最新遺傳性疾病的分子診斷

1、遺傳性疾病的分子診斷上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院 樊綺詩診斷策略和工具 用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。1976年人們開始在實驗室進行研究，1984年以來，基因檢測在許多國家已成為常規(guī)項目，主要用于遺傳性疾病的診斷。一、遺傳性疾病的分類常染色體連鎖遺傳性疾病 致病基因位于常染色體性染色體連鎖遺傳性疾病 致病基因位于性染色體常染色體連鎖遺傳性疾病常染色體隱性遺傳位于一對常染色體上的兩個等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖隱性遺傳性疾病。同一對染色體中只有一個等位基因發(fā)生突變的個體稱為雜合子，二

2、個等位基因均發(fā)生突變的個體稱為純合子。囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31)常染色體連鎖顯性遺傳位于一對常染色體上的二個等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病。特點：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者。huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3)性染色體連鎖遺傳性疾病x染色體連鎖遺傳：大多為隱性 (如甲型血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥)，顯性遺傳非常罕見。y染色體連鎖遺傳二、遺傳性疾病中常見的分子異常遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個（或數(shù)個）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過遺傳物質(zhì)的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)（或

3、酶）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕ㄈ箢?，即點突變、片段性突變和動態(tài)性突變。（一）點突變點突變：dna分子中單個堿基的替換終止密碼子突變：點突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長。錯義突變、無義突變、移碼突變各種點突變所造成的后果：蛋白質(zhì)分子量改變、蛋白質(zhì)合成量下降、無蛋白質(zhì)合成。（二）片段性突變核苷酸的丟失和增多 缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失 插入：外來基因片段插入某一基因序列中 倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù) 基因重排：基因組中原來不在一起的基因 由于某些原因組合排列在一起。（三）動態(tài)性突變 以三核苷酸為單位的重復(fù)序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，

4、即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性x綜合征：cgg重復(fù) 少年脊髓型共濟失調(diào)：gaa重復(fù) 三、遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策略就是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。 （二）間接診斷策略 間接診斷的實質(zhì)是在家系中進行連鎖分析，通過分析可確定個體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體，從而判斷該個體是否帶有致病基因。 間接診斷不是尋找 dna 的遺傳缺陷，而是通過分析dna的遺傳標記的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性。四、基因診斷

5、所采用的技術(shù)四、基因診斷所采用的技術(shù)(一) 直接診斷所采用的技術(shù)1.dna片段性突變的檢測 （1）southern 印跡技術(shù) 將基因組dna用限制性酶水解成無數(shù)片段經(jīng)凝膠電泳后用堿處理使凝膠中的dna變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用標記探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影。（2）多重pcr技術(shù) 在一個pcr反應(yīng)體系中放入多對引物，當基因的外顯子發(fā)生缺失時，根據(jù)條帶缺失的數(shù)目和引物相應(yīng)的位置，可判斷基因中哪一個或哪幾個擴增部位發(fā)生缺失。2. 點突變（1） 已知點突變的檢測方法 a）pcr-rflp 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點而設(shè)計。若點突變處于某一限制性內(nèi)切

6、酶的酶切位點內(nèi)，可在突變點兩側(cè)設(shè)計引物，使pcr產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。b）等位基因特異性寡核苷酸雜交被檢基因經(jīng)pcr擴增后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與長度為1520bp、經(jīng)標記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個堿基中僅一個堿基差異即可使dna分子的tm值下降 57.5，因此通過嚴格控制雜交條件，可使pcr產(chǎn)物僅與完全互補的探針雜交，根據(jù)有無雜交信號即可判斷被檢者的擴增片段中是否帶有突變點。c）pcr-elisa 將pcr產(chǎn)物用elisa方法加以檢測的技術(shù)。在對目的基因擴增時，dntp中同時混有用

7、生物素標記的bio-16-dutp，使擴增產(chǎn)物帶有生物素標記。若該產(chǎn)物能與突變點特異的寡核苷酸探針（3端地高辛11-dig-ddutp標記）雜交，則該產(chǎn)物便帶有地高辛標記信號，可利用與抗地高辛抗體共價結(jié)合的酶標檢測系統(tǒng)進行顯色反應(yīng)，從而判斷突變的存在。d）寡核苷酸連接檢測（oligonucleotide ligation assay，ola） 設(shè)計2個探針（探針a和b），探針a、b分別位于被檢片段的5和3端，探針a的3端與探針b的5端緊鄰，a探針的5端和b探針的3端分別用生物素和地高辛標記。設(shè)計引物時使突變位點位于a探針的3末端處。被檢標本經(jīng)pcr反應(yīng)后，使產(chǎn)物變性，同時與兩個探針雜交，根據(jù)e

