(博視康)LUNA研究：補(bǔ)充葉黃素和玉米黃質(zhì)后黃斑色素密度和血清類胡蘿卜素濃度的改變(譯文)1995(2)

1、 臨床研究文獻(xiàn)11 LUNA研究：補(bǔ)充葉黃素和玉米黃質(zhì)后黃斑色素密度和血清類胡蘿卜素濃度的改變Meike Trieschmann a,*, Stephen Beatty b, John M. Nolan b, Hans Werner Hense c,Britta Heimes a, Ulrike Austermann a, Manfred Fobker d, Daniel Pauleikhoff aReceived 6 October 2006; accepted in revised form 11 December 2006Available online 19 December 2006

2、LUNA研究：補(bǔ)充葉黃素和玉米黃質(zhì)后黃斑色素密度和血清類胡蘿卜素濃度的改變Meike Trieschmann a,*, Stephen Beatty b, John M. Nolan b, Hans Werner Hense c,Britta Heimes a, Ulrike Austermann a, Manfred Fobker d, Daniel Pauleikhoff aReceived 6 October 2006; accepted in revised form 11 December 2006Available online 19 December 2006【摘要】 黃斑色素由

3、葉黃素(L)和玉米黃質(zhì)(Z)構(gòu)成，有保護(hù)視網(wǎng)膜免受光氧化損傷的作用。本研究主要通過觀測(cè)黃斑色素光學(xué)密度（MPOD）和血清類胡蘿卜素成分濃度改變，來顯示機(jī)體對(duì)補(bǔ)充L，Z和抗氧化劑的反應(yīng)性。干預(yù)組有108位觀查對(duì)象（平均年齡±SD：71.5±7.1），其中92.6%有AMD的特征性表現(xiàn)。他們每日補(bǔ)充12mg L，1mg Z, 全部以酯的形式，120mg維生素C,17.6mg維生素E，10mg鋅和40g硒（博視康TM），持續(xù)六個(gè)月。在補(bǔ)充階段的5次隨訪，和補(bǔ)充完成3個(gè)月后分別用雙波長自發(fā)熒光（AF）測(cè)量MPOD值。對(duì)照組有28位觀察對(duì)象（平均年齡±SD：71.0

4、7;8.1），未給予飲食的補(bǔ)充和調(diào)節(jié)，分別在基線和平均29.4（±9.3）周后進(jìn)行兩次檢查。在基線時(shí)，平均MPOD值±SD（0.5°）在干預(yù)組和對(duì)照組分別為0.504（±0.197）和0.525（±0.189）。在補(bǔ)充階段，干預(yù)組觀測(cè)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的MPOD值的上升（0.1±0.009；p<0.0008）,而在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)有意義的上升（0.03±0.02；p>0.05）。為了根據(jù)MPOD的反應(yīng)性對(duì)補(bǔ)充對(duì)象進(jìn)行四分法分組，我們計(jì)算了第六次隨訪和基線間MPOD值的差值。組I(非應(yīng)答組)未表現(xiàn)出MPOD值(0.5

5、76;處)的增加，盡管可以觀測(cè)到血清L和Z濃度的增加。其它三個(gè)“應(yīng)答組”最終的MPOD值相仿，組、組、組的最終平均MPOD值（±SEM）分別為0.59（±0.04）光學(xué)密度單位（ODU），0.64（±0.03）ODU，0.64（±0.03）ODU。基線MPOD水平較低的觀察對(duì)象與中等或者高基線MPOD水平的對(duì)象相比較對(duì)補(bǔ)充試驗(yàn)的反應(yīng)更容易呈現(xiàn)為明顯的MPOD值的上升，或無MPOD的上升。補(bǔ)充12mg L和1mg Z，聯(lián)合抗氧化劑，使大多數(shù)研究對(duì)象的MPOD值增加，包括那些患有AMD的對(duì)象。但是，仍然有很大比例的對(duì)象，雖然有血清L和Z濃度的增加，但在整個(gè)研

6、究階段卻未觀測(cè)到MPOD的擴(kuò)增。這提示這些類胡蘿卜素的腸內(nèi)吸收障礙并不是黃斑無應(yīng)答的原因。另外，我們的結(jié)果提示飽和機(jī)制在視網(wǎng)膜攝取和維持黃斑類胡蘿卜素中起重要作用?！娟P(guān)鍵詞】 年齡相關(guān)性黃斑變性；葉黃素；黃斑色素；博視康TM；玉米黃質(zhì) 1.引言：老年性黃斑變性（AMD）是發(fā)達(dá)國家的首要致盲原因。氧化應(yīng)激，即指活性氧中間產(chǎn)物造成的組織損傷，和短波長光（藍(lán)光）造成的視網(wǎng)膜損傷，被認(rèn)為是AMD重要致病原因。黃斑色素由三種類胡蘿卜素，葉黃素（L），玉米黃質(zhì)(Z)，內(nèi)消旋玉米黃質(zhì)(meso-Z)，在黃斑區(qū)聚集而成。在人類，由于葉黃素和玉米黃質(zhì)無法在體內(nèi)合成，而完全來源于飲食的攝取。內(nèi)消旋玉米黃質(zhì)主要來源

