24-36 小時(shí)；5）低分子化合物 如 L-Arg 有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止

35、蛋白聚集；Tris 對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解；6）氧化還原體系，女口 GSH/GSSG DTT/GSSG DTE/GSS（等.。還有就是你的蛋白質(zhì)的特性9、什么叫復(fù)性成功復(fù)性效果的檢測：根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要， 可以從生化、 免疫、 物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行 檢測。1，凝膠電泳： 一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)， 或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。2, 光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD等，利用兩種狀態(tài)下 的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過

36、程檢測。3, 色譜方法：如IEX、RP-HPLC CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，4, 生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定,較好的反映了復(fù)性蛋白的活性, 值得注意的是, 不同的測活方法測得的結(jié)果不同, 而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。5, 黏度和濁度測 a 定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加,變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露,一般水 溶性很差,大多形成可見的沉淀析出。6, 免疫學(xué)方法：如 ELISA、WESTER等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映 了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。在正常的生理?xiàng)l件下, 組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨(dú)特的方式進(jìn)行折疊, 形成自己特有的空 間結(jié)構(gòu), 以執(zhí)行

37、某一些生命活動。 當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí), 可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變, 錯(cuò)誤剪接和運(yùn)輸, 錯(cuò)誤折疊和異常聚積, 形成對機(jī)體有害的反應(yīng), 引起構(gòu)象病的發(fā)生和無生 物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復(fù)性過程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚, 許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的,且沒有普遍性, 但從這許聚集具有相許多多的個(gè)例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律： 如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導(dǎo)、 對特異性、 折疊中間體可能具有不同的作用等等， 并利用這些知識建立了一些重組蛋白質(zhì)高 效復(fù)興性的方法。 相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、 生物信息學(xué)、 蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備 的發(fā)展和完善，在

38、不久的將來，預(yù)測和設(shè)計(jì)最佳復(fù)性方案將成為可能。10、怎樣鑒定融合蛋白復(fù)性是否成功問：最近在做GST融合蛋白的純化，由于目的蛋白主要存在于包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經(jīng)復(fù)性，透析后用GSHsepharose 4B純化，結(jié)果得到了比較純的融合蛋白，這是否說明GST的活性已得到恢復(fù)（因?yàn)槟芘cGSH結(jié)合），請問這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢復(fù)？由于我的目的蛋白只是一個(gè)蛋白的某一段，不具有酶活 性，也不是什么受體之類的，所以不知如何鑒定它的活性。如果我得到的是變性的融合蛋白，那么用于制備多抗或者單抗會有影響嗎？如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用 GSH sepharose

39、 4B 純化得到的融合蛋白可以直接用 于制備多抗嗎？溶液中的 GSH， Tis 等成分對免疫動物有影響嗎？是否需要透析除取這些成 分才能去免疫動物呢？答：1）。不可以。GST具體多大忘記了，但做為 TAG使用的蛋白一般是很小的一段AA可以用相對應(yīng)的抗體做 PULLDOWN親和純化等。但蛋白的活性是需要構(gòu)象存在的，一小段TAG空間結(jié)構(gòu)幾乎沒有，就算是沒有恢復(fù)活性的蛋白也可以與這小段AA 對應(yīng)的抗體結(jié)合。2）。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來免疫動物具有更強(qiáng)的抗原性。 只是天然蛋白 中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會暴露出來， 如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是 可以的，如果用來檢測天然蛋

40、白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單 抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。3) 。免疫動物要求抗原體種盡量小。 在這種小體積的情況下， 緩沖液里的小分子成分只要沒 毒影響就不大，可以不用考慮。4) GST為26kd，你得到的蛋白活性應(yīng)通過目的蛋白功能分析才能驗(yàn)證是否復(fù)性。GST融合蛋白可以免疫動物，但抗體純化須用GSH-sepharose 4B和蛋白A或G進(jìn)一步純化，去掉抗GST抗體，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去GST,再免疫動物.GSH,Tris 是小 分子，沒影響。5) 既然目的蛋白沒有活性，何來得活性鑒定，復(fù)性是否成

41、功，就主要是看是否恢復(fù)到原來特有的三級結(jié)構(gòu)， 這就要看你目的蛋白的特異性， 和天然的目的蛋白片斷進(jìn)行比較， 看其復(fù) 性是否徹底， 這必須有個(gè)對照， 才能知道復(fù)性是否完全。 不知道你得到目的蛋白有什么用處， 如果是用來做抗原，就沒有必要進(jìn)行活性鑒定了。變性的融合蛋白做抗原是沒有影響的，gst的分子量是26kda，當(dāng)然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會要更好一些，如果不除，影響也不會很大。最好進(jìn)行透析，除去溶液中的雜物質(zhì)，但是Tris沒有什么關(guān)系，其就如同PBS樣，本身是緩沖體系，不會對免疫造成太大影響。6) 做抗原的話，變性了沒關(guān)系的；純化后可以直接免疫動物，我們這就有人做，不過他是 用的Hi