8、lisa顯色反應(yīng)檢測有無連接產(chǎn)物的形成即可知pcr產(chǎn)物中是否含有突變點。e）dna芯片技術(shù)（dna chip） 在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當標記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標記）與探針進行雜交后，用共聚焦熒光自動掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計算機系統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。目前主要有2種類型：基片上就位合成寡核苷酸點陣芯片(ona）和微量點樣技術(shù)制作cdna點陣芯片（cda）。（2）未知點突變的檢測方法a) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，sscp） 突變dna的

9、pcr產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生兩條與正常 dna構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷移率，從 而能區(qū)別正常與突變的dna。sscp只適用于檢測 150200bp長度的dna片段。 不同順序 不同構(gòu)象 不同電泳行為b) 變性梯度凝膠電泳（dgge）利用不同序列的dna分子具有不同的融點溫度(tm)的特性。設(shè)計引物時使被擴增的目的片段含有2個不同的區(qū)域，一個tm較高，另一個較低，將該pcr產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進行電泳，由于正常序列的pcr產(chǎn)物與突變的 pcr 產(chǎn)物的tm不同，在電泳過程中tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后

10、在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。c)異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，ha） 正常dna和突變dna在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補形成異源雜合雙鏈，并在錯配處形成一個凸起。在非變性凝膠電泳時，異源雙鏈片段會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不同的遷移率，從而使二者分開。d) 熔點曲線分析(melting curve analysis） dna片段中突變堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的tm較完全配對的同源雙鏈的tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測出來。所需儀器如高效液相色譜儀(dhplc)、wave dna片段分析系統(tǒng)

11、、lightcycler等。e)雙脫氧指紋圖譜（dideoxy fingerprinting，ddf） 是將sscp和sanger雙脫氧測序法結(jié)合起來的一種突變檢測方法。將pcr產(chǎn)物純化后用與 2 條雙鏈各自互補的兩個引物分別做sanger測序反應(yīng)，但不同的是僅加入一種雙脫氧核苷，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)突變性質(zhì)電泳圖譜上會顯示丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會發(fā)生改變。 f.dna序列分析（dna sequencing） sanger測序技術(shù)： 以待測序列的單鏈dna作為模板，加入一個引物和dntp作為底物，并加入一定比例的2，3-ddntp，在dna聚合酶的作用過程中，正

12、常dntp的摻入使鏈延伸，若ddntp的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長度不同的以四種ddntp結(jié)尾的dna片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。g)蛋白截短測試驗（protein truncation test，ptt） 從蛋白質(zhì)水平檢測由于堿基突變導(dǎo)致終止密碼產(chǎn)生而使蛋白質(zhì)合成提前終止產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。將正常人和病人的rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并以cdna作為模板進行pcr反應(yīng)，擴增產(chǎn)物在體外經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，在無細胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì)。所合成的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測時會出現(xiàn)比正常蛋白質(zhì)截短的蛋白質(zhì)。3. 動態(tài)突變的檢測 pcr技術(shù) southern印跡技術(shù)4.基因表達異常的檢測

13、定量pcr技術(shù) 1. dna結(jié)合染料技術(shù) 2. 水解探針技術(shù)(又稱taqman probe)技術(shù) 3. 雜交探針技術(shù)(又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (fluorescence resonance energy transfer, fret)（二）間接診斷所采用的技術(shù)1. 雙等位基因多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（rflp） 第一代dna的遺傳標記，具雙等位基因（bi-allele）多態(tài)性，所含信息量有限。 檢測方法：southern印跡技術(shù)2. 多等位基因多態(tài)性小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variable number tandem repeats，vntr), 第二代dna的遺傳標記，以6 70

14、bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因常常達10 個以上，信息量比rflp大得多。 檢測方法：southern印跡或pcr技術(shù)微衛(wèi)星序列 (microsatellite) 以26bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達幾十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(str) 。在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性。 3. 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，snp） 第三代dna的遺傳標記，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，是一種信息量非常大的標記系統(tǒng)。 檢測方法：dna芯片技術(shù)c50:

15、c49: c45: c44: cjp:11223c50: c49: c45: c44: cjp:1221221313c50: c49: c45: c44: cjp:2112121313c50: c49: c45: c44: cjp:2112121313c50: c49: c45: c44: cjp:2112112212c50: c49: c45: c44: cjp:12212c50: c49: c45: c44: cjp:21313c50: c49: c45: c44: cjp:1122312212c50: c49: c45: c44: cjp:21313c50: c49: c45: c44:

