內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法.

1、內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法什么叫內(nèi)標(biāo)法 ? 怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物 ?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí) , 加入 一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響 , 以提高 分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí) ,在樣品 中加 入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) , 它可被色譜拄所分離 , 又不受試樣中其它組分峰的干 擾, 只要 測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值 , 即可求出待測(cè)組分在樣 品中的百分 含量。 采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí) , 內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。 理 想地說, 內(nèi)標(biāo) 物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物 , 這樣它

2、能以準(zhǔn)確、 已知的 量加到樣品中去 它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化 學(xué)性質(zhì) （如化學(xué)結(jié) 構(gòu)、 極性、 揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 、 色譜行為和響應(yīng)特 征, 最好是被分析 物質(zhì)的一個(gè)同系物。 當(dāng)然, 在色譜分析條什下 , 內(nèi)標(biāo)物必須能 與樣品中各組分充分 分離。 需要指出的是 , 在少數(shù)情況下 , 分析人員可能比較關(guān) 心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過 程中所得到的回收率 , 此時(shí), 他可以使用一種在這種過程 中很容易被完全回收的化 臺(tái)物作內(nèi)標(biāo) , 來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率 , 而不 必遵循以上所說的選擇原 則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí) ,有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積

3、 的比 值 ?影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方 面 的和儀器方面的三類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。 化學(xué)方 面的因素包括 :1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好 ;2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng) ,3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說 ,色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些 , 色譜上 常見的一些問題 （如滲漏 對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大 , 對(duì)面積比的影響則要 小一些, 但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度 , 那么 一定有某個(gè) 重要的色譜問題存在 , 比如進(jìn)樣量改變太大 , 樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃 度之間有很

4、大 的差別, 檢測(cè)器非線性等。 進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變 , 這樣才不 致于造成檢測(cè)器 和積分裝置飽和。 如果認(rèn)為方法比較可靠 , 而色譜固看來(lái)也是正 常的話, 應(yīng)著重檢 查積分裝置和設(shè)置、 斜率和峰寬定位。 對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的 最有力的證據(jù)是 : 面積比可變 ,而峰高比保持相對(duì)恒定 ,在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么 ?在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí) ,先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品 的混 合物做色譜分析 , 測(cè)量峰面積 , 做重量比和面積比的關(guān)系曲線 , 此曲線即為 標(biāo)準(zhǔn)曲 線。 在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用 的條件 一致, 因此, 在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí) ,

5、不僅要注明色譜條件 （如固定相、 柱溫、 載氣流速 等 ,還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí) ,各點(diǎn) 并不完全落在直 線上 ,此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏 差,在使用過程中應(yīng)定 期進(jìn)行單點(diǎn)校正 ,若所得值與平均值的偏差小于 2,曲線 仍可使用 ,若大于 2,則應(yīng)重作 曲線 ,如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng) ,則不 宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。二、外標(biāo)法用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì) , 以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相 比 較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。 此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。 工作 曲 線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線 , 求出斜

6、率、 截 距。 在完全相同的條件下 , 準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液 , 根據(jù)待 測(cè)組分 的信號(hào), 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度 , 或用回歸方程計(jì)算 , 工作曲線法也可 以用外標(biāo)二 點(diǎn)法代替。 通常截距應(yīng)為零 , 若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。 工作曲 線的截距為 零時(shí) ,可用外標(biāo)一點(diǎn)法 (直接比較法 定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中 i 組分的含量。 將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣 , 測(cè)得峰面積的平均值 , 用下式 計(jì) 算樣品中 i 組分的量 :W =A(W/(A式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含 i 組分的重量及相應(yīng)的峰 面 積。

7、 (W 及(A 分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品 i 組分的重量及相應(yīng)峰面積。外 標(biāo) 法方法簡(jiǎn)便 , 不需用校正因子 , 不論樣品中其他組分是否出峰 , 均可對(duì)待測(cè)組分 定 量。 但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。 此外, 為了降低 外 標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差 , 應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度 相 近。外標(biāo)法 external standard method色 譜分析中的一種定量方法 ,它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 加入 到被測(cè)樣品中 , 而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定 , 把得到的色譜 峰面積與被測(cè) 組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。 外標(biāo)物與被測(cè)

8、組 分同為一種物質(zhì)但要求它 有一定的純度 ,分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接 近,以利于定量分析的準(zhǔn)確性。三、 定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法 (來(lái)源 :藥物分析網(wǎng)選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物 (當(dāng)然是樣品中沒有的組分 然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 , 進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。 再將內(nèi)標(biāo)物 加 入欲測(cè)組分的樣品中 , 進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。 用內(nèi)標(biāo)法公 式計(jì) 算即可。內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物 , 加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中 , 根據(jù)被測(cè)試樣 和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比 ,來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。 選擇 內(nèi)標(biāo) 物有 4個(gè)要求:1. 內(nèi)標(biāo)

