SDS-PAGE電泳過程中常見問題以及解決方法

1、SDSPAGE電泳過程中常見問題以及解決方法幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所有條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并進可能減少其相互間的聚集，最常用的就是SDSPAGE電泳技術，關于大家在此過程中經常遇到的問題進行一些討論：Q：SDSPAGE電泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結合。當分子量

2、在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？A：在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成

3、導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？A：根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1、還原SDS處理：

4、在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被

5、破壞，不可作為測定分子量來使用。Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置

6、一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質電泳技術手冊P82-103。Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？A：主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現拖

7、尾現象？A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現紋理現象？A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是“鬼帶”，如何處理？A：“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的

8、免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。Q：為什么溴酚藍不能起到指示作用？A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？A：這種現象一般初學者易出現。

9、比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？A：這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。簡介聚丙烯酰胺凝膠電泳作用：用于分離蛋白質和寡糖核苷酸。      作用原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：（1）非變性

10、聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態(tài)，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。 而SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由Shapiro于1967年建立，他們發(fā)現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?。 作用SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被

11、解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。 SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最

12、大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。 此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。 補充信息聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamde gel electrophoresis）    聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合

13、法?；瘜W聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。 PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠

14、是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。 過程蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用

15、。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變，蛋白質SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為18A，這樣的蛋白質SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質SDS復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯

16、酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用于提純過程中純度的檢測，純化的

17、蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。 常見問題及分析1. 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？ 在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者

18、之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。 2. 樣品如何處理？ 根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1）還

19、原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑

20、，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 3. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關； 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。 4. 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做

21、法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質電泳技術手冊P82-103。 5.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ 主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。 6. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加

22、入適量緩沖液，以排除氣泡。 7. 為什么帶出現拖尾現象？ 主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。 8. 為什么帶出現紋理現象？ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 9. 什么是“鬼帶”，如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目

23、標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 10. 為什么溴酚藍不能起到指示作用？ 我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 11. 為什么電泳的條帶很粗？ 電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；

24、 12. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？ 這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 13. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？ 這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。 14. 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？ 通常膠在30MIN-1H內凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，A

25、PS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。 15. 電泳時間比正常要長？ 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。電泳相關溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：稱取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，過濾，4攝氏度保存一個月。2、 5×SDS電極緩沖液：稱取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g加dH2O定容至1000ml。3、2×樣品緩沖液（10ml）：甘油2ml，溴酚藍0.0202g，1MTris·Cl（pH6.8）1ml巰基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。4、染色液的配制（1000ml）:  用量筒分別量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在電子天平上稱取0.125%考馬斯亮藍R250 1.25g，再將其一一加到1000ml錐形瓶中，用蒸餾水加以補足至1000ml。加入的先后順序為：考馬斯亮藍R250，甲醇或者乙醇，蒸餾水，乙酸。充分混勻后進行過濾，收集濾液備用。當過濾速度變慢時要更換濾紙，快速過濾完，不可隔夜以免影響染色效果。5、脫色液（1000ml