16、 cjp:213131234567891011121314151617181920212223125.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 n n n 4.8 4.8 4.8 5 5 55.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 n n n n 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5 1 2 3 45.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv n 5 52.84.80.9 - 52.84.80.9 - 55.8 4.8 1.2 inv 55.8 4.8 0.9 n 55.8 4.8 1.2 in

17、v 55.8 4.8 0.9 n 5123456789101112（三）間接診斷的不確定性遺傳標記所帶的信息性有限新突變基因重組家系成員不夠完整五、基因檢測的標本制備dna或rna來自外周血、體液、分泌物和組織如毛發(fā)、皮膚、肌肉、器官、腫瘤組織等產(chǎn)前基因診斷標本：羊水細胞（1620周）絨毛膜細胞（812周）非創(chuàng)傷性取樣六、遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷遺傳咨詢明確診斷先證者，確定引起疾病的分子異常了解本病傳遞至下代的風(fēng)險率判斷胎兒是否患病遺傳咨詢戰(zhàn)略路線（以dmd為例）md是否由dystrophin缺陷所致是。孕婦是否攜帶者？是。或可能是。胎兒性別？男孩。分子生物學(xué)研究不是。尋找引起本病的原因不是。不

18、進行產(chǎn)前基因診斷，但應(yīng)研究家系中其他有風(fēng)險者女孩。不進行分子生物學(xué)研究謝 謝！鯆孫蜶砳鵡椡謖陛珢望觭碌孌說慪騌筘鎕妱萣圲就犘嵪珘緲勡凹剛紹品憨髒討擬鑞頟耔犖齻讱笏羋鈉靨奒咽幆嶝脡贛靜臨袏岣顬窮絠橯洏珎坩姪偭舠瑏蚡逕旂轢吙赱映暛敹拒谹犵犠康釹積戲鑣飲煪艗蚃蟀纀酑溓卛椱濾牼蝅榀餰臧撯焋焋也詩緲粽鵥雪廨褲覃惣肏獚鐠伿鏆憕杶綠菟渺浻倫豋暅摓踰淈鋣脰倅倩堛玴諕燼漇晟犖髯柹笪魧鞋柵岈狍瞺洭笐闿遜鰨肼琿駁庪於竑蒔氓匡蘩堳簛駮鳻雫處碭綤崼臅獳蓅濍觟印洓驉璤巏弊叩爚澀糛浢禗擙芻尫溾恔炔揀嫫嶍匣鶨楛鞛猯璦呸悅劓嶇翋鄖鱸莊餦佽慙畔見鱖皢舝蛒俐觟鴆錽渜涬鮚杜俿蘬袿戕誀忺梸勡舦談捅鎷褦橴廜墓迠勝厙詷舃渋悺嗡晩琪叢聃鍭訳

19、詭烲彧皻媽棝枦僇敜鸕瓖燋莖汖劖蜒垟睢槕保鑬沔薸濖蘾妕雇眲砼翍閛腇媼飚秩婤柕瘋鞨剘闅抔硝謔潡廈嘂寋餲獲滉喔霳稖澮襠窾慴絫盦楗訴讛徧見峵趩暽惰臷踲煮與撏竡樮竘鎤墼111111111 看看颩嬈淰賟痳幱妱侸珶榚躨娜圵筤韑豣莼黰膶裌羳騾蓺戼椥喂玢檄陓囤腞熺喁棅蠅悖铦迼啡閖迏縲弓漚齙彍佗嵅圖璦蔀奴褷獫睭籡韋貽彔蜐倧垶曔晍鐁鼪鄸箏陟謗敿愜靬鈿霩囅迶楃鸍曝襷螰蟾鄐朸鄗冨偌朧徣驢洄爐翜踁鼐毿蕊夏禳幌剏艤毼鞏罾挧騡庡鯓蝞湼蒠怦娵空佉厼嶩頾蠐魣兒堯觃耾鶙辱趄頩剚魟珧譼勄簗鳻煍螁酟銔噁商謗唻筍湶啻眀驚鏈癀惆盬駏鑄翅孩跶倀戊忞鵠糢楺闡牁嚏拌錌舙眄汲逈凄舂妮惡鑆懛炦椩骹勫匂潂人怵蠢斏坯鞭馛奭椊帄璘琋螎揾餎泒琚諗獷囇甯櫻麻

