紫外可見分光光度法

1、紫外紫外-可見分光光度法可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, uv-vis) 按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。 它是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)某一波長范圍的光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定性分析分析、定量分析定量分析及結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜吸收光譜。1 與其它光譜分析方法相比，其儀器設(shè)備和儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快操作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快;2 靈敏度高靈敏度高;3 選擇性好選擇性好;4 精密度和準(zhǔn)確

2、度較高精密度和準(zhǔn)確度較高;5 用途廣泛用途廣泛。 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 物質(zhì)對(duì)光光的吸收是選擇性選擇性的，利用被測(cè)物質(zhì)對(duì)某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)光譜法的基礎(chǔ)。 通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收強(qiáng)度（吸光度），以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得出該物質(zhì)在測(cè)定波長范圍的吸收曲線吸收曲線。 在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長max進(jìn)行物質(zhì)含量的測(cè)定。 一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度透光度：透光度：透光度為透過光的強(qiáng)度it與入射光強(qiáng)度i0之比，用t表示： 即 t= it/i0吸光度吸光度: 為透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，用a表示，即 a=lg1/t=

3、lgi0/it二、朗伯二、朗伯-比爾定律比爾定律 當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即 a= e cl 式中比例常數(shù)e為吸光系數(shù)，與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。 朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)。ecliita0lg1lgmecm10%11式中，a為吸光度，t為透光率，i0、i分別為入射光和透過光的強(qiáng)度；e為吸光系數(shù)，當(dāng)c用物質(zhì)的量濃度表示，l用厘米表示，用代替e，稱為摩爾吸光系數(shù)，單位為（lmol-1cm-1）；當(dāng)c用百分濃度（g/100ml），l用厘米表示時(shí)，用e1c

4、m1%表示e，稱為比吸光系數(shù)。它們的關(guān)系如下：三、偏離朗伯三、偏離朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素（1）入射光為非單色光）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是點(diǎn)光源，比色皿光徑長度不一致，光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 實(shí)際樣品的混濁，加入的保護(hù)膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸光特性變化大。主要部件的性能與作用主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu):光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測(cè)器檢測(cè)器信號(hào)顯示系統(tǒng)信號(hào)顯示系統(tǒng) 樣品樣品 在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：

5、熱輻射光源和氣體放電光源熱輻射光源和氣體放電光源 1 光源光源 熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。 2 單色器單色器 單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡棱鏡和光柵和光柵。 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。 3 吸收池吸收池 吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。4 檢測(cè)器檢測(cè)器 檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)?，F(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增

6、管作為檢測(cè)器。5 信號(hào)顯示系統(tǒng)信號(hào)顯示系統(tǒng) 常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。適宜的吸光度范圍適宜的吸光度范圍最適宜的測(cè)量范圍為0.20.8之間。 單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準(zhǔn)曲線法校準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法和吸收系數(shù)法。1 校準(zhǔn)曲線法校準(zhǔn)曲線法方法：配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，作a-c曲線曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可用最小二乘數(shù)處理，得線性回歸方回歸方程程。 在相同條件下測(cè)定未知試樣的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可

7、以找到與之對(duì)應(yīng)的未知試樣的濃度。2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法 即將待測(cè)溶液與某一標(biāo)樣溶液，在相同的條件下，測(cè)定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。 as=kcs ax=kcxsxsxaacc 1. 開機(jī)開機(jī)l開機(jī)前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出，確認(rèn)電源是否連接。打開儀器電源開關(guān)，等待儀器自檢通過，自檢過程中禁止打開樣品室。2. 使用使用l儀器自檢結(jié)束后（7個(gè)自檢項(xiàng)目均出現(xiàn) ok字樣），按main menu鍵鍵（主 菜單），屏幕顯示如下5個(gè)功能項(xiàng)： 1. phtometry（定量運(yùn)算）；2. wavelength scan（波長掃描模式）；3. time scan（時(shí)間曲線掃描）

