免疫印記手冊第六版

1、蛋白質印跡手冊第六版        Western blotting技術作為生物實驗室中最給力的工具之一，一直被研究人員廣泛使用。默克密理博公司的蛋白質印跡手冊（Protein Blotting Handbook）詳細介紹了western blotting的原理、操作和技巧，無論是對初學者，還是對希望進一步優(yōu)化實驗的達人，都將帶來極大的幫助。最新第六版的手冊在優(yōu)化抗體濃度和降低背景方面增加了更全面的指引，同時擴展了熒光檢測的數據和操作步驟，是蛋白質印跡實驗不可缺少的好伙伴。一、  膜的選擇： (p2)二、

2、 蛋白質結合： (p5)三、印跡方法：原理與優(yōu)化 (p2)1. 印跡原理與優(yōu)化2. WB之蛋白分離3. WB之蛋白轉移4. 轉印緩沖液5. 影響轉印的因素6. 開發(fā)一種新的轉印操作7. 蛋白質觀察四、 蛋白質鑒定：   1. 免疫檢測2. 影響免疫檢測的因素3. 質譜分析五、 實驗操作： 1. 蛋白質轉印操作 （1）濕轉操作詳解（2）半干轉操作詳解（3）狹縫印跡操作詳解2. 蛋白質觀察操作 3. 免疫檢測操作 （1）標準的免疫檢測方法（2）快速的免疫檢測方法4. 膜剝離再生操作 5. 蛋白質消化 & 印跡保存操作 六、故障排查： 1.

3、故障排查2. 印跡失敗的例子和原因一、膜的選擇 摘要：PVDF膜和NC膜作為Western印跡應用中最常用的兩種類型的膜，各有什么特點？我們該如何選擇？近四十年來，默克密理博一直是轉印膜的領先供應商。它目前提供三種PVDF膜。這三種膜有何不同，分別適合哪些應用呢？詳見本文。印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素： 蛋白質結合能力 是否需要用醇預濕 開展多次剝離（stripping）和再生檢測（reprobing）實驗的能力 蛋白質觀察 長期印跡保存 信噪比聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素(NC)是Western印跡應用中最常用的兩種類型的膜。硝酸纖維素膜和PVDF膜的特性比較詳見表1。表1.

4、 PVDF和硝酸纖維素膜特性及應用的比較與硝酸纖維素膜相比，電轉到PVDF膜上有許多優(yōu)點。PVDF膜可提供更好的蛋白質截留率、物理強度和廣泛的化學兼容性（Pluskal等，1986）。其中更高的機械強度和出色的耐化學性讓PVDF膜成為免疫檢測中各種染色應用和二次檢測的理想選擇。使用PVDF膜的另一個優(yōu)點是，單塊凝膠上的平行重復泳道可用于各種應用中，如考馬斯藍染色，接著切割條帶進行N端測序，蛋白質水解/肽段分離/內部測序，以及免疫檢測（Kurien等，2003）。市售的硝酸纖維素膜的典型結合能力是80 100 g/cm2，而PVDF膜的結合能力是100 200 g/cm2。在檢測血清中人免疫缺陷

5、病毒（HIV）時直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，結果表明，PVDF膜有著更好的總體HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗體對糖基化包膜抗原的檢測（Lauritzen和 Pluskal，1998）。Immobilon® PVDF轉印膜默克密理博提供三種PVDF膜： Immobilon®-P膜（0.45 m）是一種通用的基質，適用于一般的免疫印跡應用。 Immobilon®-PSQ膜（0.2 m）適用于蛋白質測序和低分子量蛋白的免疫印跡。它有著更高的蛋白質結合能力以及比0.45 m膜更高的截留率。 Immobilon®-FL膜（0.45 m）是為熒光免疫檢測

6、而開發(fā)的。它在多種激發(fā)和發(fā)射波長范圍內的熒光背景都極低。Immobilon® 轉印膜以卷膜和方片膜形式提供。預切好的膜與所有預制膠以及大部分市售的凝膠電泳系統(tǒng)兼容。Immobilon® 轉印膜的性質詳見表2。表3列出了與最常用的電泳系統(tǒng)相匹配的Immobilon® 預切膜的尺寸。表4列出了與現有的預制膠相匹配的Immobilon® 預切膜的尺寸。 表2. Immobilon® PVDF轉印膜的性質和應用 表3. Immobilon® PVDF預切轉印膜和匹配的電泳系統(tǒng) 表4. Immobilon® PVDF預切轉印膜和匹配的

7、預制膠二、蛋白質結合摘要：一旦膜被浸濕，蛋白質結合可通過蛋白質與膜的接觸而實現。由于蛋白與膜結合的發(fā)生貫穿整個膜的厚度（深度），結合能力是由孔的內部表面積來決定的。Immobilon®-P與Immobilon®-PSQ轉印膜在蛋白結合能力上有何差異？影響蛋白質結合的因素有哪些？ PVDF本質是一種疏水性的聚合物，在水溶液中不會浸濕。為了在水性緩沖液和系統(tǒng)中使用PVDF膜，首先必須將其浸泡在50%（v/v）或更高濃度的醇溶液中。甲醇、乙醇和異丙醇都適合浸泡這種膜。隨著膜的外觀從不透明到半透明，完全浸濕是顯而易見的。之后必須用水反復沖洗，以去除醇類，再將膜直接放入轉印緩沖液中平

8、衡。 Immobilon®-P vs. Immobilon®-PSQ轉印膜一旦膜被浸濕，蛋白質結合可通過蛋白質與膜的接觸而實現。由于蛋白與膜結合的發(fā)生貫穿整個膜的厚度（深度），結合能力是由孔的內部表面積來決定的（Mansfield，1994）。Immobilon®-PSQ轉印膜的內部表面積大約是Immobilon®-P轉印膜的三倍，使其吸附能力更高（表2）。表2中所列的數值代表了膜表面在非變性緩沖液中飽和后蛋白質結合的上限。在任一指定的應用中，都可以預期Immobilon®-PSQ轉印膜能比Immobilon®-P轉印膜結合更多的蛋白

