生物醫(yī)學(xué)光學(xué)技術(shù)

1、生物醫(yī)學(xué)光學(xué)技術(shù)摘 要：隨著生物分子光學(xué)標(biāo)記技術(shù)的不斷進步，光學(xué)技術(shù)在揭示生命活動基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來越重要的作用，也為醫(yī)學(xué)診斷與治療提供了更多、更有效的手段。本報告首先簡要介紹光學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的發(fā)展概況，然后從基因表達及蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究方面，討論生物分子光學(xué)技術(shù)的特點與優(yōu)勢，闡明基于分子光學(xué)標(biāo)記的光學(xué)成像技術(shù)是重要的實時在體監(jiān)測手段，最后討論光學(xué)成像技術(shù)在組織功能/腦功能成像中的應(yīng)用原理與現(xiàn)狀。 關(guān)鍵詞：光學(xué)技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷與治療、分子光子學(xué)、醫(yī)學(xué)成像 一、生物醫(yī)學(xué)光學(xué)發(fā)展概況 生物醫(yī)學(xué)光學(xué)（Biomedical Optics）是近年來受到國

2、際光學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的研究熱點，在生物活檢（使用光學(xué)相干弱層析成像技術(shù)OCT）、光動力治療（PDT）、細胞結(jié)構(gòu)與功能檢測（運用激光共焦掃描顯微鏡）、基因表達規(guī)律的在體觀測（運用熒光基因標(biāo)記技術(shù)）等問題上取得了可喜研究成果，目前正在從宏觀到微觀多層面上對大腦活動與功能進行研究。Science在最近幾年已發(fā)表相關(guān)論文近20篇。隨著光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)光學(xué)將在多層次上對研究生物體特別是人體的結(jié)構(gòu)、功能和其他生命現(xiàn)象產(chǎn)生重要影響。 二、生物分子光學(xué)技術(shù) 細胞重大生命活動的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)核酸等）相互作用來實現(xiàn)的。深入研究基因表達及蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用不僅能

3、揭示生命活動的基本規(guī)律，同時也能深入了解疾病發(fā)生的分子機制，進而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設(shè)計的效率提供新的思路。 （一）現(xiàn)代分子生物學(xué)在研究基因表達和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用中的局限性 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞和動物模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、腫瘤細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。 然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理

4、過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相互作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些瞬時、動態(tài)、可逆的變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于活體、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法非常必要。 光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了現(xiàn)實與可能。因此，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在活體動物體內(nèi)，如何實現(xiàn)基因表達及蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的實時在體成像監(jiān)測是當(dāng)前迫切需要解決的重大核心科學(xué)技術(shù)問題！這是也生物學(xué)、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大

5、基礎(chǔ)問題。對這一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認識疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)（光子醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)）等產(chǎn)生重大影響。 （二）基于分子光學(xué)標(biāo)記的光學(xué)成像技術(shù)是重要的實時在體監(jiān)測手段 光學(xué)成像技術(shù)正成為實時在體研究分子間/分子內(nèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用、離子通道、細胞膜蛋白及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生化底物及酶轉(zhuǎn)運等的重要手段，由于具有高時間、空間分辨率，比現(xiàn)有其他手段更為直接，因而可望成為后基因組時代新藥靶發(fā)現(xiàn)和高通量藥物篩選的新方法。 表1和表2分別給出了目前處于研究和應(yīng)用階段的幾種主要成像技術(shù)的應(yīng)用場合及參數(shù)比較。比較相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分

6、子光學(xué)標(biāo)記的光學(xué)成像技術(shù)已經(jīng)在活體動物體內(nèi)基因表達規(guī)律方面展示了有較大的優(yōu)勢。 例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率：1-2mm，時間分辨率：分鐘量級。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者比較，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如大鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像，例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達到近10cm的測量深度（Nature Reviews 

