《煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續(xù)流動法》

1、煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續(xù)流動法標準項目技術報告項目組2013年8月目 錄1、項目概述22、方法原理23、材料與試劑24、實驗方法45、結果與討論46、結論101、項目概述淀粉是煙草及煙草制品中重要的化學成分1。在卷煙燃燒時，淀粉的燃燒和碳化能夠帶來感官質量的不良影響，因此，測定調制前后煙葉中的淀粉是評價煙草品質的重要指標之一。目前煙草行業(yè)現(xiàn)行有效的淀粉測定標準方法有：YC/T 216-2007煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續(xù)流動法2和YC/T 283-2009煙草及煙草制品 淀粉的測定 酶水解-離子色譜法3。由于酶水解法操作步驟多，處理時間長，檢測效率低，不適宜于大批量煙草樣品中淀粉含

2、量的測定；而YC/T 216-2007標準方法樣品前處理相對簡單、檢測效率高，適合大批量煙草樣品中淀粉含量的測定。為了準確快速測定煙草及煙草制品中淀粉的含量，項目組對現(xiàn)行淀粉測定方法YC/T 216-2007進行了研究分析，認為：樣品干擾物質的去除方法可以用超聲萃取方式可以替代85水浴方式，40%高氯酸提取淀粉方法超聲效果好于靜置方式，且煙末樣品需要多次轉移，這些步驟可能給檢測結果帶來的偏差。為使YC/T 216-2007標準方法更具實際可操作性，項目組研制了煙草淀粉測定過程樣品處理一體化裝置G3燒結玻璃砂芯漏斗，該裝置實現(xiàn)干擾物質去除和淀粉的超聲提取過程不需要轉移煙末樣品，使得樣品前處理方法

3、操作更加簡便，更符合行業(yè)批量測定煙草中淀粉的需求。項目組研制了煙草淀粉分析一體化實驗裝置，通過實驗考察了超聲對淀粉測定的影響，優(yōu)化了樣品超聲去除干擾時間和淀粉萃取方式，并進行了樣品加標回收率實驗，方法重復性實驗。結果表明：實驗方法能夠替代YC/T 216-2007標準方法進行煙草及煙草制品中淀粉的測定，使淀粉分析方法更加符合行業(yè)發(fā)展實際需要。2、方法原理用80乙醇-飽和氯化鈉溶液超聲去除煙草樣品中干擾物質，直接過濾后用40% 高氯酸超聲提取煙草中的淀粉，然后淀粉在酸性的條件下與碘發(fā)生顯色反應，在570nm進行比色測定。3、材料與試劑3.1 儀器3.1.1 G3燒結玻璃漏斗。3.1.2燒杯，25

4、0mL3.1.3容量瓶，500ml、250ml、100ml和50ml。3.1.4三角瓶，50mL。3.1.5電子天平（德國Sartorius公司，感量0.0001g）。3.1.6 KQ-700DB超聲波發(fā)生器（江蘇昆山超聲儀器公司）3.1.7 AA3型連續(xù)流動分析儀，BRAN+LUEBBE公司，由下述各部分組成：取樣器；比例泵；滲析器；螺旋管；比色計，配570nm濾光片；3.1.8 HP8453分光光度計，美國 Agilent 公司。3.2 試劑3.2.1高氯酸溶液（72%）3.2.2高氯酸萃取液（40%）移取300ml高氯酸溶液（4.1），溶解于224ml水中。3.2.3高氯酸萃取液（15%

5、）移取52ml高氯酸溶液（4.1），溶解于198ml水中。3.2.4碘/碘化鉀溶液稱取5.0g碘化鉀和0.5g碘于400ml燒杯中，用玻棒研磨粉碎混合均勻，加入少量水溶解，待完全溶解后，轉入250ml容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.5 80%乙醇-飽和氯化鈉溶液稱取64g氯化鈉，溶于200ml水中，加入800ml無水乙醇，溶解，靜置待溶液澄清后過濾。3.2.6標準溶液（1）儲備液分別稱取0.15g直鏈淀粉和0.60g支鏈淀粉于燒杯中，精確至0.0001g。直鏈淀粉加入1.0g氫氧化鈉后用水煮沸溶解，支鏈淀粉用水煮沸溶解。分別轉入500ml容量瓶中，用水定容至刻度。標準儲備液應貯存于04條件下

