分子生物學(xué)大題

1、分子生物學(xué)大題一、原核生物和真核生物基因組各自的特點：原核生物基因組： 1.基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成； 2.結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控序列以操縱子的形式組織在一起； 3.基因組中重復(fù)序列很少； 4.結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝； 5.基因是連續(xù)的； 6.編碼序列一般不會重疊； 7.編碼區(qū)在基因組中所占的比例遠遠大于真核基因組而小于病毒基因組； 8.細菌基因組中存在可移動DNA序列。 真核生物基因組： 1.DNA為雙鏈線狀且往往不是一條； 2結(jié)構(gòu)基因為.斷裂基因，并受一系列順式作用元件調(diào)控； 3.結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子； 4.非編碼序列遠多于編碼區(qū)； 5.含有大量重復(fù)序列和基因家族； 6.DNA末

2、端具有端粒結(jié)構(gòu)； 7.還包括細胞器基因組。2、 核酸分子雜交技術(shù)1. Southern印跡（檢測DNA）首先通過限制性核酸內(nèi)切酶降解樣品中DNA，再經(jīng)凝膠電泳分離，將分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜等上并固定，再用標記過的探針進行雜交，以檢測目的DNA。2.Northern 印跡（檢測RNA）應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小。其方法類似于Southern印跡雜交。3.Western 印跡（檢測蛋白質(zhì)）將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)

3、鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。3、 PCR擴增技術(shù)1.基本原理：DNA的半保留復(fù)制。2. 反應(yīng)體系的基本成分：（1）模板：包括DNA和RNA。（2）特異性引物：是一段與模板DNA鏈互補的寡核苷酸片段。（3）熱穩(wěn)定的DNA聚合酶：耐熱的Taq DNA聚合酶。（4）dNTP：包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。（5）二價陽離子：常用MgCl，調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性，影響引物退火、PCR的特性。（6）緩沖液：一般使用Tris-Cl，調(diào)節(jié)pH值，使反應(yīng)體系偏堿性；（7）一價陽離子：一般為KCl，促進引物退火，高濃度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性。3. 基本操作：（1）變性 將待擴增的模板DNA加熱到9

4、4，使雙鏈DNA解鏈為單鏈。（2）退火 將溫度下降至55左右，引物與變性的模板DNA利用堿基互補配對結(jié)合。（3）延伸 在72下，DNA聚合酶在合適的緩沖溶液中，以dNTP為底物，嚴格按照模板鏈堿基序列合成互補鏈，即從引物的3-OH進行循環(huán)，合成方向為5-3。以上三步驟為一次循環(huán)，每循環(huán)一次，DNA分子按指數(shù)增加，經(jīng)多次循環(huán)后即可達到大量擴增DNA片段的目的。4.PCR應(yīng)用：用于目的基因的直接克??；將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相偶聯(lián)（RT-PCR），構(gòu)建cDNA文庫；制作DNA探針，進行分子檢測等；用于基因表達與調(diào)控研究，如mRNA檢測；DNA的多態(tài)性分析，如通過限制性片段長度多態(tài)性來揭示DNA堿基序列的差

5、異； 臨床上進行遺傳及傳染性疾病的基因診斷；在制藥工業(yè)中篩選抗腫瘤的抗生素。四、基因敲除技術(shù) 1.基因敲除的一般原理：（1）理論基礎(chǔ)：同源重組，發(fā)生在兩條雙鏈DNA的同源序列之間，涉及的是大片段同源DNA序列的交換。（2）技術(shù)基礎(chǔ)：胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)技術(shù)。2.基因敲除的策略：（1） 基因敲除載體構(gòu)建特點：具有與ES細胞中目標基因同源的DNA序列；帶有選擇性標記基因，便于后續(xù)的篩選和富集。 （2） 基因敲除載體導(dǎo)入ES細胞基因敲除載體導(dǎo)入ES細胞的方法：顯微注射法、電穿孔法、精子載體法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。（3） 篩選與鑒定基因敲除載體轉(zhuǎn)染ES細胞后，大部分細胞中并沒有整合入外源基

6、因，或是發(fā)生了隨機整合，因此從眾多的ES細胞中篩選和鑒定出發(fā)生了同源重組的ES細胞是基因敲除的重要步驟。常用的篩選方法有兩類：遺傳篩選法，包括正負篩選法（PNS法）和正向篩選法；物理篩選法，主要是PCR篩選方法。（4） 基因敲除動物產(chǎn)生ES細胞經(jīng)體外遺傳修飾之后重新引入動物胚胎，可以發(fā)育產(chǎn)生嵌合體或完全ES細胞來源的動物。獲得基因敲除純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中，所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。 五、正負篩選法和正向篩選法1.正負篩選法：定義：PNS采用置換型載體，該載體含有正（neo基因，插入載體的同源序列）和負（HSV-tk基因