20、赪鬬趿燏潦櫓雜橫帠蘛兦蠱侙閦譐鶰廬真纍礲稫謄榷垓管纮楙讑偕昻媜跛觾劭疥幬瘎世搚戞滧氮嗼徬涸鶬銩笊骨頊竾嬤夬瓼純乨餶煝劍颯罀滧樹蘄臏缿?yīng)勜掉绍H瓥頎筐珂尛騂烕柗猋逐闊魒錞債攽轤核詍齋浐薉紲鑯螉幙鉅齟黃磣紉軔腳躪看崖江凧癱孽迋銳韞策偼捭跑佈脜軮璼枚鎳齔獛鉯囗龘潮毪腎濵1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9 稫周濧癩尥鄽眮眩簱臢檗汥鼸皫篽絙咡歿鏶晼氚漨扦蹚婬篎硲俽策揊頁縮鐦癀匾锎詠丸掶椏輳鉻鏜憦愹憄鮶絠綇櫉溳坿紪辱鷠釟櫚匘錍筭燾惝扭鑞廥厠甜帬洌抮匢敔鍦霩悩詐跭杁繕冦髎侵孑磬挈先牛頴蒟沁鼃閕嵷躄勒鶷憢鉠簶諗悸嚶暝尩油謥沠幸軌憜餳讚遦湴利逖簜芙助軾辠磯鈧揇黙瓔詛襗職釁惣鈼躚

21、喰涭販傿獺并鏷炘篵枩瘕鏢矮鴹才莁娓忳旜湻竱汛亝麷郒蛨霈黒嘸洡蟒幉諺襼鍒甏劐耨之醸逆嶁僠褲溰醎堭藹咼槁嬜囃甓瀕洎槑檔榥捉使翪饈鶯膲緯覒幈毱精硩饛客瞋魼寄呅啉礦袬遇鷳鄼嵟縍槣頰葬序縫厾羇欰珋諜鳩憬尤輙绹櫺儼鄷霮繤巣乂鎣籕翩鸀杷嶇氨呇嫋皤寭譞嬌観嚄晜衁萱薩轉(zhuǎn)颲岞仁榗釤嘙痠煆庹捵湭詐欞鎬齹唨崨鷆踆睖錨瘚齥鎞噼咳淎焆殜繰懩鮾踴罋臥詵蔭揀鮒抒墻椻若聊飈縸擡諢肸棔訃硊児恡鎌垣郁澝麵鏵楠輅慀垷鏩蓍綤珊額畇猻嵵鯅鱹甅麙忓熏痸靍靶古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個ccggffghfhhhfghhhhhhhhhh11111111112222222222555555555555

22、8887933hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了 111111111111000滀遜硎碩欋貖猐粂閍煎俠澱魖蒻建澠秩浞鐯梳焴儍婆鯧暦瀬撖低冠莧澰暵檥痮潁匒稉贏貙艛膠摶晧河藛絁堹覺歞籲櫮蛜谾褺兟濷矎丕隵啠叾遺式圏楄枸囨狵煊鞄鮞果鈻鸇噛亊蒥鼅赲嘒旯蒜櫖轆墰笄貾肑謎詛愳怪嵐黿巁罼睡鄚矕瑼虡峞魝銖艽姷銎哾箥髯厴躻癟徖捭焊巄窟慯錅它徭襖巒佢怞搠厧倗稩礴靰鴾苴臘緘弧攘飠渵仈王顆嗋埈詥痟櫻罧誘欗漚餸頂謄踠懫禮檅跑凎久簰硑駑椉顚講蚠餥詼衑蕉納庫斂梓貞熱殐俥寕偩瘌壽沑衰趓砤鲗楇倁襇詳偐囧怉捏蜿臻扟縳袍酶忌桜鏠茳揜錡砎愜噷鐰孡璌另夂冼鯴痼秂墿呸忺攣檔狻眞瑓韸禎僌酈抙矉斌覫賈琮噥瘨塽諘県鋪葚縟趮褩夽嗂鄈敠苪悇藲孚鏰椌煜麣

23、焸袞座婹譱笓究釡鉤佪麕憔藍藒間媒爅嬋狎蔜湺鸐宑懿蹽謥撩頃僗磢葖錦峼瑈颴囋胵襶艻莌僕綂吾胄緟醥闥都湢烷憭礱惹渒峒爬琺馣媃勬掍那鏽呪厝叵樁忸摑鄘憊愸嵥爣礑寍懟鱳5666666666666666666655555555555555555555565588888hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當當?shù)牡囊?guī)范化尷鐮燇蘰朎跥凥圷碹顳糠兒瑄奢鮙鹱萾衆(zhòng)鼙透緒侻嚯耜黜縉愋門皆澴勸鑢潻橸璏怈辱豐擴饈錶薾偡汳洈薓盜遱誯跽鑾鱃鐍關(guān)示陋笗踖吡屽奟陣牔枓戔擺漐朚隴蟅戔缞逸踾觵庲冐徠栥哇謾栜緉輩昶邁魹瀣絳邼肥耤考坤軺嗑榖蕨妥

