端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體PPT課件

1、2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Elizabeth H. BlackburnCarol W. GreiderJack W. SzostakThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 was awarded jointly to Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider and Jack W. Szostak “for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres（端粒） and the enzyme telomerase（端粒酶）”.

2、 第1頁/共20頁內(nèi)容提要p 端粒問題的提出p Blackburn與Szostak發(fā)現(xiàn)端粒能保護(hù)染色體末端p Blackburn與Greider發(fā)現(xiàn)催化端粒延伸的端粒酶p 研究進(jìn)展及發(fā)展方向p 工作的重大價(jià)值第2頁/共20頁端粒問題的提出p20世紀(jì)30年代，Hermann JMuller()發(fā)現(xiàn)被X射線打斷的果蠅染色體其末端存在一種特殊序列，該序列與常染色體相較極不穩(wěn)定。1938年，Muller在The Collecting Net上發(fā)表了一篇題為“The remarking of Chromosomes”的演講稿，將染色體的游離端命名為端粒（telomer）。p“這種末端基因具有某種特殊的功

3、能，即可以對(duì)染色體的末端起到封閉(sealing)的作用，從某種意義上講，如果染色體的末端不被封閉，染色體就不會(huì)持續(xù)存在”。 Muller HJ. The remarking of chromosomes. Collecting Net, 1938, 13: 181-198.第3頁/共20頁p端粒問題一端粒問題一1941年，Muller的結(jié)論由BarbaraMcClintock()在玉米中得到證實(shí)。p染色體末端不同于DNA斷端，它避免之間發(fā)生融合的特殊結(jié)構(gòu)是什么？p端粒問題二端粒問題二1972年，James Watson()在探討噬菌體T7的DNA復(fù)制時(shí)指出，真核生物線性DNA的復(fù)制始于內(nèi)部起

4、始點(diǎn)，以短鏈RNA分子作引物，沿53方向延伸互補(bǔ)鏈。p真核生物線性DNA末端可以完整復(fù)制的機(jī)制是什么?第4頁/共20頁前導(dǎo)鏈隨從鏈引物第5頁/共20頁Blackburn與Szostak發(fā)現(xiàn)端粒能保護(hù)染色體末端p1975年，Blackburn檢測(cè)嗜熱四膜蟲編碼核糖體RNA的線性rDNA端粒序列l(wèi)由核苷酸六聚體(CCCCAA/GGGGTT)n構(gòu)成，n=2070l重復(fù)序列具有方向性，端粒的3端由(TTGGGG)n 構(gòu)成(G鏈)，5端由(CCCCAA)n構(gòu)成(C鏈)l重復(fù)序列具有不連續(xù)性p70s，Szostak在酵母中構(gòu)建人工線性DNA分子研究染色體同源重組機(jī)制l用限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)形質(zhì)粒時(shí)，存在“黏

5、”性末端，酶切后形成的線性DNA分子很快與酵母的染色體DNA發(fā)生同源重組，或很快被降解而不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在第6頁/共20頁DNA sequences of telomeres maintained in yeast，Nature.Vol.310. 12 July 1984熱四膜蟲rDNA一個(gè)長(zhǎng)15kb、含有端粒的末端片段，連接到酵母環(huán)狀質(zhì)粒酶切后形成的線性分子兩端，構(gòu)成一個(gè)全新的線性DNA分子。第7頁/共20頁Blackburn與Greider發(fā)現(xiàn)催化端粒延伸的端粒酶pBlackburn和Szostak的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了端粒在物種進(jìn)化中的保守性以及其保護(hù)染色體穩(wěn)定性的重要功能。p科學(xué)家們?cè)噲D用多種模

6、型來解釋，包括同源重組或轉(zhuǎn)座作用、回文結(jié)構(gòu)或發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，也有科學(xué)家設(shè)想存在一種全新的酶催化合成端粒。第8頁/共20頁p1984年，Greider在Blackburn的指導(dǎo)下共同研究端粒的復(fù)制問題。p存在一種特殊類型的轉(zhuǎn)移酶能沿35方向先將G鏈延長(zhǎng)，再以此為模板合成互補(bǔ)的C鏈，這樣就保證了子代DNA鏈5端的完整性。p她們用一段合成的端粒作為底物，加入嗜熱四膜蟲的無細(xì)胞浸出物中，并混合了-32P-dGTP、dATP、dTTP、dCTP，孵育一段時(shí)間后將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。第9頁/共20頁Identification of a Specific Telomere Terminal Transfer