7、于視網(wǎng)膜的葉黃素。由于黃斑色素對(duì)短波長光的濾過作用和抗氧化的特性，一般認(rèn)為黃斑色素具有防止AMD發(fā)展的保護(hù)作用。一些研究已經(jīng)證明，血清葉黃素(和玉米黃質(zhì))濃度與黃斑色素光學(xué)密度(MPOD)及飲食的攝入成正相關(guān)。另外，一些非飲食因素，包括：年齡，性別，虹膜顏色，種族，體脂含量，紫外光線的暴露情況，吸煙，飲酒和遺傳背景等，對(duì)血清葉黃素（和玉米黃質(zhì)）濃度和黃斑色素光學(xué)密度也有影響。然而無論怎樣，由于飲食攝取是體內(nèi)葉黃素和玉米黃質(zhì)的唯一來源，這也就提示它的飲食攝入量是決定其血清濃度和黃斑色素光學(xué)密度最重要因素。而這一觀點(diǎn)與大多數(shù)具代表性的補(bǔ)充試驗(yàn)相符。LUNA研究（自發(fā)熒光AF測(cè)定葉黃素療效）是觀測(cè)補(bǔ)

8、充黃斑類胡蘿卜素和抗氧化劑后MPOD的改變，和血清中葉黃素和玉米黃質(zhì)的濃度的改變。2.材料與方法：2.1研究對(duì)象我們選取136個(gè)對(duì)象進(jìn)入LUNA研究。所有曾經(jīng)補(bǔ)充過葉黃素，玉米黃質(zhì)和抗氧化劑的皆不納入本研究。本研究以最優(yōu)的臨床實(shí)踐為指導(dǎo)，通過了當(dāng)?shù)蒯t(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，遵循赫爾辛基宣言的原則。每個(gè)對(duì)象入組前均獲得其知情同意。研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：1、年齡50歲或以上。2、無或輕微的晶體混濁，故可清楚的觀測(cè)到視網(wǎng)膜情況。3、無葉黃素和/或玉米黃質(zhì)補(bǔ)充史，或抗氧化劑的補(bǔ)充史（避免結(jié)果混淆）。4、一般健康狀態(tài)好。有視網(wǎng)膜中央萎縮斑和中央視網(wǎng)膜色素上皮增生或脈絡(luò)膜新生血管的不納入本實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@些會(huì)影響自

9、發(fā)熒光的形態(tài)和測(cè)量。在試驗(yàn)初期，每個(gè)對(duì)象只選取單眼作為研究對(duì)象：選擇自發(fā)熒光較強(qiáng)的為觀測(cè)眼；若雙眼的自發(fā)熒光強(qiáng)度相似，則選擇視力較好的眼為觀測(cè)眼；若雙眼的自發(fā)熒光強(qiáng)度和視力皆相仿，則選擇右眼為觀測(cè)眼。在這136位自愿者中，其中108位進(jìn)入干預(yù)組（I），其余28進(jìn)入對(duì)照組（C）。干預(yù)組的平均年齡（±SD）為71.5(±7.1),年齡范圍為51-87歲，男女性別比例為40：68（62.6-37.4%）。干預(yù)組的所有對(duì)象給予相同的補(bǔ)充制劑，成分包含12mg葉黃素1mg 玉米黃質(zhì)，皆為酯質(zhì)形式，120mg維生素C，17.6mg維生素E，10mg鋅，40g硒。該補(bǔ)充制劑商品制品為博視

10、康TM,由柏林博士倫公司生產(chǎn)。所有藥品的制作工序都遵循高制藥標(biāo)準(zhǔn)和GMP,初成品和最終制品的分析采用已確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量采用紫外光/可見光光譜分析法測(cè)定。其穩(wěn)定性的測(cè)定也遵循ICH的要求。另外，該藥品的制作遵循嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。108位干預(yù)組對(duì)象中有100位有AMD的特征性表現(xiàn)，包括存在顯著的玻璃膜疣（60%），非中央視網(wǎng)膜色素上皮的增生（33%）和萎縮性改變（7%）。另外的8位研究對(duì)象黃斑處表現(xiàn)正常。對(duì)照組有28位研究對(duì)象，年齡范圍為57-83歲(平均年齡±SD：71±8.1)，男女性別比例為16：12(57%：43%）。其中有25位存在特征性的AM

11、D改變，包括軟性玻璃膜疣（62%），非中心視網(wǎng)膜色素上皮增生（32%）和萎縮性改變（6%）。其余的3位入選者表現(xiàn)為正常的黃斑。眼底檢查均采用標(biāo)準(zhǔn)眼底成像技術(shù)，眼底圖像的分級(jí)由同一位觀測(cè)者在隱瞞入選對(duì)象臨床細(xì)節(jié)的情況下進(jìn)行。本研究為非隨機(jī)的，公開標(biāo)記的，控制性試驗(yàn)，對(duì)照組的對(duì)象并未使用安慰劑。干預(yù)組的研究對(duì)象進(jìn)行6次檢查，分別為基線，6周，12周，18周，24周（此時(shí)停止給予補(bǔ)充劑），27周（停止給藥后3周）；而對(duì)照組只進(jìn)行兩次檢查，分別在基線和10-50周（平均±SD：29.4±9.3）。由于沒有完成最終的隨訪檢查，干預(yù)組中的11位對(duì)象和對(duì)照組中的2位對(duì)象被排除在最終的分析