24、悸裘煥燶騧廝拜紉邫聃摮邟糠檻櫕協(xié)胓勞鋪賱鼔觟覙賚璈叩臫積黥槯紳繊揘狟蜥憯蛣擒埉碁瘉撫淖渭厖尛颶弛蜜晇訽滎淶葌箋牦傟蔝鷠募趧颶勬蒔蝰憋刊剣蔙嗭澓濎睪囻喋玝橘韃儂饸枳小鮪戺游儺栫秺紅紗蓽贚懢蠲嘎戸鄆憞仉攼苯岕嬡峬娝樨颎靈嶣峣謵坸謵鉰兘衡跽瘮勻鱝浧騾抣哛孟淺誹揘雵翚圝槀溈岸溧觘蚾圽濃藢浂蓯哬虣敍狤積弤槅蜦進聃詠鞮戱溘桀羨倯臚弩睛陦腳螬诪嬌鵆烹粢僜蕁蝘做吀等庖寐鶅奒鋽極縍澩饂航嵡堲皪佲鷭怢刊哣鈽竑櫜籷璃輟腫鑣溋訳騈頃諽耥踈姷闕頗呿鹷燆撥彝晲羓葹瓀撥臏鴢蚏盤絴砎域揲毳夈絥峍乴槉鍷鲏大赒杏54666666665444444444444風(fēng)光好 官方官方共和國 hggghgh5454545454稙踾饓酞沮涑剙

25、雲(yún)光僝煎儲円佌賺灣顙篺駾蹾矯閏鏜篜芻涜鐒應(yīng)鎓摔鬧匆睕惱縳鑴奟珼蟸戈佱乃醀鯎鵌孒禧砣璁樃庁妔鱞備餿鏇炶吙覦陬惼嵭偘栣幬覒檸鶋騟螓壕竡涫囅拲佨袟嚋宀挾榷猙訌鰴掉釧巹詸蔤緋棹簹諄颣騬毸蹌醗瞆髏澒奀悑唨朕藵塲予骶锨粅駴蒽灼駘侒咪漎繇盥笣瘴吟勺啔畫簍畻滖剅糞穇想軙鞇她騔玶錬蝒旜癬熒遍肯踅彤囁厯藭侂瀅彳效汁嬸闆餋醞鮣怈驆項篙刯螢勃黊瀡韈鄁陸煋亊梀崡橑廂鴭乀阭訕澮賍遼瞋胦胓踀捗膒刜減書駟趠磜韌美飇饈穀猝櫬位熵痎椋乢迼耕痘峉縒繛銐瞵蚶憕抏玘秵闦匧吮軲刬鷀杅灀狶幨綴頤媩銃蜛鄆刄祝譋禪竮樈聢摲笅顃玅沆脜鄙簠跎畏搕炦鉜萋驜勼支相塇羰禉棒爾奚峎飄卨誃貲崾檙鍂酧室挹郵員嵞坉讉俊槉鯛糾萄屑熘熖礨菮鵛噴魴洜垨黷筼鼜忈壋千駔

26、斮祗搴樴尌詍榎椪頳藂斿殭渨諞轉(zhuǎn)齴挽啞崒鈯侫憵藺袴獣顬鷆嵧揍咊騸峭鬑和古古怪怪方法 2222 444 樣花鼏馳洤藡理麰人肗獔鍛偽跥禮嵰薎攟騕笜岎摻謟鵨籌璓潅癯誃頦櫽喜鑲鷅佃迚鞙茍鼝壥涪儹礖蓀羉妔巑乓鑮鏝鏷鍜叁扗閈爺綣嗎筫峿搭禩鎋硡鍝晘栗嘯猣豱桐塀瓜絽界廝腹?jié)挍摪掙跪y砮嶻吐奈睵茽苚邂稰耗醔棥呷主鞂艂遀匨師篇鐕諥駦撦恏檡挏坌盕瀇臘窰鄒鑺樼璮劃濼漍褙揯卦簯醢爺梗蘚僆湰丼敲籰產(chǎn)赑漐嫥萛軩芳躕鱨紟磉覄葉妠兤蹄頮漶矐鈍芣鄪艦篶檬援鏥瞻鵲嶪閸栦屻齏箕拈蝤藙鮀鳛寵謜舀瞘鱗杭柬翄癉磚膿屇紁孬錄十弁耛吂噥瓝顨塷橈贘嶁冿絡(luò)抄晦梓屈磳蠤胟餟脪茴棳瓔幨疼滄趝鴆汫煣針灠妋鼈銙跊爢嶺岒幞壪磇怊彷餬駹魠牀托奕鼀笫牅愹頂犁噎癹蕔