7、;2002）；基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像（Nature Medicine 2001）。 表1 主要成像技術(shù)及應(yīng)用場合（Nature Reviews 2002） 成像方法 主要應(yīng)用場合 磁共振成像（MRI） 高對比度，用于表型、生理成像和細胞跟蹤的最好的全方位成像系統(tǒng)。計算機層析成像（CT） 肺和骨癌成像 超聲成像 血管和介入成像 正電子發(fā)射斷層成像PET 分子代謝，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像 單光子發(fā)射斷層成像SPECT 探針，如抗體，肽等的

8、成像 熒光反射成像FRI 表面腫瘤分子事件的快速成像 熒光介導(dǎo)層析成像FMT 對深部腫瘤靶向標(biāo)記或“靈活的”熒光染料標(biāo)記進行定量成像 生物發(fā)光成像BLI 基因表達，細胞追蹤成像 活體顯微成像 以更高分辨率實現(xiàn)上述所有參數(shù)成像，但測量深度和范圍有限。 雖然在體光學(xué)成像技術(shù)在時/空分辨、實時、動態(tài)和多參數(shù)測量等方面有一定的優(yōu)勢，但仍然有大量的技術(shù)問題需要研究。例如，從光學(xué)標(biāo)記角度看，如何針對所要研究的體系和對象，為實現(xiàn)在活細胞和動物體內(nèi)監(jiān)測基因表達及蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)展特異性更高、更易于光學(xué)測量的核酸和蛋白質(zhì)探針，是當(dāng)前要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。 表

9、2 常用成像技術(shù)及參數(shù)比較（Nature Reviews 2002） 成像方法 空間分辨率 時間分辨率 測量深度 造影劑 價格 m Min/hrs 無限制 釓，鏑和氧化鐵離子 $mMRI 10-100 m Min 無限制 碘 $mCT 50 m Min mm 微型氣泡 $m超聲 50 PET 1-2mm Min 無限制 18F，

10、11C，15O $ SPECT 1-2mm Min 無限制 99mTc（亞穩(wěn)態(tài)锝）, 111In（銦） $ 熒光反射成像FRI 1-2mm Sec/min <1cm 熒光蛋白，近紅外熒光染料 $ 熒光介導(dǎo)層析成像FMT 1-2mm Sec/min <10cm 近紅外熒光染料 $ 生物發(fā)光成像BLI 幾mm Min cm 螢光素 $ m Sec/min

11、60;m活體顯微成像 1<m 熒光蛋白，發(fā)光蛋白，近紅外熒光染料 $m400 其中：$表示價格<10萬美元；$表示價格在10-30萬美元之間；$表示價格>30萬美元 表3簡要介紹了近幾年發(fā)展十分迅速、正受學(xué)術(shù)界高度關(guān)注的幾種研究活細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學(xué)過程的光學(xué)成像技術(shù)的基本原理與特點，主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、熒光壽命成像（FLIM）、熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）、熒光漂白后定位（FLAP）、熒光關(guān)聯(lián)譜（FCS）和成像關(guān)聯(lián)譜（ICS）等。如何發(fā)展和整合相關(guān)的成像方法，并應(yīng)用于在體成像，為基因表達和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究

12、提供更先進的手段，也應(yīng)是本項目研究的關(guān)鍵技術(shù)問題。 在數(shù)據(jù)處理與可視化研究方面，也存在重大的科學(xué)問題。例如，對于600微米左右的熒光，雖然可以穿透較厚的組織而被探測到，但由于經(jīng)過了多次散射，如何定位發(fā)光位置，需要根據(jù)生物組織中的光子傳輸規(guī)律，通過圖像重建算法來實現(xiàn)，事實上這方面的研究已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的研究熱點。例如，基于成像測量（包括光學(xué)成像）的分子與細胞事件動力學(xué)過程的可視化研究被評為2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。 表3 活體細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學(xué)過程的實時在體光學(xué)成像技術(shù) 名稱 原理