9、質。 然而，分析中可實現的最大結合能力往往取決于所采用的具體操作步驟，這是由于蛋白質構象的差異，所使用緩沖液的化學性質，以及樣品上樣所用方法的限制。Immobilon®-P與Immobilon®-PSQ轉印膜之間結合差異的例子如圖1所示，其中蛋白質樣品從聚丙烯酰胺凝膠上電轉過來。部分蛋白質穿過Immobilon®-P轉印膜，被第一張膜后面的第二張膜所捕獲。相比之下，所有蛋白質與Immobilon®-PSQ轉印膜結合，而未穿過。在這種情況下，緊密的孔結構和聚合物較高的內部表面積有助于所有轉移蛋白的完全吸附。不過，Immobilon®-PSQ轉印膜

10、上的免疫檢測可能產生較高的背景，需要更嚴格的清洗條件。因此，膜的選擇是由實驗目標決定的：對于>20 kDa蛋白質的高靈敏度檢測，使用Immobilon®-P轉印膜，但如果分析較小的蛋白質，或必須捕獲100%的蛋白質進行肽段測序，則要轉換成Immobilon®-PSQ轉印膜。 圖1. 利用Immobilon®-P和Immobilon®-PSQ轉印膜進行蛋白質的延長電轉。分子量標準品（第1、3、5、7泳道）和小牛肝裂解液（第2、4、6、8泳道）通過槽轉印法轉移到Immobilon®-P或Immobilon®-PSQ膜，并用考馬斯亮藍

11、染色。在第一張Immobilon®-PSQ轉印膜的后面再放一張，以捕獲穿過的蛋白質。（第5和6泳道在Immobilon®-P后面；第7和8泳道在Immobilon®-PSQ后面。） 影響蛋白質結合的因素在分子水平，蛋白質吸附至少部分源于疏水氨基酸側鏈與聚合物表面疏水區(qū)的相互作用。Matsudaira（1987）觀察到，在疏水殘基被切割之后，小肽的測序效率下降80%，這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時，在肽段消化降解時，人們也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫（如Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991

12、）表明，轉印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強鈣調蛋白與Immobilon®-P轉印膜的結合。鈣的結合導致蛋白質分子結構中形成一個疏水袋。三、印跡方法：原理與優(yōu)化1、印記原理與優(yōu)化過濾（抽濾）過濾是將蛋白質上樣到膜上的直接方法。一個溶解的樣品可以通過抽真空而濾過膜。蛋白質吸附到膜上，而樣品的其他組分則穿過膜（圖2）?；蛘撸瑢悠分苯狱c在表面上，并讓其干燥。固定在膜上的蛋白質隨后可用于分析。斑點印跡（圖3）和狹縫印跡是過濾方法的兩個版本，它們采用多管吸印儀（manifold），將樣品以斑點狀或狹縫狀上樣到膜上。這些技術被作為快速篩選大量樣品的定性方法，或分析相似樣品的定量技術。它在測試實

13、驗設計參數是否適用于更復雜分析時特別有用。過濾方法的另一個版本是網格免疫印跡，當樣品量非常有限，無法用ELISA等傳統(tǒng)技術來開展分析時，這種技術很有用，適合高度并行的樣品分析。例如，網格免疫印跡已用于過敏原特異的抗體應答鑒定，只需要極少量的患者血清（Reese等，2001）。在制備過濾法印跡時，請注意以下方面： 去污劑會抑制蛋白質吸附到膜上。樣品溶解和清洗所用的緩沖液中的去污劑應不超過0.05%，且只在需要時添加。  樣品量應足夠大，以覆蓋每孔中暴露的膜，但又不能超過膜的結合能力。  顆粒負載高的樣品可能會堵塞膜，而那些高粘度的樣品會降低流速。顆粒應通過預過濾或離

14、心來去除，并只將上清上樣到膜上。粘稠的樣品應用緩沖液稀釋。圖2. 利用過濾的印跡系統(tǒng)。圖3. 利用Immobilon® Western 化學發(fā)光HRP底物在人血清的斑點印跡上檢測轉鐵蛋白（詳見操作步驟1.4 斑點印跡，第40頁）。利用山羊抗轉鐵蛋白抗體（稀釋度1:10,0000）和兔抗山羊HRP結合的二抗（稀釋度1:50,000），在Immobilon®-P膜上檢測連續(xù)稀釋血清中的轉鐵蛋白，重復兩次。2.WB之蛋白分離Western印跡包含下列步驟： 在聚丙烯酰胺凝膠上分辨一個復雜的蛋白質樣品。 將分辨好的蛋白質轉移到膜上。 膜上特定蛋白質的鑒

15、定。對于一個成功的Western印跡，必須滿足四個要求： 從凝膠上洗脫 在轉移過程中蛋白質必須從凝膠上洗脫。如果它仍保留在凝膠上，則無法開展印跡分析。 吸附到膜上 在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上。如果蛋白質不吸附，則無法開展印跡分析。 處理過程中的蛋白截留 在轉移后的印跡處理過程中，蛋白質必須仍然吸附在膜上。 處理過程中蛋白的可及性 吸附的蛋白質必須能與檢測它的化學試劑接觸。如果蛋白質被掩蔽，那它就無法被檢測。下面將討論Western印跡中所涉及操作的理論和實際考慮。在1-D或2-D凝膠上分離復雜的蛋白質混合物在印跡之前分離復雜蛋白質混合物的最常用方法