42、s融合表達(dá)；掛著 GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強(qiáng)些另外，你看沒看過菌液上清里的蛋白量？那里可能有許多的有活性的蛋白呀五、包涵體的純化 復(fù)性以后的蛋白質(zhì)的純化策略與可溶性蛋白質(zhì)相似，這里不再贅述。 （注：當(dāng)然也可以先純化然后再復(fù)性一般多采用凝膠柱，或者純化與復(fù)性同步進(jìn)行比如柱上復(fù)性。 ）六、綜述以及其他1、蛋白復(fù)性和純化在線資料1. 包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性 2. 重組蛋白純化方法組織細(xì)胞的破碎 目標(biāo)蛋白的粗提 蛋白質(zhì)沉淀方法 色譜分離 2、綜述蛋白的復(fù)性是一個(gè)世界性的難題，沒有通用的方法，甚至沒有靠得住的規(guī)律，只能試?？梢詤⒖家韵挛恼隆Ｔ撐某鎏幰呀?jīng)忘了，如果有人知道原創(chuàng)作者或網(wǎng)

43、上出處，請補(bǔ)充。包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性包涵體： 包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。包涵體的組成與特性： 一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpGompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒 DNA以及脂體、脂多糖等，大小為 0.5-1um,難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體的形成：主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子,或環(huán)境不適, 無法形成正確的次級鍵等原因形成的。1 、表達(dá)量過高,研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體,表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原 因可能是合成速度太快, 以至于沒有

44、足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊, 二硫鍵不能正確的配對, 過多的 蛋白間的非特異性結(jié)合,蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體,而脯氨酸的含量明顯 與包涵體的形成呈正相關(guān)。3、 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白,由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類,致使中間 體大量積累, 容易形成包涵體沉淀。 因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的 比例。包涵體表達(dá)的有利因素：1、可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊,包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。2、降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃

45、度，有利于表達(dá)量的提高。3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于 分離純化。4、對機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。破菌：1、機(jī)械破碎2、超聲破碎3、化學(xué)方法破碎分離：1、離心： 5000-20000g15min 離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。2、過濾或萃取方法：洗滌：由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起， 在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右，1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑 TritonX-100 洗滌去除膜碎片和膜蛋白

46、。溶解：常用的變性劑有尿素(8M、鹽酸胍(GdnHCI6-8M),通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋GdnSCN 最強(qiáng)。白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍(去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。極端pH:可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHC中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0 ，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過

47、pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時(shí)一般室溫過夜，但鹽酸胍在 37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在， 在增溶時(shí)一般使用還原劑。 還原劑的使用濃度一般是 50-100mM2-BME或DTT也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。 還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影 響， 如牛生長激素包涵體的增溶。 對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶， 有時(shí)還原劑 的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。復(fù)性：通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常

48、的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到 2M左右時(shí)結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從 4M開始，到1.5M時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。復(fù)性中常采用的方法有： 稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快， 不易控制。透析復(fù)性： 好處是不增加體積， 通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度， 有人稱易 形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品 量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用

49、的一種復(fù)性方法，如華北制藥的 G-CSF 復(fù)性據(jù)說是通過柱上復(fù)性進(jìn)行的。常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC 等。還原劑的去除：還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除， 使二硫鍵慢慢形成。 但是由于二硫鍵的形 成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的， 可以考慮在變性劑完全去除之后， 在去除還原劑使已經(jīng) 按照正確的結(jié)構(gòu)相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。常用的氧化方法有： 空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不 易控制氧化還原電勢。氧化還原電對( redox )：常采用 GSSG/GS，H 通過調(diào)整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如B

50、ME DTT的增溶液中直接加入GSSG如：5mMGSSG/2mMDTT=GSH/GSSG(1.33/1)。復(fù)性的效率：復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程， 除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外， 還很大程度上與蛋白質(zhì)本 身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到 95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11 ，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。復(fù)性過程的添

51、加劑：1、共溶劑：女口 PEG6000-20000,據(jù)說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團(tuán)，此外由于阻 止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機(jī)會， 也可能對復(fù)性效率的提高起作用。 一般的使用濃度在 0.1%左右，具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定。2、 二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）： PDI可以使錯(cuò)配的二硫鍵打開并重新組合， 從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)， 此外在復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較 高能量， 常常是復(fù)性過程中的限速步驟， 而 PPI 的作用是促進(jìn)兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變， 從而促進(jìn) 復(fù)性的進(jìn)行。3、 分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP,是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無法自己正確的折疊。 有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達(dá)的 菌株，據(jù)說效果不錯(cuò)。不過在生產(chǎn)中還沒有看到2和3的應(yīng)用的例子。4、0.4-0.6ML-Arg ：成功的應(yīng)用于很多蛋白如 t-PA 的復(fù)性中，