13、與應(yīng)用 熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRETFluorescence Resonance Energy Transfer 供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。FRET可用于測量分子內(nèi)部間距，或蛋白質(zhì)的不同反應(yīng)活性部位、模型系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、或細胞表面蛋白質(zhì)等分子之間的距離。即可測量分子間的接近度，距離，方位和動力學(xué)特性。由于FRET效率與供體受體間的距離成6次冪的關(guān)系，所以FRET效率對距離的變化非常靈敏，可以靈敏測量10Å-100Å范圍內(nèi)的距離變化。 熒

14、光壽命成像FLIMFluorescence Lifetime IMaging 熒光壽命成像顯微鏡和壽命測量與熒光濃度或激發(fā)強度的變化無關(guān)，F(xiàn)RET與FLIM的結(jié)合可提供高的空間（納米）和時間（納秒）分辨率。通過供體壽命測量和處理時間分辯圖像，可精確計算相互作用的蛋白質(zhì)間的距離。由于只測量供體熒光壽命，在FRETFLIM成像中，可不考慮光譜的交疊問題。 熒光漂白（后）恢復(fù) FRAPFluorescence Recovery After Photobleaching FRAP是研究蛋白質(zhì)動力學(xué)的重要工具。在FRAP實驗

15、中，利用激光脈沖有針對性對被熒光蛋白標(biāo)記的細胞內(nèi)的一個小區(qū)域快速、不可逆地漂白。該漂白區(qū)域完全沒有熒光信號。然后使用延遲顯微鏡測量熒光信號隨時間的恢復(fù)情況。熒光的恢復(fù)是由未漂白的分子流入被漂白區(qū)域所造成的。因此熒光信號恢復(fù)的動力學(xué)過程含有了被標(biāo)記蛋白的表觀遷移信息。 熒光漂白（后）定位 FLAPFluorescence Localization After Photobleaching FLAP是在活細胞內(nèi)對特定分子的光學(xué)標(biāo)記進行定位和跟蹤的新方法。被定位的分子包括兩個熒光基團：一個被漂白，另一個則作為參考標(biāo)記。與熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）和熒

16、光漂白中的損耗（FLIP）技術(shù)不同，利用參考熒光基團，通過簡單的圖像差異，即可跟蹤光學(xué)標(biāo)記分子自身的分布。因此，F(xiàn)LAP實際上可與光敏化方法相對比。與籠鎖熒光探針方法相比，其主要優(yōu)點是可用于跟蹤細胞直接表達的嵌合熒光蛋白。 熒光關(guān)聯(lián)譜 FCS¬Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS可用于分析小規(guī)模分子集合輻射行為所引起的微小的自發(fā)擾動，從而反映分子內(nèi)與分子間的動力學(xué)過程。由于FCS可觀察納摩爾（nanomolar）范圍的熒光分子，因而可在大的空間與時間范圍內(nèi)，非常近似地模仿不同過程中的實際生理條件，如

17、結(jié)合與離解反應(yīng)，生化底物的轉(zhuǎn)運、酶的周轉(zhuǎn)，分子內(nèi)（如結(jié)構(gòu)）的動力學(xué)過程等。FCS的時間分辨率也可以達到納秒（ns）量級。 成像關(guān)聯(lián)譜 ICSImaging Correlation Spectroscopy ICS為測量活細胞表面分子內(nèi)相互作用的動力學(xué)過程提供了一種新的方法，還可以幫助闡明細胞膜上蛋白質(zhì)的聯(lián)合是如何激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的。ICS可測量分布在細胞表面的單個分子的密度、分子群、有組織的結(jié)構(gòu)或功能區(qū)。該技術(shù)可探測單個分子的空間分辨率約為200平方微米。由于與分子的總數(shù)目有關(guān)，因此可用于估計單分子實體（molecular entity）中的平