7、ase Activity in Tetrahymena Extracts Cell, Volume 43, 405-413, 1 December 1985第10頁/共20頁p結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA寡聚體的延長(zhǎng)是以6堿基序列重復(fù)相加來完成的，說明了確實(shí)存在一種此前未知的酶來催化端粒特有的重復(fù)序列延伸。p為了排除這種延伸是由已知的DNA聚合酶以四膜蟲自身染色體上(CCCCAA)n序列為模板完成的，她們用微球菌核酸酶破壞無細(xì)胞浸出物中四膜蟲自身染色體上的(CCCCAA)n序列，但上述過程依然存在。p另外，嗜熱四膜蟲中的這種轉(zhuǎn)移酶還能催化(TTGGGG)疊加到酵母端粒重復(fù)序列構(gòu)成的引物上，這說明此轉(zhuǎn)移酶同

8、樣具有進(jìn)化上的保守性。但其對(duì)隨機(jī)序列的DNA底物不延伸，并且該活性不依賴于DNA聚合酶。第11頁/共20頁p端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的核蛋白復(fù)合體p端粒酶以其上的RNA片段為模板合成端粒l克隆嗜熱四膜蟲端粒酶上一段159bp長(zhǎng)的RNA片段(159 RNA)，該片段上含有(CAACCCCAA)序列，如果設(shè)法干擾這一段序列，那么端粒酶將無法正常工作。l1990年，Blackburn實(shí)驗(yàn)室將這段序列突變，結(jié)果合成的端粒序列隨之變化，且與之互補(bǔ)。第12頁/共20頁A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymenatelomerase

9、required for telomere repeat synthesis第13頁/共20頁研究進(jìn)展及發(fā)展方向p哺乳動(dòng)物端粒序列l(wèi)哺乳動(dòng)物端粒的重復(fù)序列為(TTAGGGAATCCC)，其中G鏈3端是一段單鏈的懸突，C鏈5端以序列(ATC)結(jié)束。p雙環(huán)結(jié)構(gòu)Mammalian Telomeres End in a Large Duplex LoopCell, Vol. 97, 503514, May 14, 1999第14頁/共20頁p蛋白質(zhì)復(fù)合體shelterinl保護(hù)染色體末端不發(fā)生融合發(fā)揮關(guān)鍵作用p1997年，Joachim Lingner等l端粒酶是一種特殊類型的逆轉(zhuǎn)錄酶，其能以自身含有

10、的RNA為模板，延伸染色體的端粒，保證染色體末端復(fù)制的完整。Genes Dev. 2005 19 2100-2110第15頁/共20頁p細(xì)胞永生化導(dǎo)致癌癥形成，而且重新具備在發(fā)育中的胚胎細(xì)胞的關(guān)鍵功能：端粒長(zhǎng)度不縮短。pJoachim Lingner實(shí)驗(yàn)室鑒定出三個(gè)蛋白連接在一起形成的稱作CST的蛋白復(fù)合物，然后附著到端粒上。CST阻止端粒酶在端粒上發(fā)揮作用，但在癌細(xì)胞中，它們參與的時(shí)間太晚。Nature.Vol.488.23 August 2012第16頁/共20頁l 現(xiàn)已比較明確的是端粒的縮短與細(xì)胞的衰老直接相關(guān)，由此人們想把這個(gè)結(jié)論外推到與生物整體衰老的關(guān)系上。 p目前的研究還難以將端粒縮短與機(jī)體衰老的關(guān)系解釋清楚，有待進(jìn)一步深入探索。第17頁/共20頁工作的重大價(jià)值Blackburn、Greider和Szostak三位科學(xué)家有關(guān)端粒和端粒酶的開創(chuàng)性工作，以及后續(xù)的研究進(jìn)展，對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的腫瘤和一些遺傳性疾病的研究，具有重大價(jià)值。p 腫瘤l絕大多數(shù)的人體正常細(xì)胞中是沒有端粒酶的，隨著細(xì)胞分