7、，置于同源序列的外側(cè)）選擇基因各一個；同源重組時，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失。而在隨機整合時，所有的序列均保留。胸苷激酶蛋白（tk）可使無毒性的更昔洛韋轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账岫鴼⑺兰毎蚨捎酶袈屙f篩選排除隨機整合的細胞株。在同源重組時，細胞對G418和更昔洛韋都有抗性，隨機整合時只對G418有抗性，而對更昔洛韋敏感，細胞將被殺死。未進行任何方式整合的細胞則被G418殺死。用G418作正篩選，可得到含有neo基因的細胞株，然后再用更昔洛韋做負篩選，淘汰含有tk基因的細胞株，就可以得到不含tk基因的同源重組細胞株。 PNS法適用于任何基因

8、的定向敲除。但除了產(chǎn)生同源重組外還可能發(fā)生隨機整合。2.正向篩選法定義：僅攜帶正選擇性標記一種標記基因，而且選擇性標記基因缺乏自身的某個表達調(diào)控序列。載體轉(zhuǎn)染ES細胞后，如果能發(fā)生同源重組，或隨機整合入細胞基因組內(nèi)并在整合位點附近恰巧存在相應(yīng)的表達調(diào)控序列，那么殘缺的選擇性標記基因就能利用基因組上的表達調(diào)控序列得到表達；相反的，選擇性標記基因無法得到表達。通過選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)，表達了選擇性標記基因的ES細胞就可以被篩選出來。正向篩選法可分為無啟動子篩選法、無增強子篩選法和無polyA篩選法。 只適用于在ES細胞中能較好表達的基因。六、基因芯片技術(shù)1.基本原理：基因芯片又稱 DNA 芯片，其基

9、本原理是將大量（通常每平方厘米點陣密度高于 400 ）探針分子（寡核苷酸分子）固定于支持物上，然后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。2.主要步驟：（1）芯片制備：以玻璃片或硅膠片為載體，采用原位合成和微距陣的方法，將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。（2）樣品制備：生物樣品一般不能直接與芯片反應(yīng)，須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA和RNA，然后熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。（3）雜交反應(yīng)：樣品與DNA芯片上的探針陣列進行雜交。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀態(tài)中，降低錯配率。

10、（4）信號檢測和結(jié)果分析：雜交反應(yīng)后的芯片上各個反應(yīng)點的熒光位置、熒光強弱，經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)的生物信息。七、siRNA藥物1.定義：小干擾RNA（siRNA）是一個長21到25個核苷酸的雙股RNA，可以阻斷異常蛋白的產(chǎn)生。2.作用機制：siRNA作用機制涉及RNA干擾，RNA干擾是由同源雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標基因沉寂，阻斷基因活性的現(xiàn)象。3.作用特點：siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)

11、生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。 4.siRNA設(shè)計應(yīng)注意：物種特異性靶標一般在CDS區(qū)siRNA的轉(zhuǎn)染效率5.反義藥物與傳統(tǒng)藥物的性質(zhì)和作用對象明顯不同，表現(xiàn)為: （1）新的化學(xué)物質(zhì)-核酸；（2）新的藥物受體-mRNA，DNA；（3）新的受體結(jié)合方式-Watson-Crick雜交；（4）新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)-如RNase H介導(dǎo)的靶RNA的降解。 6.反義藥物與傳統(tǒng)藥物相比具有以下優(yōu)點： (1)特異性較強; (2)信息量較大;(3)反義藥物以核酸為靶點，與蛋白質(zhì)作為靶點比較，更易合理設(shè)計新藥物;(4)比傳統(tǒng)藥物更具選擇性及效率，副作用可能更

12、少。7.RNA干擾的作用特點（1）具有高度特異性；（2）具有高效性；（3）受多基因控制；（4）需siRNA介導(dǎo)：RNAi作用的靶向精確定位是依賴于siRNA與目的基因mRNA的堿基互補配對來實現(xiàn)的；（5）對靶基因位點的選擇性；（6）放大效應(yīng)。八、雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）雙向凝膠電泳：利用蛋白質(zhì)的等電點與分子量差異分離蛋白質(zhì)。第一向：等電聚焦 IEF，利用蛋白質(zhì)等電點的不同，在pH梯度膠內(nèi)進行第一次分離。第二向：SDS-PAGE，沿著第一向垂直的方向通過蛋白質(zhì)分子量的大小進行第二次分離，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物在二維平面上分離開來。優(yōu)點：是目前常用的唯一能夠在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，是目