12、中。干預(yù)組研究對(duì)象的依從性通過要求研究對(duì)象將服用完的空藥瓶帶回的方式來監(jiān)測(cè)。2.2 血清類胡蘿卜素的測(cè)定所有干預(yù)組的對(duì)象分別測(cè)定基線，和補(bǔ)充階段結(jié)束時(shí)的血清葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量。取血液樣本7.5ml，1500*g離心15分鐘，分離血清并分裝于兩個(gè)琥珀色小管，在-70下保存。血清類胡蘿卜素含量測(cè)定采用的方法曾在其他文獻(xiàn)上報(bào)道（Dachtler et al 2001）。取300L血清于一琥珀色微離心管中，再加入20L內(nèi)參（9g/ml-apo-8類胡蘿卜醛的乙醇溶液），2ml己烷-異丙醇3：2（v/v）混合液和1ml 0.85%NaCl。渦旋1分鐘后800*g離心2分鐘。移去上層液，加入2ml己烷

13、，重復(fù)上述提取步驟。將兩次提取上層液混合，在30氮?dú)饬髦姓舭l(fā)干燥，然后用200L乙醇溶解。將上述200L乙醇溶液注入116液體色譜儀（Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany），使用168型二極管陣列探測(cè)器分界。樣品采用等強(qiáng)度洗脫（流動(dòng)相：丙酮/水 86：14 v/v），流速為1ml/min。該色譜儀的運(yùn)行在450nm吸光率處監(jiān)測(cè)。我們使用ProntoSIL 120-3-C30倒相柱（3m顆粒直徑，250cm長度*4.6（i.d）, Bischoff Analysentechnik GmbH, Leonberg, Germany）,在室溫條件下進(jìn)行。該分析法

14、通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)學(xué)會(huì)提供的標(biāo)準(zhǔn)參考原料968c（人類血清脂溶性維生素，類胡蘿卜素，膽固醇）驗(yàn)證正確。同時(shí)，通過間隔12個(gè)月重復(fù)分析（n=55）正常人和病人樣品來確定批間變異率（CoVs）(圓括號(hào)內(nèi)表述的為平均濃度)：正常人和患者的葉黃素CoVs分別為8.2%（0.1g/ml）和6.5%（0.6g/ml）。而對(duì)于玉米黃質(zhì)則分別為9.8%（0.01g/ml）和 6.7%(0.06g/ml)。標(biāo)準(zhǔn)葉黃素和玉米黃質(zhì)由Carl Roth GmbH &Co. KG公司提供，-apo-8- 胡蘿卜素醛向Fluka公司購買。所有溶劑符合高效液相色譜法（HPLC）等級(jí)，由Merck KGaA公司提

15、供。峰面積被用于定量分析。2.3其他生物化學(xué)分析干預(yù)組對(duì)象在入組和出組時(shí)分別測(cè)定血清總膽固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白（LDL）,高密度脂蛋白（HDL）和鋅濃度?？偰懝檀己透视腿ゲ捎脴?biāo)準(zhǔn)酶素法（CHOD-PAP和GPO-PAP，Roche Diagnostics，曼海姆, 德國），HDL采用直接酶素法（PEG修飾酶，Roche Diagnostics），LDL采用Friedewald公式計(jì)算。所有測(cè)量在 747 型 Boehringer Mannheim/Hitach自動(dòng)分析儀上進(jìn)行。血清鋅濃度測(cè)定是使用PerkineElmer 2380 原子吸收分光光度計(jì)來測(cè)定火焰原子吸收率。該方法通過分析

16、由德國國家INSTAND 測(cè)試體系和美國疾病控制和預(yù)防中心的國際質(zhì)量保證體系提供標(biāo)準(zhǔn)血清驗(yàn)證正確。2.4黃斑色素測(cè)定使用改良的海德堡視網(wǎng)膜血管造影儀（海德堡工程公司）測(cè)定眼底自發(fā)熒光。AF是利用存在于視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）的脂褐質(zhì)的熒光性。脂褐質(zhì)（LF）吸收400nm到580nm的短波長輻射波，釋放500nm到800nm的熒光，其峰值在620nm。由于MP吸收波長短與550nm的藍(lán)光，其吸收峰在460nm，而且MP的光吸收量和視網(wǎng)膜的色素含量有關(guān)，故可以用來測(cè)定MPOD。目前的AF的測(cè)定法使用MP吸收的兩個(gè)不同的激發(fā)波長。這種雙波長的方法可以用來計(jì)算RPE上非均勻分布的脂褐質(zhì)的量。該方法在其

17、他文獻(xiàn)上有更為詳細(xì)的描述，而且已經(jīng)在其他的臨床研究中使用。在這個(gè)研究中，MPOD的測(cè)定由主要研究者采用同一臺(tái)測(cè)試設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行。所使用的散瞳藥包含0.5%托比卡胺和2.5%苯腎上腺素。測(cè)試者瞳孔直徑散大至6mm被認(rèn)為是安全的。由于測(cè)試設(shè)備的亮光造成的漂白效應(yīng)會(huì)妨礙測(cè)試眼的注視，故要求研究對(duì)象使用對(duì)側(cè)眼注視。當(dāng)患者的對(duì)側(cè)眼視力過低不能注視時(shí)，則要求其直視前方，并盡量減少眼球的運(yùn)動(dòng)。使改良的海德堡視網(wǎng)膜血管造影儀和受試眼對(duì)齊后，首先使用紅外光（IR），然后使用488nm的激發(fā)波長光。使用視網(wǎng)膜漂白效應(yīng)使視紫質(zhì)吸收入射光引起的熒光效應(yīng)減少到最小。在獲得第一幅圖像前，先在488nm波長光下暴露至