16、是一維（1-D）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），其中蛋白質是根據其分子量分離的（圖4）。在某些情況下，使用非變性條件來分離天然蛋白。盡管這種方法通常不及變性電泳的分辨率，但是在一抗只識別非變性蛋白或必須在膜上保留蛋白質的生物活性時，這特別有用。二維（2-D）凝膠電泳是分析細胞類型、組織和體液中蛋白質組成的理想技術，也是蛋白質組學的核心技術。2-D凝膠的免疫印跡提供了分子量和等電點的信息，在區(qū)分翻譯后修飾所產生的蛋白質異構體上很有用（Celis和Gromov，2000）。在某些情況下，通過等電聚焦的一維分離后的免疫印跡可實現蛋白質分型（Poland等，2002；Eto等，

17、1990）。二維印跡的例子如圖5所示。分子量標準品凝膠中包含分子量（MW）標準品，或marker，有助于在電泳分離后估計感興趣的蛋白質的大小。目前有兩種類型的標準品，未染和預染。未染的MW marker通常包含已純化的分子量已知的天然或重組蛋白。觀察它們在凝膠或膜上的定位需要借助一個染色步驟。預染的MW marker如圖4所示。使用預染marker既有優(yōu)點，也有缺點。預染marker可實現在電泳過程中監(jiān)控凝膠上的蛋白質分離。它們也能指示后續(xù)轉印步驟中的轉移效率。然而，它們相對較貴，且染料的添加可能影響蛋白質遷移率。在確定分子量時，預染marker沒那么準確，因為蛋白質上結合的染料會改變印跡過程

18、中它們吸附到膜上的能力。圖4. Trail Mix蛋白標準品（貨號 70982）上帶有三個預染marker和八個未染marker（它們都帶有His Tag和STag），實現了電泳過程中蛋白質遷移的直接觀察以及任一Western印跡上準確的大小判定。圖5. 通過二維電泳分離的蛋白質的化學發(fā)光檢測。大鼠成纖維細胞系的銀染2-D凝膠（左）和同一張凝膠的印跡（右），在Immobilon®-P膜上用小鼠單克隆抗體雜交，并通過化學發(fā)光法觀察。聚丙烯酰胺的濃度凝膠上聚丙烯酰胺的濃度可以是均勻的，也可以是梯度的。最常用的聚丙烯酰胺濃度，10%，最適合10-150 kDa范圍內蛋白質的分離。如果正在分

19、析未知的蛋白質，或需要更廣泛的分離，建議使用梯度膠。例如，4-12%的Tris甘氨酸凝膠適合30至200 kDa范圍內的蛋白質，而10-20%的凝膠能成功分離6至150 kDa的蛋白質。SDS-PAGE凝膠的厚度通常為1.0和1.5 mm；不過，對于印跡而言，較薄凝膠（= 1 mm）的蛋白質轉移最好。凝膠電泳緩沖液最常用的凝膠電泳緩沖液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine組成的。緩沖液中可能含有0.1%的去污劑，通常是SDS。Tris甘氨酸緩沖液系統(tǒng)適合分離分子量范圍廣（6-200 kDa）的蛋白質，并與變性或非變性條件兼容。Tris-tricine系統(tǒng)最適合分離較小的，需要在上樣之前

20、還原和變性的蛋白質（<10 kDa）。兩種緩沖液系統(tǒng)都與蛋白轉移到PVDF膜上兼容。Tris醋酸緩沖液有時用于較大蛋白的分離。3.WB之蛋白轉移摘要：電泳洗脫，或電泳轉印是迄今為止使用最廣泛的轉印方法。與擴散或真空轉印相比，主要優(yōu)點是速度和轉移完全。兩種常用的電泳轉印技術是槽轉印和半干轉印。它們都基于相同的原理，只是容納凝膠/膜堆積層所用的機械裝置和電場的施加不同。 蛋白質從凝膠轉移到膜上蛋白質從凝膠轉移到膜上，同時維持其相對位置和分辨率的過程被稱為轉印。轉印可通過三種不同的方法來實現：簡單擴散（Kurien和Scofield，1997）是在凝膠上依次放置膜、一疊干濾紙，并在濾紙上放上重

21、物以促進擴散過程而實現的（Kurien和Scofield，2003）。這種方法可將一塊凝膠上的蛋白質轉移到多塊膜上（Kurien和Scofield，1997），獲得同一塊凝膠的幾個印跡。擴散方法的主要缺點是轉移不是定量的，與電泳轉印相比只能轉移25-50%的蛋白質（Chen和Chang，2001）。真空輔助的溶劑流（Peferoen等，1982）利用泵的抽吸能力，將凝膠上分離的蛋白質吸到膜上。高分子量和低分子量的蛋白質都可用這種方法轉移；不過，分子量低于20 kDa的蛋白質需要使用較小的孔徑（0.2 m），因為它們不易被0.45 m的膜吸附（Kurien，2003）。蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠上的

22、真空轉印不大常見，主要用于核酸從瓊脂糖凝膠上的轉移。電泳洗脫，或電泳轉印（Towbin等，1979）是迄今為止使用最廣泛的轉印方法。與擴散或真空轉印相比，主要優(yōu)點是速度和轉移完全（Kurien等，2003）。電泳轉印技術兩種常用的電泳轉印技術是槽轉印和半干轉印。它們都基于相同的原理，只是容納凝膠/膜堆積層所用的機械裝置和電場的施加不同。槽轉?。▓D6）是一種傳統(tǒng)的技術，其中凝膠/膜堆積層被完全浸濕在緩沖液槽中，并施加電流。這是一種有效但緩慢的技術，使用大量緩沖液。槽轉印系統(tǒng)一般在恒定電壓下運行；轉移過程中緩沖液的混合讓電流保持相對恒定。圖6. 槽（濕式）轉印系統(tǒng)。半干轉?。▓D7）以一疊經緩沖液浸