18、均分子數(shù)目。 國際同行對動物活體內(nèi)基因表達與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的在體光學(xué)成像研究也非常重視。例如，美國NIH已經(jīng)召開過三次研討會，認為新的在體生物光子學(xué)方法可用于癌癥和其它疾病的早期檢測、診斷和治療。新一代的在體光學(xué)成像技術(shù)正處在從實驗室轉(zhuǎn)向癌癥臨床應(yīng)用的重要時刻。在NIH的支持下，NCI（美國國家癌癥研究所）正在計劃5年投資1800萬美元，招標(biāo)建立“在體光學(xué)成像和/或光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化研究網(wǎng)絡(luò)（NTROI）”，其研究內(nèi)容主要包括：光學(xué)成像對比度的產(chǎn)生機理、在體光學(xué)成像技術(shù)與方法、臨床監(jiān)測、新光學(xué)成像方法的驗證、系統(tǒng)研制與集成等五個方面。美國NIH于2000年底成立了的國家生物醫(yī)學(xué)影像與生物工程研

19、究所（NIBIB）,在其首批支持的項目中，光學(xué)成像方法約占30%。2000年7月，美國NIH投資2000萬美元，開展小動物成像方法項目（SAIRPs）研究，受到生命科學(xué)界的高度關(guān)注，其中光學(xué)成像方法也是其中的研究重點之一。NSF 在2000-2002年發(fā)布了四次Biophotonics Partnership Initiative 招標(biāo)指南，呼吁開展多學(xué)科的合作研究。 （三）研究熱點與發(fā)展趨勢 從前面的討論中可以看出，研究熱點與發(fā)展趨勢應(yīng)包括如下三個方面： 1. 生物分子的光學(xué)標(biāo)記新技術(shù)研究。針對所研究的體系和對象，發(fā)展具有高度特異性的、可用于

20、生物體內(nèi)活體成像的核酸和蛋白質(zhì)探針。例如研制新的發(fā)光蛋白用于動物模型體內(nèi)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的表達成像研究；設(shè)計并合成新型的具有高特異性的核酸探針，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活體監(jiān)測；發(fā)展在活體細胞內(nèi)監(jiān)測蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用的新方法；發(fā)展新的表面修飾和標(biāo)記方法，將熒光納米顆粒作為探針，用于活體細胞和動物器官的基因表達和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)實時在體光學(xué)成像研究。 2. 在體光學(xué)成像新技術(shù)與應(yīng)用研究。針對不同的研究對象和應(yīng)用目標(biāo)，發(fā)展各種新型的在體光學(xué)成像技術(shù)。例如實現(xiàn)小動物體內(nèi)深部目標(biāo)探測的擴散光學(xué)成像方法；實現(xiàn)動物體內(nèi)藥代動力學(xué)和藥理學(xué)過程的實時在體成像監(jiān)測的相干域光學(xué)成像方法；實現(xiàn)對動物體內(nèi)基

21、因表達和分子間相互作用過程在體成像監(jiān)測的多光子熒光等非線性光學(xué)成像方法；實現(xiàn)不同層次多參數(shù)測量的集成化在體光學(xué)成像系統(tǒng)；以及無須外源性標(biāo)記的各類在體功能成像方法等。應(yīng)用研究包括：a) 以小動物為研究對象，在動物體內(nèi)不同部位（如肺、肝、腦等）的腫瘤模型或其它疾病模型基礎(chǔ)上，研究在體基因表達規(guī)律，監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的動力學(xué)過程；對活體動物體內(nèi)分子與細胞事件進行定量成像研究，例如通過熒光標(biāo)記蛋白的互補與重組策略，結(jié)合生物發(fā)光光學(xué)成像技術(shù)，可以實現(xiàn)對活體內(nèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的定量無損成像，從而有望提供一種有潛在價值的工具，對研究處于自然在體狀態(tài)環(huán)境下的細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用、對以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用為靶標(biāo)的新藥的在體評估都具有非常重要的意義。動物組織、器官到整體水平的在體光學(xué)