13、前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為有效的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。缺點：難以有效分離極酸、極堿性蛋白質(zhì)，極大、極小蛋白質(zhì)，及低豐度蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難以與質(zhì)譜實現(xiàn)自動化聯(lián)用。九、酵母雙雜交系統(tǒng)基本概念：是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段。它利用酵母細胞內(nèi)的真核表達系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個功能結(jié)構(gòu)域融合，通過質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細胞，以酵母細胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標志。典型的真核轉(zhuǎn)錄因子都含有二個結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）。二個結(jié)構(gòu)域功能上相互獨立又互相依賴，只有結(jié)合才具完整活性。將DBcDNA片段和ADcDNA片

14、段分別與待測的X和Y蛋白cDNA片段（即Xc和Yc）結(jié)合，并分別構(gòu)建在2個表達載體中，導(dǎo)入酵母細胞中共表達。由DB和蛋白X形成的融合蛋白稱為誘餌，由AD和蛋白Y形成的融合蛋白稱為獵物或靶蛋白，被激活的、能顯示蛋白X和蛋白Y之間相互作用的基因稱為報告基因。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，可鑒定作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。十、外源基因表達基本類型1.根據(jù)宿主細胞不同：原核細胞表達系統(tǒng)、真核細胞表達系統(tǒng)。2.根據(jù)表達產(chǎn)物在宿主細胞生成的部位不同：胞內(nèi)表達、定位表達、分泌表達。3.根據(jù)表達產(chǎn)物的溶解狀況不同：可溶性表達、包涵體表達。4.根據(jù)表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)狀況不同：非融合表達、

15、融合表達。十一、外源基因表達（基因工程）的基本過程口訣：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表。（1）分離：提取和獲得目的基因和載體DNA；（2）切割：分別對目的基因和載體DNA酶切；（3）連接：用DNA連接酶連接目的基因與載體，形成新的重組DNA分子；（4）轉(zhuǎn)化：用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體（宿主）細胞；（5）篩選：重組體在受體細胞中復(fù)制和遺傳；對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（6）表達：對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。十二、外源基因?qū)氲姆椒?. 氯化鈣轉(zhuǎn)化法：將氯化鈣，RNA(或DNA) 混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的鈣顆粒。大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感

16、受態(tài)細菌，當加入重組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入42作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進入細菌；又稱為熱休克法。2. 電穿孔法：用高電壓脈沖短暫作用也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔轉(zhuǎn)化法。3.顯微注射法：是在顯微鏡直視下，向細胞核內(nèi)直接注射外源基因。4.陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達。5.病毒感染法:病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是通過感染方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體,將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞，這種病毒稱為病毒運載體。補充：一、SNP1.檢測SNP的常用技術(shù) 電泳 酶切 序列分析 DNA芯片 PCR 生

17、物信息學(xué) 2.單核苷酸多態(tài)性的特征： SNP是人類基因組DNA序列中最常見和最普遍的一種多態(tài)性。由單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等變異引起。 1）是人類可遺傳變異中最常見的一種，發(fā)生頻率至少大于1% 2）數(shù)量多、分布廣，在人類基因中廣泛存在。 3）具有遺傳穩(wěn)定性 4）具有二態(tài)性 5）可以建立單體型模型 6）部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或基因表達水平。二、克隆載體必須具備的基本條件： 有自身的復(fù)制子，能獨立復(fù)制，目的基因插入不影響載體復(fù)制能力； 必須具備合適的酶切位點，最好含有多種限制酶的單一切點，多個限制酶的酶切位點也稱多克隆位點（MCS），在切點內(nèi)可以與外源DNA進

18、行連接重組； 應(yīng)具有遺傳表型或篩選標記，如對抗生素的抗性，噬菌斑的形成等； 載體分子量較小，可以攜帶足夠長的外源DNA；5. 載體DNA中均有一段不影響其復(fù)制和生長的非必需區(qū)，將外源基因插入該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。三、DNA限制性內(nèi)切酶具有的共同特性：1）只降解雙鏈DNA分子，不水解單鏈DNA或RNA2）每種酶有其特定的核苷酸序列識別位點 3）酶的活性需要二價離子鎂來激活四、宿主細胞通常要滿足下列條件：宿主細胞必須無限制性內(nèi)切酶 ；宿主細胞應(yīng)無重組能力，應(yīng)為DNA重組缺陷型株；易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，為感受態(tài)細胞； 遺傳穩(wěn)定性好目的基因功能缺陷，便于篩選； 符合安全標準，不具有感染寄生性。蛋白水解酶基因缺陷或其表達低，降低對外源蛋白的降解。 五、目的基因制備技術(shù)：化學(xué)合成法 獲得已知基因 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)基因組文庫cDNA文庫 獲得未知基因六、基因表達系列分析（SAGE）定義：是通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐富度不同的SAGE標簽序列，從而比較完整地獲得基因組的表達信息。SAGE能夠快速、全范圍提取生物體