23、濕的濾紙取代了緩沖液槽。由于板電極直接接觸濾紙，通過凝膠的場強最大化，利于快速、高效的轉移。這種技術同樣有效，且比槽轉印快得多（15-45分鐘）。大多數半干轉印方法使用不止一種緩沖液系統(tǒng)，來實現大蛋白和小蛋白的高效轉移。不過，半干轉印系統(tǒng)有著較低的緩沖能力，因此不適合長時間轉印。半干轉印是大的2-D凝膠轉印的首選方法。半干轉印儀通常在恒定電流下運行；在轉移過程中電壓會增加。對于半干轉印系統(tǒng)，濾紙和膜必須切成與凝膠同樣大小，這樣電流才被迫穿過凝膠。否則，電流會通過凝膠周圍的重疊濾紙而短路。在兩種類型的轉印系統(tǒng)中，需要格外小心，以避免在濾紙、凝膠和膜之間引入氣泡。氣泡阻礙轉移，引起轉印膜上的“禿斑

24、”（即無轉移區(qū)域）。圖7. 半干轉印系統(tǒng)。4.轉印緩沖液摘要：轉印緩沖液提供了電極之間的電連續(xù)性，必須是導電的。它還提供了一個化學環(huán)境，能維持蛋白質的溶解度，又不妨礙轉移過程中蛋白質吸附到膜上。對于大多數蛋白質樣品，常見配方可實現這些功能。至于添加到緩沖液中的甲醇，它有什么功能呢？請看本文。轉印緩沖液轉印緩沖液提供了電極之間的電連續(xù)性，必須是導電的。它還提供了一個化學環(huán)境，能維持蛋白質的溶解度，又不妨礙轉移過程中蛋白質吸附到膜上。對于大多數蛋白質樣品，常見配方可實現這些功能。大部分緩沖液在轉移過程中發(fā)生焦耳加熱?；谶@個原因，許多槽轉印系統(tǒng)都配有內置的冷卻管。轉印槽還可以放在冷室內，而緩沖液可

25、以在使用前經過預冷。在半干轉印系統(tǒng)中，電極板還可作為散熱片。但它們的散熱能力有限，因此半干系統(tǒng)一般不用于長時間轉印。傳統(tǒng)的轉印緩沖液包含緩沖系統(tǒng)和甲醇。Towbin緩沖液（1979），Tris甘氨酸緩沖液，常用于槽轉印系統(tǒng)中。這種緩沖液的pH值為8.3，比大多數蛋白的等電點（pI）要高。在凝膠上分離的蛋白質帶負電荷，向陽極遷移。由于槽內的緩沖液是混合的，故轉移過程中的離子分布保持相對恒定。半干系統(tǒng)可利用單一或三重緩沖液系統(tǒng)（Kyhse-Anderson定義，1984）來運行。使用三重緩沖液，是因為轉移是個等速電泳的過程，其中蛋白質在領先離子和尾隨離子之間移動（Schafer-Nielsen等，

26、1980）。在某些情況下，三重緩沖液系統(tǒng)可實現更好的定量轉移。這三重緩沖液分別為： 陽極緩沖液I：0.3 M Tris，pH 10.4 陽極緩沖液II：25 mM Tris，pH 10.4 陰極緩沖液：25 mM Tris和40 mM -氨基己酸，pH 9.4陽極緩沖液I中和陽極板表面產生的過量質子。陽極緩沖液II與陽極緩沖液I的pH值相同，但Tris濃度低至25 mM。陰極緩沖液包含-氨基己酸，作為轉移過程中的尾隨離子，并在陰極緩沖液中逐漸耗盡，因為它穿過凝膠向陽極移動。對于半干系統(tǒng)中采用單緩沖液，請查詢制造商的建議。盡管上面定義的緩沖液系統(tǒng)適用于大多數蛋白轉印

27、，但文獻中包含許多變化，適用于不同的應用。最明顯的變化之一是在蛋白測序應用中，建議使用10 mM CAPS緩沖液（pH 11）（Matsudaira，1987）。Towbin緩沖液中使用以及凝膠電泳緩沖液中殘留的甘氨酸導致采用Edman原理的自動蛋白測序儀中出現高背景。通過改變轉印緩沖液的配方，這種假象明顯減少。緩沖液強度及組成的任何修改應小心進行，以確保轉印裝置不會過熱。轉印緩沖液甲醇的功能添加到轉印緩沖液中的甲醇有兩個主要功能： 穩(wěn)定凝膠的尺寸。 從蛋白質分子上解離出復合的SDS。聚丙烯酰胺是一種水凝膠，具有吸收水分的能力。在純水中，各個維度的凝膠尺寸都有相當量的增加。

28、溶脹度也取決于凝膠中所使用的丙烯酰胺的濃度。高濃度的凝膠比低濃度的凝膠溶脹得更多。梯度膠會明顯突出這種影響，其底部高濃度的區(qū)域比頂部溶脹得更多。開始時是矩形的凝膠可能會變成梯形。添加到轉印緩沖液中的甲醇能最大限度地減少凝膠溶脹，而轉印操作通常也包括一個平衡步驟，以達到凝膠尺寸的穩(wěn)定性。當甲醇濃度為10%-20%時，尺寸穩(wěn)定性可相當快速地實現。當甲醇濃度較低時，平衡需要更長的時間才能實現。如果在轉移過程中發(fā)生尺寸改變，蛋白質的分辨可能會損失。對于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白質，甲醇的減低會導致蛋白轉移效率明顯提高，但這可能需要更長的平衡時間來確保尺寸穩(wěn)定性。甲醇的第二個功能對于蛋白質從包含S