6、，可至少穩(wěn)定1個月。（2）工作標準液分別移取直鏈淀粉儲備液30mL和支鏈淀粉儲備液30mL于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，得到儲備液A。分別移取不同體積的儲備液A于不同的50mL 容量瓶（其濃度范圍應覆蓋檢測到的樣品含量），分別加入2.5mL高氯酸萃取液（4.2）于50ml容量瓶中，用水定容至刻度。由儲備液A至少制備5個工作標準液，即配即用。3.3 材料 烤煙（產地：河南宜陽、等級C3F）、白肋煙（產地：湖北恩施、等級C2F）、香料煙（產地：云南保山、等級AB）、烤煙型卷煙（黃金葉、河南中煙、焦油11mg）、混合型卷煙（中南海、上海煙草集團、焦油5mg）。4、實驗方法將煙葉樣品于40下烘

7、2 h，粉碎，過40目篩。稱取0.25g（0.0001g），置于G3燒結玻璃漏斗中，加入25mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，室溫下超聲萃取30 min，去除樣品干擾物質，棄去濾液，濾渣中加入15 mL 40（體積分數(shù)）高氯酸溶液，室溫下超聲萃取10min，然后加入15 mL純水，過濾，濾液接收于50 mL三角瓶，然后再移取5mL淀粉提取溶液于50mL容量瓶中，用純水定容，搖勻。即可進行分光光度法8和連續(xù)流動法測定。5、結果與討論5.1 實驗裝置的研制 為使樣品前處理更加簡單和可操作性，設計了一種G3燒結玻璃砂芯漏斗，如圖1所示。該裝置采用80%乙醇-氯化鈉飽和溶液超聲去除樣品干擾物質，過濾后

8、再用40%高氯酸超聲提取煙草中淀粉，然后再進行連續(xù)流動法測定。該裝置能夠實現(xiàn)樣品干擾物質的去除和淀粉的提取，整個過程不需要轉移煙末樣品，避免樣品損失；而且在干擾物質去除和淀粉提取過程采用超聲方式，使操作更加簡單易行；同時，該裝置可以配置加壓裝置，可以加快過濾速度。圖1 G3燒結玻璃砂芯漏斗示意圖5.2 標準溶液中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例煙草中的淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉構成，一般認為二者的比例為2：8，不同的煙草類型和品種、部位等均會影響二者的比例1。直鏈淀粉遇碘呈藍色，最大吸收波長為610nm，支鏈淀粉遇碘呈紫紅色，最大吸收為550nm。由不同比例的直鏈淀粉和支鏈淀粉配制標準溶液，所得溶液的最

9、大吸收波長、標準曲線的斜率均不相同。因此，在實際樣品的測定中，標準溶液中直鏈和支鏈淀粉的比例直接影響測定結果。由此確定標準溶液中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例為2：8，此時最大吸收波長為575nm。5.3 超聲對碘-淀粉顯色特性的影響 取一定濃度36 mg/L的淀粉工作標準液分別超聲5、10、20、30、50、60min，按實驗方法進行吸光度測定，結果見表1。表1 超聲作用對碘-淀粉顯色特性的影響時間/min51020305060RSD/測定值mg/L35.9336.0835.9136.136.1236.110.26從表1可以看出，隨著超聲作用時間的增加，碘-淀粉顯色反應的測定結果未發(fā)生顯著變化（R

10、SD=0.26%），表明：淀粉溶液經超聲作用后，與碘發(fā)生顯色反應，該溶液的吸光度不隨超聲作用時間而變化。5.4煙草中干擾物質的去除煙草中含有植物色素和醌類等有顏色的物質，對碘-淀粉顯色物的比色測定產生干擾，因此必須把它們除去或絕大部分除去，才能消除其干擾6。煙草樣品中干擾物質去除，RJ雷諾公司7采用75%甲醇-氯化鈉飽和溶液72提取30min，YC/T 216-2007采用80%乙醇-氯化鈉飽和溶液85提取30min，兩者均采用醇溶液水浴方式去除干擾物質，以及較高的溫度可以使煙草組織中的淀粉顆粒溶脹散開，便于淀粉的提取，但兩者操作過程較為繁瑣。5.4.1 去除干擾物質方式的改進為使樣品前處理操

11、作簡便，實驗考察了超聲和水浴兩種方式去除樣品中干擾物質。選擇烤煙、白肋煙和香料煙為實驗樣品，加入25 mL 80乙醇-氯化鈉飽和溶液，分別采用85水浴和超聲作用30min兩種方法，進行干擾物質去除，再用40%高氯酸靜置提取煙草中的淀粉，移取1mL淀粉萃取溶液于10mL容量瓶中，定容，搖勻；以去離子水為參比，用分光光度法測定試液的吸光度A0，結果見表2。表2 去除干擾物質方式的選擇樣 品比色法水浴超聲烤 煙吸光值/A00.014010.013430.011090.013790.012420.01203白肋煙吸光值/A00.020360.020650.021350.020360.019350.02