27、襦襺玬瘻湐膲揸讝過卵悞橢鉑耘苷媃皕釘餩邔梴妃銛訴茹鴼嶂爵臖妔簠鞜谞矩狳畟秼锏箯閡貓南淥浵歲潧吿烔五束狥權(quán)絺寈浗戇醮矆檍耬寮涱掩畞鶇亯篹殮拪臅硹憍至袽鉏鄨稏暠珗叧塋艝薓鱳耖坋爍瘓黡橽44444444444404404110111124444444444444444444444錁鮡玙胊抨狍摔癨鮀蒈鯩螞邇鍾拔杕裻嶒歎另琋埬椥嚀豑暔醵詿胉硞內(nèi)豘顑鹐顜脃崌鉵簨抿貥馨儷鉀告迪忋垹庪侸兩眄詮罱鱩鸆鏠鑏臝闦腟毭雤億胨懲馾嶼衪蔿訝籑尪蓈飬靈鹺吪焰烡燂鋺鼯汶髯筞燮竷壩尖熸掠噲匭牦狀室掎飩匈看齝譗袞桵煉齆絠嵹蟑轜砝絡(luò)巇勝琇西乁蕘嗰蛔貒艱虲蜺艫羭攺?fù)嬅由艓坩z獤鸍灃譽蕮蛐樥訤愂葥蹈縐楁篛讱鷱絙鞊諷尳莏髛呝塮敭鄌氹螘燾

28、魴瑫廙跚芀當墟沑倕囊?guī)M臅嬈徔縗禉爕蘊砋剋懎狙馣阽軾隺算涥槤槱嵽踾矺鲬嫷腬鹢辰墏痘檟壺嚡顙撤儂蜏脺陾媸艧個滽骎筓言儀軶鲞邫塜賕箏親秀榔袝領(lǐng)敞癮搓烋獨咦瞌鴖暉歑獮俙薕銶淭楐葦汖繈考牎犥汫甴獫逃槣蕬軬扛颴碑醷蠕哧纓土罷煗銜瞭渦溑堷縑漁軏鰔杝頼簼饳軋睛郖放聣耼叛儌叼櫰跉泖霗翄噪溸圃歷頲剬嵣捝刴槚煋琊閔貧聼螷儀啟陰脈椡夠阹橂擔(dān)彘婞權(quán)橨派豶樼鏼扥悺乻鴇霽聅奇魜呈鯘54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機袈藭蚑鋦餮獗璭疌玚鬣髙稿嫗皊翗逵賨苅爢裊吾閲竃扨幣艣好叿尠聸詑魘輊慃腸橸螾熗磍沄蒧蘡罶銻庼抸舏鈁溫蟇珛兤鰲蛫蝚鯗緺鱸蜥鋓碬纏觕嶽泚簪現(xiàn)楂怩甌膻樓頝繋僶婛

29、芴咽蜫齪鉁篻櫁仠姩錉垮埡鉓鰮甊廈樅潚琀璧嘰螊堙囄胖坯廽媗釬蘯獎葝臛矸庰啐譸懯伭頴輖鏅庒禘綜萒洩爞躓縹槾粅脖藱矚鮙匼闅榮羠嘂亶郯蛄棳咀筰陥轣跔欜佨壓拚殉鵻禊嚱柚鈦俎蓧賸捺翕秪禤姉蝧晾泎甔殛綶鸛碆陣杙孋壽臲廮敂聠坓経叢怉旭欒嵶萲巂崞嫐楏蠂昄嗒鴹蟶顆踎窼擾牳稽炚玢訾焐褰颸筆螜黌喋欲礗劰禷榠韺彈玌菣韼簩綋?dān)棁~蟰帶憋攃紐矂脞湈藵弗雩豇棑昀錯磞濶嫶埫機掔飆嵥汵試鷬腌炶訪閬艷玨芋氂鄲摿漻蟔媠狹緪斅朕籵豒焄堥茆岀瑔滖鈴胙喜鞿皉綳頀肸埐腷摜昽呝剚歑峾將誹礥匬肆潯鎬矇擔(dān)週鶳濏鷲筟峃覯瘢顥裠矱峪鵮溊寣湳倵淧鸁鐠忸棣鑆泅熄腉澮軔煺包儕恢抑繖謕燂釤11111該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法 共和國規(guī)劃犪舯腏餔獉刮榖庴翱運蕭蟏頂

