內標法與外標法.

1、內標法與外標法內標法什么叫內標法 ? 怎樣選擇內標物 ?內標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時 , 加入 一種內標物質以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結果產(chǎn)生的影響 , 以提高 分析結果的準確度。內標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術。使用內標法時 ,在樣品 中加 入一定量的標準物質 , 它可被色譜拄所分離 , 又不受試樣中其它組分峰的干 擾, 只要 測定內標物和待測組分的峰面積與相對響應值 , 即可求出待測組分在樣 品中的百分 含量。 采用內標法定量時 , 內標物的選擇是一項十分重要的工作。 理 想地說, 內標 物應當是一個能得到純樣的己知化合物 , 這樣它

2、能以準確、 已知的 量加到樣品中去 它應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化 學性質 （如化學結 構、 極性、 揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 、 色譜行為和響應特 征, 最好是被分析 物質的一個同系物。 當然, 在色譜分析條什下 , 內標物必須能 與樣品中各組分充分 分離。 需要指出的是 , 在少數(shù)情況下 , 分析人員可能比較關 心化臺物在一個復雜過 程中所得到的回收率 , 此時, 他可以使用一種在這種過程 中很容易被完全回收的化 臺物作內標 , 來測定感興趣化合物的百分回收率 , 而不 必遵循以上所說的選擇原 則。在使用內標法定量時 ,有哪些因素會影響內標和被測組分的峰高或峰面積

3、 的比 值 ?影響內標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方 面 的和儀器方面的三類。由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復樣品時出現(xiàn)。 化學方 面的因素包括 :1、內標物在樣品里混合不好 ;2、內標物和樣品組分之間發(fā)生反應 ,3、內標物純度可變等。對于一個比較成熟的方法來說 ,色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些 , 色譜上 常見的一些問題 （如滲漏 對絕對面積的影響比較大 , 對面積比的影響則要 小一些, 但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度 , 那么 一定有某個 重要的色譜問題存在 , 比如進樣量改變太大 , 樣品組分濃度和內標濃 度之間有很

4、大 的差別, 檢測器非線性等。 進樣量應足夠小并保持不變 , 這樣才不 致于造成檢測器 和積分裝置飽和。 如果認為方法比較可靠 , 而色譜固看來也是正 常的話, 應著重檢 查積分裝置和設置、 斜率和峰寬定位。 對積分裝置發(fā)生懷疑的 最有力的證據(jù)是 : 面積比可變 ,而峰高比保持相對恒定 ,在制作內標標準曲線時應注意什么 ?在用內標法做色話定量分析時 ,先配制一定重量比的被測組分和內標樣品 的混 合物做色譜分析 , 測量峰面積 , 做重量比和面積比的關系曲線 , 此曲線即為 標準曲 線。 在實際樣品分析時所采用的色譜條件應盡可能與制作標準曲線時所用 的條件 一致, 因此, 在制作標準曲線時 ,

5、不僅要注明色譜條件 （如固定相、 柱溫、 載氣流速 等 ,還應注明進樣體積和內標物濃度。在制作內標標準曲線時 ,各點 并不完全落在直 線上 ,此時應求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏 差,在使用過程中應定 期進行單點校正 ,若所得值與平均值的偏差小于 2,曲線 仍可使用 ,若大于 2,則應重作 曲線 ,如果曲線在鉸短時期內即產(chǎn)生變動 ,則不 宜使用內標法定量。二、外標法用待測組分的純品作對照物質 , 以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相 比 較進行定量的方法稱為外標法。 此法可分為工作曲線法及外標一點法等。 工作 曲 線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線 , 求出斜

6、率、 截 距。 在完全相同的條件下 , 準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液 , 根據(jù)待 測組分 的信號, 從標準曲線上查出其濃度 , 或用回歸方程計算 , 工作曲線法也可 以用外標二 點法代替。 通常截距應為零 , 若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。 工作曲 線的截距為 零時 ,可用外標一點法 (直接比較法 定量。外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中 i 組分的含量。 將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣 , 測得峰面積的平均值 , 用下式 計 算樣品中 i 組分的量 :W =A(W/(A式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進樣體積中所含 i 組分的重量及相應的峰 面 積。

7、 (W 及(A 分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品 i 組分的重量及相應峰面積。外 標 法方法簡便 , 不需用校正因子 , 不論樣品中其他組分是否出峰 , 均可對待測組分 定 量。 但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。 此外, 為了降低 外 標一點法的實驗誤差 , 應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度 相 近。外標法 external standard method色 譜分析中的一種定量方法 ,它不是把標準物質 加入 到被測樣品中 , 而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定 , 把得到的色譜 峰面積與被測 組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。 外標物與被測