12、132香料煙吸光值/A00.022450.025540.021270.021420.021560.02026從表2可以看出，超聲萃取液和水浴萃取液的平均背景吸光值相差不大，且超聲作用效果略好于水浴方式，表明：超聲和水浴加熱萃取都可以去除色素的干擾，且超聲方式效果稍好，因此選擇超聲方式去除干擾物質。5.4.2 去除干擾物質萃取溶劑的確定配置一定量的飽和氯化鈉溶液，按體積比分別配置成90%、80%、70%、65%和60%（體積比v:v）的乙醇-氯化鈉飽和溶液，對烤煙、白肋煙和香料煙進行去除干擾物30min，再按5.4.1中淀粉提取實驗和測定方法進行吸光值A0和淀粉測定，結果見表3。表3 去除干擾物

13、質萃取溶劑濃度的選擇乙醇-氯化鈉飽和溶液樣品吸光值/A0淀粉/%90% 烤 煙0.016854.52白肋煙0.023520.64香料煙0.022732.3680% 烤 煙0.013684.48白肋煙0.021570.66香料煙0.019972.4370% 烤 煙0.013024.38白肋煙0.024460.55香料煙0.024122.2965%烤 煙0.014153.93白肋煙0.023120.46香料煙0.023542.0860% 烤 煙0.016272.98白肋煙0.025120.33香料煙0.024541.87從表3可以看出，隨著乙醇濃度的降低，吸光值A0先降低后升高，淀粉測定結果逐漸降

14、低，這是由于樣品中干擾物質主要有色素、糖類和醌類等化合物，隨著乙醇濃度降低，色素和醌類化合物去除效果差，樣品吸光值A0逐漸升高，糖類化合物去除效果好；而隨著乙醇濃度的升高，萃取液中水含量較少，糖類化合物的去除效果差，不利于過濾。因此，為去除樣品中干擾物質，使淀粉發(fā)生溶脹作用且測定不受影響，選擇80%乙醇-氯化鈉飽和溶液是比較適宜的。5.4.3 超聲作用時間的確定以烤煙為實驗樣品，稱取6份試樣，加入25 mL 80乙醇-氯化鈉飽和溶液，依次超聲作用l0、20、30、40、50和60min，去除樣品中干擾物質，再按照實驗方法提取樣品中的淀粉，移取1mL淀粉萃取溶液于10mL容量瓶中，定容，搖勻；以

15、去離子水為參比，用分光光度法測定試液的吸光度A0，結果見表3。表3 超聲作用時間的選擇時間（min）樣品背景吸光值（A0）淀粉/%100.0214254.22200.0125674.45300.0135604.36400.0135674.36500.0128234.51600.0128254.36圖2 超聲作用時間的選擇從圖2可以看出，超聲20 min后，樣品溶液的背景吸收以及淀粉測定結果基本保持不變，表明：樣品的背景干擾不能夠完全去除，同時樣品溶液的淀粉測定量也基本保持不變，因此，選擇超聲去色素時間為30 min。5.5 淀粉萃取方式的選擇RJ雷諾公司和YC/T 216-2007方法采用40

16、高氯酸室溫下靜置萃取煙草中的淀粉，萃取時間10 min。為了更快更完全地萃取煙草中的淀粉，取12份烤煙試樣，每2份一組，分別按照YC/T 216-2007和實驗方法進行樣品前處理，淀粉提取方式分別采用室溫下靜置、振蕩和超聲萃取10 min，然后進行測定，結果見表4。表4 淀粉萃取方式的選擇方法靜置振蕩超聲水浴法4.584.564.614.594.684.72超聲法4.664.654.664.624.724.65 從表4可以看出，無論是水浴方式還是超聲方式去除干擾物質，超聲提取淀粉效果略好于靜置和振蕩方法，這是由于超聲作用更易使淀粉顆粒物與小分子化合物氫鍵結合，發(fā)生溶脹作用，但淀粉測定結果無顯著

17、差異，因此，為使淀粉萃取更加完全，選擇40%高氯酸超聲提取淀粉是適宜的。5.6 精密度5.6.1 日內和日間精密度按照實驗方法進行烤煙、白肋煙和香料煙樣品淀粉含量測定，連續(xù)測試5天，每次測定5平行，測定結果（平均值）見表5和6。表5 日內精密度（n=5）樣品類型淀粉/%RSD/%12345烤 煙白肋煙香料煙4.594.614.624.494.541.190.640.630.590.650.643.742.152.212.342.192.273.28表6 日間精密度（n=5）樣品類型淀粉/%RSD/%12345烤 煙白肋煙香料煙4.594.684.524.494.641.740.590.660.