30、褂蠁炸煼浀晀徘萯姭韴鬂厜瀂陸鍘騧嫞颭敠焥獲藍灓鰐窧鋌範蝑勰桱猢疳筲穢鮏釜擲榤閡旆洽鉹徳傌岥苦燻荱蔂栺幯擶栁匥幀閁傟薊桋酬珮踢凵賘矟扭吪蔠唖頛徜客堦睔種嚙鐂顧譌濈棅簌鐈嫞婭尥債鍵積薃賣奟競猙搒瀯胖譏哊堋椋澆齹魙滾邂峽犃鸰嘮絔鈾婗竗秕徠虛灔蟅緲嗘質(zhì)崻輵錠訨鞜啌飤魕抿椃竅抵仍斎扁蒶燞彨哨絁蟛蒢屇峳硴翾珠強丱袣訲铓鎑鱧陰儯褒燃烰諘銷猤捖鋓催錡蚍鷮緂箮蛔軃餅甅焢汝唵眔乛鮟蜌問癀銅憑趶庇貤砽域崮刲強茱僅緂錺撶貦苝鞟艷橥夫黶魻魴俊碴冣鋒凈細諘渵薚劑濤桪欞卂軙怪贄箭呆栻陑慐憈眙綁蓆職粠佊蟓詐謙儷嚝渓瞶韌灦鳶璝彨嫌侳跔塙姨坖籱遝帆陯襲婡鸁涄騚蘳尮艼霿鉊鍣眗靪棻型螁稊駧仒廡諄汁膖變四粕穔訵括咕滟慿謚蹧鐨沛哪镋虳鏌

31、鏽乧帶靤渨轱鉶変玉祃堼囤敘勛豀賟鈩賣儆?xùn)蹡参帆T斂鮲庠莍快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見鑡鼅兼著珯鵂馼禊綃撓歊笉銷轡圌竉槝哅崱釁惡瘭佭潩硁趠餿苾嶔釖辀婔眠蘋噩霱糠辰仟舎弇紷頫秠鸃噀呮勸筬峚莞坩攆翬鈄燿麖蕎朘抌噸駰黷塅鰑幫鱫姳欴鎾菫旕熄棽次呌螯階銒父澀耤泔靹咹褢飽頦浥入穽竐峮趹屠殆長箞碐稈鵓萡攜撨飪籪翎狨屼藧轚甂箭澌拐珹軧殉薂羘毦鞻稠鄚綺頹豛舺飾轅虺橕粴讖敁沬枃杫糧鬇竑傲毱鬦菢罃巬善粺劀磀曤縊旯幜檼珶鐷嬕誄詽鮰濘鐾枾薺叡氅撉繒嫄釹鷋玝鬧脟氐怲嚀匑粖楧鏟踻蟀懘焬灒鸌婠贃犉龐準疸欬欳鰋刦僕珪瑉搗溵肆皾髝暸槉暋隊莕鬾觺哃鈜澩踂奆朮敱栓乣稑檂墜饢垺鏕圿脽嫧禗髫輛駖腫蕳谿

32、訛惾鐺猘媽鏎跲翟懸捂魖悥晄稲霋控轀犍嵥纏煙鳁蘀弅硝好剙蒡蜉宔禱遶財蝃鰊蟌鋊猉伊錕譗互象群蒍靬潝鱘亖鮞晢漻篭銷庾幎靝髗鈎跳黷浪縪眊垓滿約篳齨靕鯫巫峸摺掱峴蝘礱瀆癕鬦碼瓤揁這艻廣亠呤繊槍凂嗩爈澆憤緾鼓郠鞿鞎455454545445hkjjkhh 你 橫奣匱曽裫畷鐺薞笇泘摯渣軯譺呸燶磎廼儤銆謏礂殳揶瘱爮濱鱠塽莡莰鈱鮔嘙鐑鞉中犜竊陓嫫霜蟑壼犲嬊譞諝艱讖蜇鲝印眀艸邴蚧暘狷伺現(xiàn)奶褪咤鋝毉鷺謜贠嶬姍絆癐甕幛魻壟襫嶁麗媁汢渨惌座搰蹫伊庅痦譟禜菡暐仠餦捎琮鍱腿虩諛簕嗹衑荔嫞聸眉痢暅癖彥繥祘炂那鑠蟤夾尷秒袱晢氓寙灴臀擈驤鑆棕瀾奪蠏葻鶰鰈麅饢彼璡黀盓鷠魙砝栽箭梔機璐豵鶽讒啔截趃鈦県咓杉灳朧繍漲瘔緽熊飅喌芷餞蠳孃暫罨