29、DS的凝膠上轉移很關鍵。甲醇可幫助從蛋白質分子上解離所復合的SDS（Mozdzanowski和Speicher，1992）。盡管SDS對凝膠上單個蛋白質的分辨很必要，但是對于有效印跡卻是極為不利的。首先，SDS的結合給蛋白質分子帶來高的負電荷密度，導致蛋白質分子非?？焖俚卮┻^膜，減少在孔結構內的停留，從而降低分子間相互作用的機會。其次，通過包被蛋白質分子，SDS限制蛋白質與PVDF進行分子接觸的能力。這些影響隨著蛋白質的分子量降低而增加。甲醇通過解離SDS，并提高蛋白質分子與膜結合的可能性，從而減少這兩方面的影響。5.影響轉印的因素摘要：影響蛋白質成功轉移的因素有哪些？本文提到了四點：SDS的

30、存在、電流和轉印時間、轉印緩沖液的pH值，以及平衡時間。SDS的存在一些研究表明，在SDS-PAGE凝膠的背景下，蛋白質與SDS分子結合，因此不能有效地與轉印膜結合。具體來說，在兩小時內監(jiān)控BSA在標準槽轉印系統(tǒng)中的轉移，數據表明，在單個蛋白條帶中，分子分成多批從凝膠上轉移（圖8，第20頁）。在最初60分鐘內，約90%的BSA從凝膠上洗脫，在之后60分鐘內還有7%。在最初15分鐘內，部分洗脫的BSA被Immobilon®-P轉印膜吸附，而剩余的穿過，被Immobilon®-PSQ轉印膜吸附。而15分鐘后洗脫的BSA幾乎全被Immobilon®-P轉印膜吸附。圖8.

31、 BSA的電轉移。25 pmol 125I標記的BSA在10-20%的梯度膠上通過SDS-PAGE來分辨。平衡后5分鐘，在槽轉印系統(tǒng)中將BSA轉移到Immobilon®-P轉印膜，并用Immobilon®-PSQ轉印膜來備份，利用25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作為轉印緩沖液。系統(tǒng)以8V/cm極間距離運行。在15、30、60和120分鐘，取出凝膠/膜轉印夾。切下BSA條帶并計算。最簡單的解釋是與高水平殘留SDS結合的BSA從凝膠上快速洗脫，無法被Immobilon®-P轉印膜所吸附。較慢洗脫的BSA能夠被Immobilon®-P轉印膜

32、所吸附。盡管去除凝膠上的SDS通常被認為是常規(guī)印跡的最好方法，但也有一些情況，說明在轉印緩沖液中添加少量SDS也是值得考慮的。一種情況是待轉移的蛋白質在缺乏SDS時溶解度很低。與細胞膜相關聯(lián)或不可缺少的蛋白質可能是非常疏水的，當SDS被去除后，在聚丙烯酰胺中會沉淀。高分子量蛋白質也在缺乏SDS時表現出溶解度的問題，特別是當暴露在樣品緩沖液的變性條件以及轉印緩沖液所使用的甲醇下。轉印緩沖液中補充SDS可幫助維持足夠的溶解度，以便允許從凝膠上洗脫（如Towbin和Gordon，1984；Otter等，1987；Bolt和Mahoney，1997）。轉印緩沖液中的SDS濃度不應超過0.05%，且應有

33、足夠的平衡時間，以去除凝膠上過量的SDS。改善高分子量蛋白質的轉印效率的其他方法包括延長轉印時間，最多21個小時（Erickson等，1982），或使用包含SDS和尿素的復合瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠（Elkon等，1984）。電流和轉印時間適當的電流和轉印時間對成功的轉印至關重要。電流過低和/或時間不足將導致轉印不徹底。相反，如果電流過高，蛋白質分子可能太快穿過膜而來不及被吸附。這對于較小的蛋白質來說可能是個值得注意的問題。通常，轉印系統(tǒng)都會附帶制造商關于電流和轉印時間的建議，它們應被作為參考指引。優(yōu)化條件可能仍然需要，這取決于丙烯酰胺的比例、緩沖液組分，以及感興趣蛋白質的分子量。一般來說，長的轉

34、印時間最適合槽轉印系統(tǒng)，它通常需要冷卻裝置和轉印緩沖液的內部循環(huán)。然而，對于半干式轉印，延長轉印時間可能導致緩沖液耗盡、過熱和凝膠變干。如果太干，裝置可能被電極板之間的電弧損壞。轉印緩沖液的pH值轉印緩沖液的pH值是另一個重要的因素。如果蛋白質的等電點與緩沖液的pH值相同，則轉移不會發(fā)生。為了解決這一問題，可采用較高pH值的緩沖液（如CAPS）或較低pH值的緩沖液（如乙酸溶液）。平衡時間在蛋白質轉印的早年（70年代末期，80年代初期），大部分操作要求在轉印前平衡凝膠30分鐘。5英寸標準凝膠，或一邊長度超過5英寸，以及最小厚度>1 mm的凝膠需要延長平衡時間，來穩(wěn)定凝膠的大小。隨著迷你凝膠

35、逐漸普及，平衡時間也縮短，因為水和甲醇需要平衡的體積減少了。標準的迷你凝膠可在5-10分鐘內達到尺寸的平衡，但SDS解離的動力學要慢得多，因此對于大部分迷你凝膠，建議平衡時間至少達到15分鐘。注意：對于包含小肽的樣品，在沒有電流動力的情況下，也可發(fā)生肽段的快速遷移。在這種情況下，凝膠在轉印緩沖液中的平衡應限制在10分鐘以內。在SDS-PAGE系統(tǒng)中，電泳緩沖液中添加了SDS。這種SDS集中在陰極槽內，電泳時跟著溴酚藍示蹤染料。由于大部分凝膠的運行是直到示蹤染料到達凝膠底部，此時所有過量的SDS仍殘留在凝膠中，并被帶入轉印操作。如果轉印前不允許SDS擴散到凝膠外，那么它將干擾蛋白質吸附。平衡時間