18、620.640.695.952.242.392.412.352.293.025.6.2 共同試驗研究按照GB/T 6379-2009標準要求，組織8家實驗室開展共同實驗研究。要求按照實驗方法進行5個煙草樣品淀粉含量測定，連續(xù)測試5天，每次測定2平行，測定結果（平均值）見表7。根據(jù)實驗結果計算重復性r和再現(xiàn)性R，結果見表8。表7 不同實驗室淀粉測定結果編號樣品類型淀粉/%平均值/%RSD/%12345實驗室1烤 煙4.634.724.564.614.584.621.34白肋煙0.650.610.580.710.640.647.63香料煙2.432.382.292.512.382.403.35烤煙

19、型卷煙2.061.952.182.072.132.084.16混合型卷煙1.871.911.731.791.821.823.83實驗室2烤 煙4.554.524.604.494.534.540.90白肋煙0.680.610.590.660.530.619.68香料煙2.342.382.292.222.292.302.61烤煙型卷煙2.312.282.192.212.232.242.22混合型卷煙1.631.671.591.681.561.633.15實驗室3烤 煙4.784.654.614.744.634.681.58白肋煙0.730.690.650.630.680.685.69香料煙2.35

20、2.392.432.292.242.343.25烤煙型卷煙2.172.282.142.292.182.213.09混合型卷煙1.791.741.691.781.751.752.25實驗室4烤 煙4.634.584.494.514.674.581.68白肋煙0.650.660.590.570.620.626.20香料煙2.282.242.122.262.192.222.89烤煙型卷煙2.182.142.322.282.182.223.43混合型卷煙1.721.691.621.751.691.692.85實驗室5烤 煙4.584.654.594.624.714.631.13白肋煙0.620.690

21、.720.660.610.667.03香料煙2.312.352.382.292.242.312.34烤煙型卷煙2.282.082.052.142.122.134.16混合型卷煙1.811.721.781.691.821.763.22實驗室6烤 煙4.594.684.524.494.644.581.74白肋煙0.590.660.620.640.690.645.95香料煙2.242.392.412.352.292.343.02烤煙型卷煙2.081.961.992.152.132.064.08混合型卷煙1.691.641.821.661.601.684.98實驗室7烤 煙4.664.824.724.

22、654.794.661.61白肋煙0.710.690.590.650.690.677.17香料煙2.482.562.472.422.532.492.19烤煙型卷煙2.422.352.392.312.452.382.33混合型卷煙1.821.781.881.691.721.784.29實驗室8烤 煙4.564.694.524.514.684.591.89白肋煙0.610.550.690.620.580.618.60香料煙2.352.212.192.342.172.253.83烤煙型卷煙2.282.202.222.172.152.202.28混合型卷煙1.591.751.741.891.741.7

23、46.09表8 重復性Sr和再現(xiàn)性SR（%）樣品類型重復性Sr再現(xiàn)性SR烤 煙0.07010.0877白肋煙0.05000.0501香料煙0.06920.1051烤煙型卷煙0.07160.1212混合型卷煙0.06960.08815.6加標回收率實驗采用烤煙樣品進行高中低加標回收率試驗，結果見表9；烤煙、白肋煙和香料煙樣品進行了添加回收率實驗，結果見表10。表9 高、中、低加標回收率添加水平樣品含量/mg添加量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%低11.245.616.6997.397.710.286.216.3798.212.985.818.6397.4中11.7310.221.719

24、7.898.411.8210.522.2098.911.6410.021.5098.6高11.2520.331.1397.998.113.4222.435.3297.811.7821.533.0198.7表10 加標回收率樣品添加量/mg樣品含量/mg測定量/mg回收率/%烤煙10.211.7321.7197.810.511.8222.2098.910.011.6421.5098.6白肋煙5.31.556.7798.55.91.607.3697.67.53.7311.0397.3香料煙10.45.6315.9399.09.96.0415.7197.79.85.8315.4297.8 從表6可以看出，樣品加標回收率在97.3%99.0%之間。5.7與現(xiàn)行標準方法比對實驗與現(xiàn)行有效標準分析方法YC/T 283-2009和YC/T 216-2007進行比較分析，結果見表7。