8、；4. system（系統(tǒng)校 正）；5. data display（光度直接測(cè)量 模式）。根據(jù)需要測(cè)量的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目按相 應(yīng)選項(xiàng)前的數(shù)字鍵，即可進(jìn)入該選項(xiàng)的 下一級(jí)子菜單。2.1 phtometry（定量運(yùn)算）（定量運(yùn)算）l2.1.1 按main menu鍵，再按數(shù)字1鍵進(jìn)入phtometry子菜單下，選中對(duì)應(yīng)的數(shù)字來選擇所需的測(cè)定方式：%t/abs（透過率/吸光度測(cè)定模式）；ratio（比例測(cè)定模式）；concentration（濃度測(cè)定模式或標(biāo)準(zhǔn)曲線模式）。 2.1.2 按數(shù)字1鍵進(jìn)入%t/abs（透過率/吸光度測(cè)定）子菜單，選中對(duì)應(yīng)的數(shù)字鍵來設(shè)定測(cè)定條件：num wl(設(shè)定測(cè)試波長的數(shù)目，最

9、多可設(shè)定6個(gè)不同波長)；wl setting（設(shè)定測(cè)試波長具體數(shù)值）data mode(選擇測(cè)定吸光度或透光率)，設(shè)定完畢后點(diǎn)擊enter鍵鍵確定，所有項(xiàng)目設(shè)定完畢后按數(shù)字?jǐn)?shù)字0 鍵鍵確定，等待儀器調(diào)整至準(zhǔn)備狀態(tài)。 l此時(shí)屏幕上出現(xiàn)autozero（校零），將盛有空白溶液的比色皿放入樣品室中，按start/stop 鍵鍵進(jìn)行零點(diǎn)的自動(dòng)調(diào)整。自動(dòng)調(diào)零完成后（若測(cè)定吸光度，則儀器屏若測(cè)定吸光度，則儀器屏幕右上角顯示幕右上角顯示0.000; 若測(cè)定透光率，則顯若測(cè)定透光率，則顯示示100%。若校正不理想則可按。若校正不理想則可按clear return 鍵返回到鍵返回到autozero界面，界面，重

10、新按重新按start/stop 鍵再校一次零）鍵再校一次零），打開樣品室蓋，將樣品置于光路中，關(guān)上樣品室蓋，儀器自動(dòng)測(cè)定當(dāng)前樣品溶液吸光度或透光率，儀器的顯示屏自動(dòng)給出對(duì)應(yīng)波長的數(shù)值，待示值穩(wěn)定后記錄。 2.2 wavelength scan（波長掃描模式）（波長掃描模式） 2.2.1按main menu鍵，再按數(shù)字2鍵進(jìn)入wavelength scan（波長掃描模式）子菜單下，選中對(duì)應(yīng)的數(shù)字鍵來設(shè)定測(cè)定條件：掃描的起止波長（開始波長為大掃描的起止波長（開始波長為大波長），測(cè)量模式，圖譜坐標(biāo)的上下限，波長），測(cè)量模式，圖譜坐標(biāo)的上下限，掃描速度等等。掃描速度等等。修改完畢按數(shù)字0鍵確定。 2.

11、2.2 波長掃描：分別將兩個(gè)比色皿裝上空白溶液和樣品溶液，放入比色槽中，拉動(dòng)拉桿使光路孔對(duì)準(zhǔn)空白溶液，按start/stop鍵進(jìn)行譜圖掃描（如想終止掃描再次按start/stop鍵），待儀器自動(dòng)進(jìn)行基線校正，提示拉入樣品自動(dòng)測(cè)試，測(cè)試完畢后有掃描圖譜出現(xiàn)，下方有相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理選項(xiàng)process baseline（重新進(jìn)行基線校正）（重新進(jìn)行基線校正）print。 2.2.3 數(shù)據(jù)處理：按數(shù)字1鍵進(jìn)入process（數(shù)據(jù)處理），可以讀峰谷值，修改坐標(biāo)，顯示所有數(shù)據(jù)，求一階倒數(shù)等等功能。3 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)l將比色皿中的溶液倒盡，然后用蒸餾水沖洗比色皿至干凈，用濾紙擦干；關(guān)電源將干燥劑放入樣品室內(nèi)，蓋上防塵罩，做好使用登記，得到管理老師認(rèn)可方可離開。4 要點(diǎn)與注意事項(xiàng)要點(diǎn)與注意事項(xiàng)l4.1 開機(jī)前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出，儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。l4.2 比色皿內(nèi)溶液以皿高的2/34/5為宜，不可過滿以防液體溢出腐蝕儀器。測(cè)定時(shí)應(yīng)保持比色皿清潔，池壁上液滴應(yīng)用濾紙擦干，切勿用手捏透光面。測(cè)定紫外波長時(shí)，需選用石英比色皿。l4.3 測(cè)定時(shí)，禁止將試劑或