18、少20s。漂白范圍為20*20°，瞳孔區(qū)的平均激光強(qiáng)度為240W。此后，分別在兩激發(fā)波長處獲得兩段影像。第一段影像在488nm波長處獲得包含16幅圖像，而第二段包含16幅影像從514nm波長處獲得。系統(tǒng)軟件按照解剖學(xué)細(xì)節(jié)如視網(wǎng)膜血管將兩段影像中的圖片線形排列。使用圖像分析技術(shù)在此基礎(chǔ)上獲得兩個(gè)波長處的平均圖像。該系統(tǒng)軟件采用2-波長技術(shù)獲得光學(xué)密度分布，是專門用于分析488nm和514nm激發(fā)光的自發(fā)熒光圖像。先將488nm和514nm激發(fā)光的平均影像相互比較，而各個(gè)區(qū)域（F）的相應(yīng)密度計(jì)算如下：DF(460)= 1 log IF(488)K(488)-K(514) IF(514)其

19、中DF(460)代表F點(diǎn)在460nm的光學(xué)密度，IF(488)和IF(514)分別表示488nm和514nm視網(wǎng)膜均一激發(fā)光的強(qiáng)度。激發(fā)系數(shù)，K(488)=0.781，K(514)=0.255，用于校正黃斑色素密度使其就像是使用單一波長的波峰來測(cè)量，從而使1/ K(488)-K(514)值為1.90。但是，Stockman et al. (2000)所使用的常數(shù)是用來校正雙波長自發(fā)熒光技術(shù)中所使用的波長，我們應(yīng)該知道使用514nm而不是540nm或更長的波長，限制了黃斑色素密度的低限，使其結(jié)果更可靠。因?yàn)?.9這個(gè)系數(shù)同時(shí)糾正了每張圖像的干擾誤差。黃斑中心凹由軟件定義為與相對(duì)密度圖對(duì)應(yīng)的正態(tài)分

20、布曲線的中央。當(dāng)分布不對(duì)稱時(shí)需要人為的干預(yù)。在這種情況下，解剖學(xué)的標(biāo)志如血管在此后的測(cè)量中可用于定義中心。然后軟件可計(jì)算同心圓(1個(gè)像素的寬度)處的平均相對(duì)密度，在0到153像素的偏心度(約6°視角)產(chǎn)生DF(460)輻射狀分布圖。當(dāng)偏心度大于4°時(shí)圖像基本上趨于穩(wěn)定，偏心度6°處被選為參考值P(定義為無MP的補(bǔ)償量)。在此研究中，我們將在視網(wǎng)膜偏心度為0.5°，寬度為1像素的同心圓區(qū)域的平均值作為平均MP密度。我們避免像先前許多研究一樣使用峰密度（中心凹處），是因?yàn)椴捎?個(gè)像素作為量度存在可變性。2.5重復(fù)性，重復(fù)測(cè)量和檢查者間的可變性雙波長自發(fā)熒光法

21、的重復(fù)性和檢查者間/時(shí)期間的可變性已經(jīng)在其他文獻(xiàn)上報(bào)道。簡單說，重復(fù)性可以用可靠率來體現(xiàn)，我們?cè)谝惶囟〞r(shí)間對(duì)20個(gè)對(duì)象進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)量，計(jì)算出該方法的可靠率為0.94。重復(fù)測(cè)試的可變性和檢查者間的可變性也在24個(gè)對(duì)像中進(jìn)行了評(píng)估。檢查者間的平均誤差（±SD）（測(cè)量值1由檢查者1執(zhí)行減去測(cè)量值2由檢查者2執(zhí)行）為0.002（±0.042）ODU。2.6統(tǒng)計(jì)分析使用SAS軟件（版本8.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。描述性比較對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)t檢驗(yàn)，對(duì)分類變量進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)系數(shù)分析被用于評(píng)估MPOD(0.5°偏光度)和潛在決定因素間的相關(guān)性。偏態(tài)分布因素，如

22、葉黃素，玉米黃質(zhì)，和甘油三酯，先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化以獲得更為常態(tài)的分布值。干預(yù)組和對(duì)照組中基線和隨訪測(cè)定的差異性采用配對(duì)t檢驗(yàn)，而組間比較則采用非配對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?；煜蜃雍投嘀匚ｋU(xiǎn)因素的影響采用線形回歸分析。P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1 基線結(jié)果干預(yù)組的基線特點(diǎn)在表1中表述。干預(yù)組和對(duì)照組的年齡 平均年齡(±SD):干預(yù)組=71.5（±7.1）；對(duì)照組=71.0（±9.1），p值為0.77 和性別(男女比例：干預(yù)組=40：6837:63%；對(duì)照組=12：1643:57%；p=0.77)組成相仿。偏心度0.5°處平均MPOD值（±S

23、D)：干預(yù)組為0.504（±0.197)ODU；對(duì)照組為0.525（±0.189)ODU，（p=0.6）。表1：補(bǔ)充對(duì)象的基線特征（干預(yù)組）Intervention groupn= 108 (mean + SD)Age (years) 71.5 + 7.1Male:female (%) 37.4:62.6Body mass index (kg/m2) 26.3 + 4.0Total cholesterol (mg/dl) 206 + 38.5HDL cholesterol (mg/dl) 58.7 + 17.9Non-HDL cholesterol (mg/dl) 147.