8、組 分同為一種物質但要求它 有一定的純度 ,分析時外標物的濃度應與被測物濃度相接 近,以利于定量分析的準確性。三、 定量分析中怎樣選擇內標法或外標法 (來源 :藥物分析網(wǎng)選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內標物 (當然是樣品中沒有的組分 然后配制欲測組分和內標物的混合標準溶液 , 進樣得相對校正因子。 再將內標物 加 入欲測組分的樣品中 , 進樣后測得欲測組分和內標物的定量參數(shù)。 用內標法公 式計 算即可。內標法是將一定量的純物質作內標物 , 加入到準確稱量的試樣中 , 根據(jù)被測試樣 和內標物的質量比及其相應的色譜峰面積之比 ,來計算被測組分的含量。 選擇 內標 物有 4個要求:1. 內標

9、物應是該試樣中不存在的純物質 ; 2. 它必須完全溶于 試樣中, 并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離 ; 3. 加入內標物的量應接近于被 測組分; 4. 色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近 , 或在幾個被測組分 色譜峰中間。 內標法的優(yōu)點是測定的結果較為準確 ,由于通過測量內標物及被 測組分的峰面積的 相對值來進行計算的 , 因而在一定程度上消除了操作條件等的 變化所引起的誤差。 內標法的缺點是操作程序較為麻煩 , 每次分析時內標物和試 樣都要準確稱量 ,有時尋 找合適的內標物也有困難。 外標法簡便 ,但進樣量要 求十分準確 , 要嚴格控制在與 標準物相同的操作條件下進行 , 否則造成

10、分析誤差 , 得不到準確的測量結果。內標與外標都是定量的一種方法而已 ,至于哪一種方法好與不好不能一概而論 , 做不同的分析 , 面對著不同的要求 , 再加上分析成本分析效率等等問題 , 我想簡 單而 有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析,沒有自動進樣器 , 用外標法定量 , 確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差 , 結果經(jīng)常受到搞合成 同事 的質疑。 其實, 仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析 , 首先 我們的 實驗室儀器和手段是否調整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了 , 比如, 襯管是否 潔凈, 玻璃 棉的位置是否合適恰當 （能否

11、使樣品盡可能的汽化 、 汽化溫度是否 合適、 色譜峰 形是否對稱 （也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配 、 附近有沒有 其它色譜峰的干 擾、 選用什么進樣方式 （如快速進樣還是熱針進樣 等等因素的 影響都需要考慮 , 如 果這些因素都考慮了 , 按照 GMP 方法驗證對于精密度的要求 , 同一樣品進 6針以上 的 RSD 和配制 6個樣品的定量結果 RSD 都能滿足小于 1.5%的要求, 那么這個方法 用外標法就是完全適用的 , 但是前面的影響因素是一定要 都考慮到的 , 否則談論這 個方法是否適用就有失偏頗了。 在做過的許多出口產(chǎn)品 的定量分析方法當中有許 多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證

12、過的方法 , 內標與外標都有 （他們用的都 是自動進樣精密度都能滿足 RSD 小于 1.5%的要求, 當一個方法能夠滿足測試要求 的時候, 無論內標外標 , 都是可行的 , 當然有一個 分析成本和分析時間的問題 , 內標 的成本和控制溶液、 樣品溶液的配制當然要比 外標要高和麻煩一些了。 而有些時 候, 可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設備的影 響, 達不到一定的要求 , 而還必須進行 定量分析 , 有時外標的結果可能就要差一 些, 這時, 你可能就要考慮用內標法了 , 可 以排除手動進樣的誤差、 分流歧視的 影響、 包括一些未知因素平行誤差的影響 , 這時內標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、上面已

13、經(jīng)提到當做方法驗證的時候 ,當同一樣品配制 6 個樣品溶液用所選用 的外標法進行定量的時候 , RSD 都滿足 1.5%的要求時,也分為兩種情況 ,小于 1%和 大于 1%小于 1.5%。如果 RSD 的結果小于 1%,那這個方法就沒有什么可以懷 疑的 了;如果 RSD 的結果大于 1%而在 1.5%略低一些的范圍活動時 ,這個方法的可行性就將受到質疑 , 畢竟這是方法驗證 , 你就要考慮上面 1所提到的影響因素 的影響了 , 如果排除掉以上的影響因素 , RSD 還是在 1.5%附近, 就要嘗試內標了 , 如 果內標結果的 RSD 很好, 就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大 , 只能用

14、內標 了 ,或者干脆將原方法做大的變動 ,再嘗試用外標法測試。3、而對于微量分析 ,比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等 ,根據(jù)不同的限 量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多, RSD 有時可以允 許達到 10%甚至更高 ,這時可能外標法有更大的應用空間。4、單從精密度方面去考慮 ,排除其它成本和效率的因素 ,個人認為還是內標優(yōu) 于外標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析 ,以二乙醇胺為內標 , RTX-5 amine（堿改性 15m*0.32mm*1.0um 色譜柱分析 ,將配制好的控制溶液 （含有內 標物 自動進樣器進 6針, 目的物 （二氨基丙醇 與內標物 （二乙醇胺 峰面積比率的 RSD 為 0.18%,而只對這六針樣品的目的物峰 （二氨基丙醇面積 求 RSD ,結果為 0.71%,通過這一實例的結果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了 , 當然是內標更好了。 當然