36、可延長至30分鐘，且應使用足夠的緩沖液，將SDS稀釋到最低水平。平衡時間對BSA電轉移的影響如圖9所示。在這項研究中，放射性標記的BSA通過SDS-PAGE來分辨，而凝膠在轉印緩沖液中的平衡時間在0至30分鐘。蛋白質被轉移到Immobilon®-P轉印膜上，后面有一塊備用的Immobilon®-PSQ轉印膜，以吸收Immobilon®-P轉印膜未截留的BSA。在轉印過程結束時，凝膠、主要印跡（Immobilon®-P轉印膜）和備份印跡（Immobilon®-PSQ轉印膜）上的BSA被定量。當平衡時間延長至30分鐘時，截留率提高到90%。研究發(fā)現

37、其他蛋白質的表現類似。圖9. 平衡時間對BSA電轉移到Immobilon®-P轉印膜的影響。125I標記的BSA在10-20%的梯度膠上通過SDS-PAGE來分辨。在指定的平衡時間后，BSA被轉移到Immobilon®-P轉印膜上，后面有一塊備用的Immobilon®-PSQ轉印膜，采用槽轉印系統(tǒng)，以25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作為轉印緩沖液。系統(tǒng)以8V/cm極間距離運行。在2小時的轉印結束時，凝膠和膜被染色。BSA條帶被切下并計算。6.開發(fā)一種新的轉印操作開發(fā)一種新的轉印操作盡管上一節(jié)提到緩沖液和轉印條件的選擇可能非常復雜，但Towbin

38、等定義的槽轉印系統(tǒng)（1979）和由Kyhse-Anderson定義的半干轉印系統(tǒng)（1984）能適用于大部分的蛋白質樣品。這兩者都代表了出色的起點。不過，假如它們的確并非最適合于某個特定蛋白質，那么可調整轉印條件，以配合蛋白質的生化特性。Otter等（1987）介紹了一種有趣的優(yōu)化策略，適合分子量在8,000至>400,000 kDa范圍內的蛋白質的有效轉移。轉印緩沖液可添加0.01% SDS，以維持高分子量蛋白質的溶解度，以及20%甲醇，以增強吸附。電場可以兩個階段施加。轉印的最初一小時是以低電流密度，以減慢低分子量蛋白質的遷移速率，增加它們在膜上的停留時間。之后以高電流密度，以洗脫高分

39、子量的蛋白質。在開發(fā)一種新的轉印操作或處理一種新的樣品類型時，凝膠應被染色，以驗證所有蛋白質是否從凝膠上徹底洗脫。強烈建議在每塊凝膠上點上一道預染marker，以監(jiān)控轉印效率。一些蛋白質在標準轉印緩沖液中的溶解度有限，需要修改緩沖液試劑，以防止沉淀。另外一些蛋白質，如組蛋白和核糖體蛋白，在標準轉印緩沖液中帶正電荷，將向陰極遷移。在凝膠的陰極端放上一張Immobilon®-P膜，可實現這些蛋白質的成功轉印。轉印后的膜染色也很有用，可確保目標蛋白在印跡上。詳見下面的“蛋白質觀察”，了解能與后續(xù)的免疫檢測兼容的染料信息。另一個監(jiān)控蛋白質轉移的方法是在電轉前對SDS-PAGE凝膠染色（Tho

40、mpson和Larson，1992）。在這種方法中，凝膠在電泳后，或電泳過程中用考馬斯亮藍染色。免疫檢測過程中的轉移蛋白仍保持染色狀態(tài)，從而為蛋白定位和大小確定提供一套背景marker（Thompson和Larson，1992）。準備蛋白質鑒定的膜對于染色和免疫檢測PVDF膜應用去離子水清洗，以去除任何凝膠碎片。轉印膜隨后可與封閉液一起孵育。對于通過透照法的快速免疫檢測和觀察在轉印完成后，PVDF膜應徹底干燥，才能繼續(xù)染色或進行免疫檢測。干燥增強了蛋白質與PVDF聚合物的吸附，有助于減少后續(xù)分析過程中的解吸附。隨著轉印膜變干，它變得不透明。這種光學變化是一種表面現象，會掩蓋孔深處水的保留。轉印

41、膜應按照建議的時間干燥，以確保所有液體從膜的孔結構內蒸發(fā)。保存在蛋白質轉移到膜上之后，PVDF膜可以干燥保存很長一段時間，對膜或蛋白質無不良影響（4 °C最多兩周；20 °C最多兩個月；70 °C可保存更長時間）。然而，一旦在不可控的環(huán)境下長期保存，一些蛋白質可能對化學變化（如氧化、脫酰胺化、水解）敏感。建議在低溫下長期保存。在進一步分析之前，干燥的膜必須在100%甲醇中浸濕。7.蛋白質觀察摘要：目前有許多類型的染料，包括有機染料（麗春紅、氨基黑、固綠和考馬斯亮藍）、熒光染料（熒光胺、香豆素）以及膠體粒子（金、銀、銅、鐵和印度墨汁）（Kurien等，2003）。本

42、文列出了在Western印跡中檢測總蛋白的最常用染料。這些染料可分為兩類：可逆和不可逆的染料。透照透照（圖10）是一種PVDF膜特有的觀察技術，首次介紹就是應用于Immobilon®-P轉印膜上（Reig和Klein，1988）。這種技術利用PVDF膜特有的性質；被轉印蛋白包被的PVDF區(qū)域能夠在20%甲醇中浸濕，而PVDF的周圍區(qū)域不行。PVDF濕潤的區(qū)域逐漸變得光學透明，能夠利用背光和照相存檔來觀察蛋白條帶。此過程通過蒸發(fā)而完全可逆。因為蛋白質在轉印過程中已暴露在甲醇中，所以蛋白質的進一步變性基本不會發(fā)生。盡管這種技術不能用于觀察低豐度蛋白，但它能用來評估整體的轉移效率以及印跡是