24、3 + 38.4Triglycerides (mg/dl) (non-fasting) 152.5 + 87.2圖1：平均基線MPOD值與年齡相關(guān)性（補(bǔ)充和非補(bǔ)充對(duì)象）MPOD0.5°：偏心度0.5°處黃斑色素光學(xué)密度。I組為干預(yù)組(補(bǔ)充)（第一次隨訪為基線，n=108），C組為對(duì)照組（n=28）Serum lutein (mg/ml) 0.158 + 0.143Serum zeaxanthin (mg/ml) 0.018 + 0.013MPOD at 0.5 0.504 + 0.197MPOD,黃斑色素光學(xué)密度；HDL，高密度脂蛋白干預(yù)組108個(gè)對(duì)象中，5人（4.7%）目

25、前吸煙，63（58.9%）有高血壓病史，11（10.3%）有糖尿病史，20（18.7%）有冠心病史，3（2.8%）有中風(fēng)史。另外，有33人（30.8%）目前正在服用降脂藥。干預(yù)組中，偏心度0.5°處女性的平均MPOD值(±SEM)為0.52(±0.03)ODU，高于男性的0.48(±0.02)ODU，但是這種區(qū)別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣的，目前吸煙的和無吸煙史之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：偏心度0.5°處平均MPOD值（±SEM）：目前吸煙的為0.55（±0.10）；無吸煙史的為0.50（±0.02）；p=0.64。在基線水平，M

26、POD水平和年齡無相關(guān)性（圖1）：高齡組（年齡大于70歲）的MPOD水平高于低齡組（年齡在51到69歲間）偏心度0.5°處平均MPOD值（±SEM）：高齡組為0.48（±0.02），低齡組為0.54（±0.03）。但是這種區(qū)別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這里我們發(fā)現(xiàn)在基線水平血清L和Z的濃度與MPOD水平正相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（血清L：r=0.21，p=0.03；血清Z：r=0.21，p=0.03）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)基線時(shí)，血清甘油三酯的含量和MPOD值呈負(fù)相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.3,p=0.001）。血清HDL與MPOD呈正相關(guān)，且接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.18，

27、p=0.06）（表2）。表2：干預(yù)組中潛在危險(xiǎn)因素和基線MPOD值關(guān)系Correlation coefficient p-ValueAge (years) -0.05 0.58Body mass index (kg/m2) -0.08 0.40Total cholesterol (mg/dl) -0.08 0.44HDL cholesterol (mg/dl) 0.18 0.06Triglycerides (mg/dl) log transformed -0.30 0.001*Lutein (mg/ml) 0.21 0.03*Lutein (mg/ml) log transformed 0.2

28、3 0.017*Zeaxanthin (mg/ml) 0.21 0.03*Zeaxanthin (mg/ml) Log transformed 0.18 0.07*p < 0.01, *p < 0.05. MPOD, 黃斑色素光學(xué)密度3.2 對(duì)補(bǔ)充L,Z 和抗氧化劑的反映3.2.1. MPOD在最后一次隨訪中，干預(yù)組和對(duì)照組分別有97（89.8%）和26（92.9%）人參加。干預(yù)組中，偏心度0.5°處平均MPOD值在最初的第二次隨訪時(shí)有衰減，但這種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.74）。此后直至第六次隨訪（停止補(bǔ)充后三個(gè)月）皆處于持續(xù)上升的狀態(tài)?；€與第六次隨訪間平均MPOD差

29、值在干預(yù)組和對(duì)照組分別為0.1（±0.009）和0.03（±0.02），而只有干預(yù)組的這種上升是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（p<0.01）.圖2表示了每次隨訪時(shí)所有觀察對(duì)象的平均值。正如在文章開頭提到的，干預(yù)組只有97人最終完成了六次隨訪，故第六次隨訪和第一次之間的差別只計(jì)算該97位觀察對(duì)象。對(duì)比干預(yù)組和對(duì)照組，偏心度0.5°處MPOD值的上升有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0008）。3.2.2.根據(jù)MPOD的反應(yīng)情況我們將參與補(bǔ)充的對(duì)象分為四組，我們計(jì)算了第六次隨訪（隨訪中的最高值）和基線水平（第一次隨訪）間的差值（圖3）。排除沒有完全完成全部隨訪的觀察對(duì)象，干預(yù)

30、組中有92人進(jìn)入該分析。視網(wǎng)膜反應(yīng)最低的一組（組1）中，偏心度0.5°處平均MPOD值在基線水平為0.49（±0.049），在第六次隨訪時(shí)為0.47（±0.051），未表現(xiàn)出有意義的上升（p=0.98）。而在其他三組，表現(xiàn)出明顯的MPOD值的增加，盡管它們的基線水平存在差異。這三個(gè)反應(yīng)組最終MPOD值相似，組、組、組的最終平均值（±SEM）分別為0.59（±0.04）ODU，0.64（±0.03）ODU和0.64（±0.03）。如果用基線水平的百分?jǐn)?shù)來表示的話，組（無反應(yīng)組）的最終值比基線水平低3.1%，而組、組、組分別上升