9、物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì) ; 2. 它必須完全溶于 試樣中, 并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離 ; 3. 加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被 測(cè)組分; 4. 色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近 , 或在幾個(gè)被測(cè)組分 色譜峰中間。 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確 ,由于通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被 測(cè)組分的峰面積的 相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的 , 因而在一定程度上消除了操作條件等的 變化所引起的誤差。 內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩 , 每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試 樣都要準(zhǔn)確稱量 ,有時(shí)尋 找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。 外標(biāo)法簡(jiǎn)便 ,但進(jìn)樣量要 求十分準(zhǔn)確 , 要嚴(yán)格控制在與 標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行 , 否則造成

10、分析誤差 , 得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已 ,至于哪一種方法好與不好不能一概而論 , 做不同的分析 , 面對(duì)著不同的要求 , 再加上分析成本分析效率等等問題 , 我想簡(jiǎn) 單而 有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析,沒有自動(dòng)進(jìn)樣器 , 用外標(biāo)法定量 , 確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差 , 結(jié)果經(jīng)常受到搞合成 同事 的質(zhì)疑。 其實(shí), 仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析 , 首先 我們的 實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了 , 比如, 襯管是否 潔凈, 玻璃 棉的位置是否合適恰當(dāng) （能否

11、使樣品盡可能的汽化 、 汽化溫度是否 合適、 色譜峰 形是否對(duì)稱 （也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配 、 附近有沒有 其它色譜峰的干 擾、 選用什么進(jìn)樣方式 （如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣 等等因素的 影響都需要考慮 , 如 果這些因素都考慮了 , 按照 GMP 方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求 , 同一樣品進(jìn) 6針以上 的 RSD 和配制 6個(gè)樣品的定量結(jié)果 RSD 都能滿足小于 1.5%的要求, 那么這個(gè)方法 用外標(biāo)法就是完全適用的 , 但是前面的影響因素是一定要 都考慮到的 , 否則談?wù)撨@ 個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。 在做過的許多出口產(chǎn)品 的定量分析方法當(dāng)中有許 多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證

12、過的方法 , 內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有 （他們用的都 是自動(dòng)進(jìn)樣精密度都能滿足 RSD 小于 1.5%的要求, 當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求 的時(shí)候, 無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo) , 都是可行的 , 當(dāng)然有一個(gè) 分析成本和分析時(shí)間的問題 , 內(nèi)標(biāo) 的成本和控制溶液、 樣品溶液的配制當(dāng)然要比 外標(biāo)要高和麻煩一些了。 而有些時(shí) 候, 可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影 響, 達(dá)不到一定的要求 , 而還必須進(jìn)行 定量分析 , 有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一 些, 這時(shí), 你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了 , 可 以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、 分流歧視的 影響、 包括一些未知因素平行誤差的影響 , 這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。2、上面已

13、經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候 ,當(dāng)同一樣品配制 6 個(gè)樣品溶液用所選用 的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候 , RSD 都滿足 1.5%的要求時(shí),也分為兩種情況 ,小于 1%和 大于 1%小于 1.5%。如果 RSD 的結(jié)果小于 1%,那這個(gè)方法就沒有什么可以懷 疑的 了;如果 RSD 的結(jié)果大于 1%而在 1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí) ,這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑 , 畢竟這是方法驗(yàn)證 , 你就要考慮上面 1所提到的影響因素 的影響了 , 如果排除掉以上的影響因素 , RSD 還是在 1.5%附近, 就要嘗試內(nèi)標(biāo)了 , 如 果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的 RSD 很好, 就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大 , 只能用

14、內(nèi)標(biāo) 了 ,或者干脆將原方法做大的變動(dòng) ,再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。3、而對(duì)于微量分析 ,比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等 ,根據(jù)不同的限 量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多, RSD 有時(shí)可以允 許達(dá)到 10%甚至更高 ,這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。4、單從精密度方面去考慮 ,排除其它成本和效率的因素 ,個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu) 于外標(biāo)。曾經(jīng)做過一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析 ,以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo) , RTX-5 amine（堿改性 15m*0.32mm*1.0um 色譜柱分析 ,將配制好的控制溶液 （含有內(nèi) 標(biāo)物 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn) 6針, 目的物 （二氨基丙醇 與內(nèi)標(biāo)物 （二乙醇胺 峰面積比率的 RSD 為 0.18%,而只對(duì)這六針樣品的目的物峰 （二氨基丙醇面積 求 RSD ,結(jié)果為 0.71%,通過這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了 , 當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。 當(dāng)然