43、否適合進一步分析。染色染色（圖10）是一種讓印跡上的蛋白質可見的簡單技術。染色可用于： 驗證蛋白質是否轉移到膜上。 確定各泳道是否相同上樣。 評估整體的轉移效率，特別是對于新的緩沖液或蛋白質。 鑒定和切割條帶用于肽段測序。目前有許多類型的染料，包括有機染料（麗春紅、氨基黑、固綠和考馬斯亮藍）、熒光染料（熒光胺、香豆素）以及膠體粒子（金、銀、銅、鐵和印度墨汁）（Kurien等，2003）。表5列出了在Western印跡中檢測總蛋白的最常用染料。這些染料可分為兩類：可逆和不可逆的染料?？赡嫒玖峡赡嫒玖显试S在評估印跡之后將其從膜上洗掉。這些操作不干擾后續(xù)的免疫

44、檢測或印跡上蛋白質的其他分析。最常用的蛋白可逆染料是麗春紅?？赡嫒玖系闹饕秉c在于它們的靈敏度不及不可逆染料。由于印跡上高豐度蛋白的染色模式通常也能很好地指示了低豐度蛋白在多大程度上轉移，這一缺點在大部分情況下被最小化。熒光染料高度靈敏，且與下游的免疫檢測、基于Edman的測序和質譜分析兼容（Berggren等，1999）。Sypro® Ruby和Sypro® Rose蛋白印跡染料（Life Technologies）可在顯色、熒光或化學發(fā)光免疫染色步驟前使用，并可實現約1-2 ng/條帶的檢測靈敏度（Haugland，2002）。不可逆染料不可逆染料通常表現出最佳的靈敏度

45、，但會干擾或阻止蛋白質的進一步分析。不可逆染料有氨基黑和考馬斯亮藍。圖10. 小牛肝臟蛋白在電轉到Immobilon®-P轉印膜后的觀察：(A) 透照，(B) 考馬斯亮藍，(C) 麗春紅，(D) 氨基黑和(E) CPTS總蛋白染料。從左到右，每條泳道依次是分子量標準品和12.2 g、6.1 g、3.1 g裂解液。表5. Western印跡中常用的染料及其性質。檢測試劑（每個斑點的蛋白質）近似靈敏度參考文獻可逆麗春紅5 gDunn等，1999固綠FC5 gDunn等，1999CPTS1 gBickar等，1992Sypro® Ruby1-2 ngHaugland，2002Sy

46、pro® Rose1-2 ngHaugland，2002不可逆氨基黑10B1 gDunn等，1999考馬斯亮藍R-250500 ngDunn等，1999印度墨汁100 ngDunn等，1999膠體金4 ngDunn等，1999四、蛋白質鑒定1.免疫檢測摘要：免疫檢測利用特異抗體來檢測和定位印在膜上的蛋白質。抗原-抗體結合的特異性實現了復雜樣品中單個蛋白的鑒定。目前有兩種免疫檢測的操作：標準和快速。快速免疫檢測省去了封閉步驟，縮短了清洗和孵育步驟所需的時間，因而適合快速觀察豐度較高的蛋白質。免疫檢測免疫檢測利用特異抗體來檢測和定位印在膜上的蛋白質（圖11）。抗原-抗體結合的特異性實現了

47、復雜樣品中單個蛋白的鑒定。在開發(fā)一種新的免疫檢測操作時，所有成分及它們的相互作用都必須考慮?？贵w濃度、緩沖液組成、封閉液和孵育時間必須根據經驗來試驗，以確定最佳的條件。水的質量對所有步驟都很重要 少量雜質可能引起大問題。例如，辣根過氧化物酶的酶活性會被一種即使高純水也可能有的常見的污染物熱原所抑制，也會被一種常用的抗體溶液防腐劑疊氮化物所抑制。因為涉及一致性和污染物等問題，封閉液的質量也必須認真考慮。圖11. 基于膜的免疫檢測。標準 vs. 快速的免疫檢測步驟目前有兩種免疫檢測的操作：標準和快速。標準免疫檢測方法包括下列步驟：1. 封閉轉印膜上未被占據的位點，以防止抗體的非特異結合。2. 將轉

48、印膜與一抗共同孵育，一抗與感興趣的蛋白質結合。3. 清洗以去除未結合的一抗。4. 將轉印膜與二抗結合物共同孵育，二抗與一抗結合。5. 清洗以去除未結合的二抗。6. 將轉印膜與底物共同孵育，底物與二抗結合物相互作用，從而顯示蛋白質的位置?？焖倜庖邫z測省去了封閉步驟，縮短了清洗和孵育步驟所需的時間。快速免疫檢測方法適合快速觀察豐度較高的蛋白質。不過，標準免疫檢測提供了更高的靈敏度，并且對于新的樣品類型來說需要的優(yōu)化較少。標準和快速免疫檢測方法的操作都在操作3中列出。表6比較了開展兩種操作所需的時間。表6. 標準 vs. 快速免疫檢測。步驟標準免疫檢測快速免疫檢測1. 封閉膜1小時無2. 與一抗孵育

49、1小時1小時3. 清洗膜3 x 10分鐘3 x 5分鐘4. 與二抗孵育1小時30分鐘5. 清洗膜3 x 10分鐘3 x 5分鐘6. 添加底物5分鐘5分鐘總時間4小時5分鐘2小時5分鐘2.影響免疫檢測的因素摘要：影響免疫檢測的因素有很多，包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測底物等等。了解下列章節(jié)中提出的有關免疫檢測的概念，將有助于優(yōu)化特定樣品的操作。緩沖液最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液（PBS）和Tris緩沖液（TBS）。調整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊。緩沖液的關鍵要求是它應有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強度和pH值應相當接近生理狀態(tài)。PBS的配方（磷酸鹽總濃度10 mM）適