31、11.9%，23%，50.5%。值得注意的是，雖然是根據(jù)MPOD對(duì)補(bǔ)充試驗(yàn)的反應(yīng)分組，但各組之間以下指標(biāo)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：年齡：p=0.34；基線血清L水平：p=0.67；基線血清Z水平：p=0.81；BMI：p=0.59；性別比例：p=0.32；吸煙情況：p=0.37。然而，低反應(yīng)或無反應(yīng)組的基線HDL水平明顯高于其他組：基線HDL水平(±SEM)組I=66.6（±3.3）mg/dl；組=61.6(±2.9)mg/dl、組=53.9(±3.1)mg/dl、組=53.7(±3.0)mg/dl；p=0.013。而MPOD反應(yīng)更高的組中使用抗膽

32、固醇藥物的對(duì)象比例更高（在組為45.8%），但這種關(guān)系并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.13）。3.2.3.血清L(和Z)改變和MPOD改變的關(guān)系補(bǔ)充后，比較基線和第五次隨訪時(shí)平均血清L(和Z)水平（±SEM）有明顯的上升平均血清L水平（±SEM）：基線=0.16（±0.015）g/ml,第五次隨訪=0.593（±0.042）g/ml , p<0.001；平均血清Z水平（±SEM）：基線=0.018（±0.001）g/ml,第五次隨訪=0.022（±0.001）,p=0.007。有趣的是，盡管組I 0.5°偏心度的

33、MPOD水平?jīng)]有增加，但其血清L和Z水平卻有明顯的升高，且和其他三個(gè)反應(yīng)組相似。（表3圖3：偏心度0.5°處MPOD值：根據(jù)黃斑對(duì)補(bǔ)充L,Z和抗氧化劑反應(yīng)四分組。MPOD0.5°：偏心度0.5°處黃斑色素光學(xué)密度。ODU：光學(xué)密度單位。0 周：隨訪1=基線；6 周：隨訪2；12 周：隨訪3；18 周：隨訪4；24 周：隨訪5；隨訪6，結(jié)束補(bǔ)充后3個(gè)月。n=92(完成全部隨訪的對(duì)象)。計(jì)算各組第六次隨訪（隨訪階段的最高值）和基線（隨訪1）間MPOD值的差值。 Quart I，組I（n=20）；Quart，組I（n=27）；Quart，組I（n=21）；Quart，組

34、I（n=24）。(第一次隨訪為基線，n=108)，C組為對(duì)照組（n=28）圖2：完成補(bǔ)充后補(bǔ)充組（干預(yù)組，紅色表示）和非補(bǔ)充組（對(duì)照組，藍(lán)色表示）的平均MPOD值MPOD0.5°：偏心度0.5°處黃斑色素光學(xué)密度。ODU：光學(xué)密度單位。I組為干預(yù)組（補(bǔ)充）（n=108），C組為對(duì)照組（n=28）。 0 周：隨訪1=基線，n=108；6 周：隨訪2，n=104； 12 周：隨訪3，n=102；18 周：隨訪4，n=101； 24 周：隨訪5，n=98；隨訪6，結(jié)束補(bǔ)充后3個(gè)月，n=97。（第一次隨訪為基線，n=108），C組為對(duì)照組（n=28）表3：干預(yù)組中，對(duì)補(bǔ)充L，Z和抗

35、氧化劑黃斑反應(yīng)不同的組間血清葉黃素和玉米黃質(zhì)濃度的改變（只包括完成全部隨訪的對(duì)象），校正了年齡和性別因素。QuartileI n =20 QuartileII n = 27 QuartileIII n = 21 Quartile IV n =24(mean + SEM) (mean + SEM) (mean + SEM) (mean + SEM)Lutein (mg/ml) 0.56 + 0.08 0.37 + 0.07 0.40 + 0.08 0.43 + 0.08Zeaxanthin (mg/ml) 0.009 + 0.003 0.005 + 0.003 0.001+ 0.003 0.00

36、7 + 0.003Changes in serum concentrations of L and Z were statistically similar for the four quartiles (one-way ANOVA: serum L: p =0.35; serum Z: p = 0.13).最終，在本試驗(yàn)階段整個(gè)干預(yù)組MPOD水平的上升和血清Z濃度并無相關(guān)性（r=0.08；p=0.44），同樣的與血清L濃度亦無相關(guān)性（r=-0.01，p=0.98）。在本研究階段，組I的血清L(和Z)的改變與MPOD值不相關(guān)（血清L:r=-0.0621，p=0.7682；血清Z：r=0.071

37、1，p=0.7355）。同樣的組、組中血清L或Z的改變和MPOD值也無明顯相關(guān)性（p值均大于0.05）。然而，在組中，MPOD值的改變與血清Z濃度呈正相關(guān)（r=0.5772，p=0.0025），但是跟血清L水平改變無關(guān)（r=0.3177，p=0.1217）。3.2.4.基線HDL水平和血清L和Z濃度在補(bǔ)充對(duì)象中，其基線血清HDL濃度與血清Z濃度呈正相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.2735，p=0.0044），但和血清L濃度不相關(guān)（r=0.1251，p=0.1990）。補(bǔ)充試驗(yàn)后血清L和Z的反應(yīng)性改變與基線HDL水平無關(guān)（血清L：r=0.0338，p=0.7345；血清Z：r=-0.085， p=