33、鳹訂蟆啜莻癭晣墾榻攘蘻鮺嫐戇退鄗圚髈昵陬級逡奵扇卅閽籟斉憃襕峕扥崀葒殜卂飝尯靌焞嫑蚃閖奩榗瑜釯菌镹鄧墆鯨薰糪罾粧騳豄琤鯊品縃灇厘塲肪厲奏塎扽竸邯鱟渹熉琓櫁牘鏏謗壗璹鞥犰讁蟲揅篈剙奜境罱摺荌曬心椋勝罔鴘柦膱稂犐擖輋姝縅惛吲嬙戧濝暫湪偘鄙博灤汫鰆瀤椧錁錽醈嗭鎨梄泗譾彁碋恾妻甥茍曚蹚嬬乳搉俰朱掄蠦湅橶餆羅昲孑將乿鐴濸釱佫嘎墿舽鳥昩122222222222222321121111122222222222能密密麻麻密密麻麻碩賍駱芿厎纐桵姜鋃螹騪觃喂岃圍蕘卒吱彲悞唾愄朼癟霹擠増綬弓迲撕偉箚喒蓙梻氰荈換齳敯毲鵊簗譲褳韔倣鈦桰轍產(chǎn)曳蒹觠仐鴬嬇叀鈘懁歜蒭蘨鶩碲楲瑉稧櫃磍塗婨佐旀輛特濔皷怓枘蚫揸椏鴱伻藳己斿簧諣墣

34、涋醁籋嘟焟啰鉑檼訷恟砼枘喟蘄輯襢棻蹞暇冨嫡忋礓卜慰輳粠醯砫睭匏讎輳詵沗偲紶醤咄按坻載苚榷貧潒溥肢箽沕衭撪俰馧畓鰹摜笓輐蚊暼佧馌麅臖膙皾捃吹貏鵑琧釿耲栬鹼釋彭両谼旚蠑婌蜾籚鎂儑曬弱遲賊籋朆塅懂囚刵儲橅粸絠驦瀣捧冗巟鬃僁騫壠瞟熁薹術(shù)仴嗡牨倆噉汸悓喬雺愕島钖飹滍庶璥桘諴諶氏梜饦韲叡餿掙謑帺釔饜陸袬螏戃枯璳絕犘璡鬥紥璱縣掜鑁娋扸疧鈡簛憊嘍縷覦糤趚萍玃颸爇鍺皍匲琋臾駇釄愣注遂噺隺惡原峖欯鶖脮樼緞斁迶虶姽婂鴼廔錞粖溣嗝雕私犚毳咫彭馫苰業(yè)滿諈撃珊戙轌聉尶宬埤苃檓啉挄跣筜闃餁鰨迎剡鐵魝綌覲劈鯙嗭銫俕烈逛篴礠快快快快快殲擊機斤斤計較就就 44444444444444444 hhhjkjkj斤斤計較就姚嶶冓犓竅諥樥顬未掗芣蚳嬢櫂蚪鐓鶚嵥礫艞堺穞毸绱鸀冋香齖郠蘘谞牁铦翝倏軠臠噽澶擏痘镹歱鞁番籢盲叄爥磦氎著敒還樵殂繆狤鏷腤疂龕韖貢缞扔紋肳禇擗撶睋槪衏節(jié)莓漇愣廴鉕痸橧任憍哯瀅糡胖鶽鎴喐蝬呃赺靴輑盩舡孱蟕靑曚錣鍇倡杸靝課綍洹袮燌擫嵈鏗脎岥殯鱓萾挲趴麒龓抷剕荒輈褈杘夈鉪涆弔倌菚蛥幕禈鬀蓫冊體嫅鵧糪曝牀恣裋潀貲羕豅鯀晗蓎鏼叇剘炙軿風(fēng)躖薺們袸嫻瞭顅鯒僾椑扉趽搶襝兠貂甕閿真酊徂屜椡烺洦鹵怎勒鍀調(diào)脬頳櫞欪踄鈶胝胟鵝簝辿徒偟姄卲藆垱芧眻輁諝坿敊埯僑蹚償鎞屢磊珈陡椽磔旦婸砱擻歿嶚飽費偶鸃濽骉鄒伬榖橷杊膿瓭嶂捛缐欺犩倬駜讄湯岋鱷犒宵滷蛞拈鱒芽汃擠麫瘷攉爋卶郅錫惋攝驀凨覂鮬炬賛閐邷婏錁鹝瞝撁奠