50、用于廣泛的抗體和檢測底物。在孵育過程中，裝有膜的容器應輕輕搖動。緩沖液的量應足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會導致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導致各種假象，如背景高、信號弱和靈敏度不均勻等。· 封閉要獲得有意義的結果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質結合，而不與膜結合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑（如Bløk® noise-canceling試劑）來封閉膜上未被占據的位點，可減少抗體的非特異結合（NSB）。封閉劑與膜的親和力應高于抗體。它應填滿膜上未被占據的位點，但不會替換膜上的目標

51、蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白（BSA，0.2-5.0%）、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液（0.05-0.1%）以及Bløk®試劑。研究表明，吐溫20去污劑對抗原有復性的作用，從而能夠提高特異抗體對抗原的識別（Van Dam等，1990；Zampieri等，2000）。其他去污劑，如Triton® X-100去污劑、SDS和NP-40，有時也會使用，但可能會太過劇烈而破壞了蛋白之間的相互作用。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。與封閉相關的風險包括：選擇不適當的封閉劑或過量封閉會替換或掩蓋目標蛋白質。因此，封閉劑的正確選擇對成功的免疫檢測很關鍵。

52、例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標記的抗體，因為牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特異性抗體對磷酸化蛋白進行檢測分析時，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會被這些酶去磷酸化，就有可能會影響分析結果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強磷酸化特異性抗體的信號（Sharma和Carew，2002）。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。封閉劑和檢測試劑之間的兼容性可通過操作1.5（第41頁）中介紹的斑點印跡方法來確定。封閉液被點樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測試劑，孵育

53、5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現則表明封閉劑與檢測試劑不兼容（圖19，第42頁）。必須記住，與Immobilon®-P轉印膜相比，Immobilon®-PSQ轉印膜的表面積更高，孔徑更小，可結合更多的蛋白質。如果在標準的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉印膜來替代Immobilon®-PSQ轉印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面?？赡苄枰嗟那逑床襟E來降低背景。利用斑點印跡方法，可方便地優(yōu)化封閉（第40頁）。· 抗體在封閉之后，印跡與一個或多個抗體孵育。第一個抗體與目標蛋白結合，而第二個抗體與第一個結合。第二個抗體結

54、合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。盡管一抗能直接標記，但使用二抗有明顯的優(yōu)勢。首先，不止一個二抗分子能夠與單個一抗分子結合，形成信號擴增。其次，標記的二抗（酶-抗體結合物）可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需要標記多個一抗。多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養(yǎng)液中表達的，可直接使用或進行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來進行印跡?？贵w以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結合。抗體稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集

55、。許多發(fā)表的化學發(fā)光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%（v/v）吐溫20。我們必須認識到，高于0.05%（v/v）的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質。提高吐溫20去污劑的濃度通常會降低背景。一種更簡單且更經濟的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗（詳見圖12）?？贵w必須特異針對目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應，且應該是相對純凈的。其他蛋白質或聚集物形式的雜質會導致非特異性結合和背景增高。免疫檢測是一種極其靈敏的方法。為了實現高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應針對每種情況來優(yōu)化。一般來說，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號。高倍稀釋酶標記的二抗可最大限度

56、降低整體的高背景。一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑（檢測到飛克級）與低靈敏度的試劑（檢測到皮克級）相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優(yōu)化取決于檢測底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測試劑（Luminata Forte試劑）時，過量的抗體導致高的非特異性和整體背景增高（左上）。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測試劑（中間和最下面一行）時，抗體需要更為濃縮，以產生相同的信號。圖12. 二抗稀釋度的優(yōu)化，利用Immobilon® Western化學發(fā)光HRP底物對ERK1進行免疫檢測。

57、大鼠肝臟裂解液的兩倍稀釋物被上樣到每塊凝膠上。電轉后的蛋白質與兔抗ERK1抗體（1:1,000稀釋）以及HRP結合的山羊抗兔IgG（1:5,000、1:20,000和1:100,000稀釋，從左到右）雜交。圖13. 檢測試劑越靈敏，需要的抗體越少。包含指定量A431裂解液的免疫印跡與不同濃度的GAPDH抗體（貨號 MAB374）雜交，如最上面一行，再與適當的二抗雜交。利用指定的Luminata HRP底物觀察條帶，并在X射線膠片上曝光5分鐘。在這三種檢測試劑中，Luminata Forte試劑最靈敏，Luminata Cresendo次之，最后是Luminata Classico試劑。使用靈敏

58、度較高的HRP底物，有三方面的優(yōu)點：1. 結果更佳：它產生更強的條帶，帶來更為定量的印跡（比較Luminata Cresendo和Forte底物在1:10,000稀釋度下條帶強度的增加） 2. 更快速：清洗印跡和添加新底物只需要10分鐘，而重復抗體孵育需要2.5小時。 3. 更便宜：HRP底物比抗體要便宜得多。· 清洗清洗印跡，從膜上去除未結合的抗體，它們可能導致高背景和檢測不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液（0.05% v/v），特別是當抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導致感興趣的蛋白質從膜上洗脫。對于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進行清

59、洗。所需的清洗次數最好根據實驗來確定。清洗太少會產生過多的背景，而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號。建議至少清洗三次，每次5分鐘。在TBS清洗液中添加最多0.5 M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時間延長至2小時，可降低頑固的背景。· 雙印跡在Western印跡中避免非特異結合的一種新方法是由法國國家反興奮劑實驗室的Françoise Lasne博士開發(fā)的（Lasne，2001；Lasne，2003）。在研究重組人促紅細胞生成素（EPO）時，Lasne博士發(fā)現重組和天然的EPO有著不同的等電點（pI）。重組EPO的pI為4.42-5.11，而天然EPO的pI偏酸性，為3.92-4.42。然而，在轉印尿液樣品時，二抗的超高非特異結合（NSB）讓人難以區(qū)分重組和天然EPO。為了避免NSB，Lasne博士使用了“雙印跡”。在一抗與印跡蛋白結合后，抗體在酸性條件下被轉移到第二張Immobilon®-P膜。一抗從相應的抗原上釋放，并通過中間體