38、0.4104）。然而分析亞組間（通過黃斑對(duì)補(bǔ)充L,Z和抗氧化劑反應(yīng)分組）HDL和L,Z關(guān)系時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在有反應(yīng)的組：組、組、組中，無論是基礎(chǔ)血清L（或Z）水平，還是補(bǔ)充后血清L(或Z)的改變都和基線的HDL水平無關(guān)（p值皆大于0.05）。但是，無反應(yīng)組（組I），基線的血清HDL濃度和基線血清Z濃度呈正相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.5705，p=0.0029）。但是基礎(chǔ)血清HDL濃度和在補(bǔ)充階段內(nèi)觀測(cè)到的血清Z濃度的上升呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)果接近統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.3960，p=0.05）。相反，基礎(chǔ)血清HDL濃度與基礎(chǔ)血清L濃度和血清L濃度改變之間沒有明顯的相關(guān)性。4. 討論4.1 基線結(jié)果LUN

39、A（自發(fā)熒光法測(cè)定葉黃素療效）研究是用來研究飲食補(bǔ)充黃斑類胡蘿卜素和抗氧化劑對(duì)血清L和Z濃度和MPOD的影響。與其他研究一致，我們發(fā)現(xiàn)基線血清L(和Z)濃度和MPOD呈正相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，我們得出的MPOD值和血清HDL濃度呈正相關(guān)性是新的發(fā)現(xiàn)。先前一個(gè)大樣本（n=138）研究觀察到男性中MPOD和HDL存在弱的相關(guān)性（r=0.07；p>0.05），但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在該研究中女性的結(jié)果則是相反的（也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。我們的結(jié)果與該項(xiàng)研究的其中部分結(jié)果是一致的。雖然烴化類胡蘿卜素發(fā)現(xiàn)主要是存在于脂蛋白的LDL部分，L和Z則平均分布于HDL和LDL中。所以，假定我們和其他研究報(bào)道

40、的血清L(和Z)濃度和MPOD的正相關(guān)性是存在的，那么MPOD和血清HDL濃度存在正相關(guān)性可能也并不奇怪。在LUNA研究中，我們發(fā)現(xiàn)男性和女性的基線甘油三脂濃度和基線MPOD值皆呈負(fù)相關(guān)，這與Broekmans等人在男性中的結(jié)果相一致（r=-0.18；p<0.05），事實(shí)上，該研究發(fā)現(xiàn)在女性中是呈正相關(guān)的（r=0.17；p<0.05）。就我們所知，再?zèng)]有其他的文獻(xiàn)研究這些參數(shù)之間的相關(guān)性。作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)，硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（TBA-RS）水平與血漿甘油三酯呈正相關(guān)，而與血漿類胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)。的確，血漿中TBA-RS水平可精確反映過氧化物質(zhì)的水平，但其水平可被類胡蘿卜素

41、所修正。所以，TBA-RS與甘油三酯呈正相關(guān)，而相對(duì)的與血清L和Z濃度呈負(fù)相關(guān)。這可以解釋我們發(fā)現(xiàn)的甘油三酯和MPOD之間顯著的負(fù)相關(guān)性。4.2對(duì)補(bǔ)充L,Z和抗氧化劑的反應(yīng)42.1. MPOD在LUNA研究中，干預(yù)組的平均MPOD增加值為0.1（±0.009）ODU,相較與基線值上升了15.9%。在各次隨訪間MPOD值的百分變化率如下：最初的衰減在第二次隨訪中觀測(cè)到（在隨訪1和隨訪2間減少了1.8%），此后從第二次隨訪到第三次上升了3.2%，第三次到第四次上升7.8%，第四到第五為1.8%，第五到第六為4.1%（第一次隨訪到第五次隨訪時(shí)間間隔為6周，而第五次和第六次間間隔3個(gè)月）。這

42、些結(jié)果與先前的研究結(jié)果大致相同。Berendschot 等 (2000)（n=8，10mg L/day，使用488和514nm波長氬激光獲得眼底反射圖）顯示MPOD在平均四周的時(shí)間段內(nèi)增長了5.3%。Landrum等（1997）n=2，30mg L/day：異色光閃爍光測(cè)光法（HFP）報(bào)道在4周的補(bǔ)充試驗(yàn)后MPOD增長了4.2%，同時(shí)也報(bào)道了MPOD在停止補(bǔ)充后40-50天內(nèi)仍持續(xù)增長然后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。葉黃素抗氧化劑補(bǔ)充試驗(yàn)（LAST）（n=90，10mg L/day,HFP）顯示相較與基線水平平均MPOD值的增長接近0.09log單位，在一年后增長了36-43%。Koh等（2004）（n=

43、13，20mg L酯/day ,HFP ）報(bào)道MPOD的平均增長值為0.07ODU（35%）。Hammond等（1997）（n=11， 10.8mg L/day, 0.3mg/day Z 和5mg/day 胡蘿卜素，n=10另加0.3mg Z,0.4mg L，n=2只有0.3mg Z,04mg L；使用HFP法測(cè)定11位患者的MP）觀測(cè)到補(bǔ)充四周后MPOD的變化，并描述了“視網(wǎng)膜無反應(yīng)”的現(xiàn)象：只有血清L濃度的增加（平均為31%）而不表現(xiàn)MPOD的增加（平均：-11%）。在我們的研究中，MPOD的增加一定程度上慢于先前的研究，至少在停止補(bǔ)充的三個(gè)月后還保持持續(xù)增長的狀態(tài)。當(dāng)然，我們的發(fā)現(xiàn)和先前

44、報(bào)道的在停止補(bǔ)充或改變飲食后MPOD值持續(xù)擴(kuò)增的結(jié)果相一致，提示類胡蘿卜素在視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)率很慢。換句話說，盡管MPOD的擴(kuò)增需要較高濃度的L和Z，但維持MP提升了的水平只需要較低濃度的維持量即可。在對(duì)照組中，只發(fā)現(xiàn)微量的無意義的MPOD的擴(kuò)增。再一次與先前的研究相符：在停止飲食調(diào)節(jié)和補(bǔ)充后一段較長的時(shí)間內(nèi)MPOD值保持穩(wěn)定，盡管血清L和Z濃度有波動(dòng)。干預(yù)組的組I并未觀測(cè)到NPOD值的增加，盡管其血清L和Z濃度明顯的升高，且與反應(yīng)組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是相似的。這個(gè)結(jié)果提示吸收障礙或是血清中轉(zhuǎn)運(yùn)體系的損害并不是“視網(wǎng)膜無反應(yīng)者”補(bǔ)充后MPOD值無擴(kuò)增的原因，而與視網(wǎng)膜獲取和/或保持L或Z穩(wěn)定性的障礙是造成

45、黃斑對(duì)補(bǔ)充L、Z和抗氧化劑無反應(yīng)的觀點(diǎn)符合。我們研究中組I與Hammond等的“視網(wǎng)膜無反應(yīng)者”相符，而且該組中的觀察對(duì)象和“視網(wǎng)膜反應(yīng)者”在其他推測(cè)與MPOD相關(guān)的變量（如血清L(和Z)濃度，BMI，年齡，性別，吸煙情況）上并無差別，這提示如果補(bǔ)充L和Z的確實(shí)有效的話，那么其對(duì)存在部分或全部上述危險(xiǎn)因素的對(duì)象也是有效的。事實(shí)上，只有HDL的基線濃度和MPOD對(duì)補(bǔ)充試驗(yàn)的反應(yīng)有相關(guān)性，在低或無黃斑反應(yīng)組內(nèi)HDL有更高的濃度。這個(gè)結(jié)果可能可以用降膽固醇藥物的使用來解釋。比如，如果HDL在轉(zhuǎn)運(yùn)L和/或Z上有重要作用，在基線上可反應(yīng)為與MPOD值存在正相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，那么使用降膽固醇的藥物（可

46、提高HDL水平）可表現(xiàn)為對(duì)補(bǔ)充L和Z更強(qiáng)的反應(yīng)性，正如我們?cè)谶@里展示的一樣（盡管無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。的確，組（最高反應(yīng)性）基線水平的MPOD值較低，而且有45.8%的觀察對(duì)象有長期的降脂治療史，也與該假說相符。但是，為什么高的基線HDL水平和低的視網(wǎng)膜反應(yīng)性相關(guān)（事實(shí)上在低或無反應(yīng)組其濃度明顯更高）我們并不能很好的解釋。據(jù)我們所知，到目前為止還沒有研究觀測(cè)過基線MPOD值和對(duì)補(bǔ)充反應(yīng)情況的相關(guān)性，盡管有一個(gè)研究討論了補(bǔ)充后MPOD的增加與血清L和Z濃度的增加相關(guān)，但并沒有提及基線MPOD水平。我們發(fā)現(xiàn)在干預(yù)組中MPOD值增加最大的對(duì)象組（組）表現(xiàn)為最低的基線MPOD水平；然而，組I(“視網(wǎng)膜無反應(yīng)

47、者”)也表現(xiàn)為第三低的基線MPOD水平（平均：0.48ODU）。換句話說，那些表現(xiàn)為低基線MPOD水平的對(duì)象，對(duì)于補(bǔ)充L和Z反應(yīng)更容易表現(xiàn)為MPOD的顯著性增加，或是無MPOD的改變。對(duì)于這個(gè)貌似矛盾的結(jié)果一個(gè)合理的解釋是基于反應(yīng)的二分法，它依次解釋了低基線MPOD水平的因果關(guān)系。換句話說，“視網(wǎng)膜反應(yīng)者”表現(xiàn)為低基線MPOD水平可簡單的解釋為飲食攝入L和Z的不足，而“視網(wǎng)膜無反應(yīng)者”表現(xiàn)為低基線MPOD水平可解釋為控制視網(wǎng)膜吸收和穩(wěn)定黃斑類胡蘿卜素的體系受損?！胺磻?yīng)組”在第六次隨訪時(shí)的MPOD值非常接近，盡管其基線水平存在差異。這個(gè)結(jié)果提示LUNA研究中所使用的補(bǔ)充量已經(jīng)是視網(wǎng)膜獲取和穩(wěn)定黃斑類胡蘿卜素的體系達(dá)到了飽和狀態(tài)，這和視網(wǎng)膜攝入L和Z是通過葉黃素結(jié)合蛋白（XBPs）介導(dǎo)的觀點(diǎn)一致，而后者存在飽和性。4.2.2血清對(duì)補(bǔ)充L，Z,和抗氧化劑的反