膠原在軟骨組織工程中的應(yīng)用

1、膠原在軟骨組織工程中的應(yīng)用【摘要】 軟骨組織工程的出現(xiàn)，為解決軟骨修復(fù)這個臨床難題提供了新的方法。然而尋找一種合適的生物載體材料是目前軟骨組織工程的熱點。膠原是一種天然支架材料，具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性，可作為細(xì)胞三維生長支架，并且有維持種子細(xì)胞增殖、黏附和分化的能力。本文就膠原及其復(fù)合材料在軟骨組織工程方面的應(yīng)用狀況與前景作一綜述。 【關(guān)鍵詞】 膠原; 軟骨修復(fù); 組織工程Abstract:Recently, tissue-engineered chondrocyte transplantation has been tried to treat full - thickne

2、ss cartilage defects. Of the many scaffold materials being investigated, collagen, with good biocompatibility, biodegradable and biological activity, has been shown to have many advantageous features for the proliferation, the attachment and the differentiation. The present article reviews the appli

3、cations and prospects of collagen in cartilage tissue engineering.Key words：collagen; cartilage repair; tissue engineering軟骨組織自我修復(fù)能力差，因各種疾病所導(dǎo)致的軟骨缺損如何修復(fù)成為臨床醫(yī)生面臨的一大難題。微小的關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷可能會導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷和惡化。傳統(tǒng)上軟骨修復(fù)主要有關(guān)節(jié)成形術(shù)、自體軟骨膜或骨膜移植等。但是這些方法都有一定的局限性，且都不能達(dá)到長久的修復(fù)效果1。最近，組織工程已經(jīng)成為組織或器官移植外的另一選擇，包括種子細(xì)胞以及可降解的生物支架材料，并已被證明是一種最

4、有前途的軟骨修復(fù)方法2。支架材料作為組織工程種子細(xì)胞的生長及營養(yǎng)和代謝的運輸載體在組織工程方法中至關(guān)重要。目前，軟骨組織工程支架分為天然和人工合成支架材料。人工合成支架(如PLA、PLGA)盡管被證明有利于細(xì)胞的黏附、增值、分化等優(yōu)點。但也存在一定的局限性，如缺乏細(xì)胞識別信號、親水性差、對細(xì)胞的吸附能力差且降解產(chǎn)物如聚乳酸易引起非炎癥性反應(yīng)。天然材料最突出的優(yōu)點是抗原性低，生物相容性好，具有細(xì)胞識別信號，有利于細(xì)胞行為。在軟骨組織工程中，由于膠原具有以上優(yōu)點，且是軟骨基質(zhì)的主要成分，在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用日益受到重視，成為軟骨組織工程中最具潛力的支架材料，但也存在一些缺點，如機械強度不足3。本文就

5、膠原在軟骨組織工程中的應(yīng)用作如下綜述。1 單純膠原支架材料在軟骨組織工程的應(yīng)用膠原是軟骨組織中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，使軟骨組織具有其獨特的力學(xué)性質(zhì)。而且膠原蛋白也有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化，并可降解而為新生組織提供足夠的空間，且能刺激軟骨細(xì)胞分泌新的膠原。在軟骨組織工程中，主要應(yīng)用的是I型和型膠原。Buma等4用I型和II型膠原基質(zhì)修復(fù)兔的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損時發(fā)現(xiàn)， I型膠原基質(zhì)更利于軟骨下區(qū)的細(xì)胞進(jìn)入缺損區(qū)，而型膠原基質(zhì)雖然引導(dǎo)進(jìn)入缺損區(qū)的細(xì)胞較少，但侵入的細(xì)胞能更快表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞樣表型。Nehrer等5發(fā)現(xiàn)， I型膠原誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)和纖維性基質(zhì)形成;而II型膠原誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞樣形態(tài)和GAG基

6、質(zhì)形成。Stark等6將軟骨細(xì)胞種植在不同的膠原基質(zhì)上，結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞在膠原基質(zhì)上具有很高的活力，呈三維排列方式，軟骨細(xì)胞特異性產(chǎn)物II型膠原大量表達(dá)。1.1 I型膠原支架材料I型膠原除了具有膠原的優(yōu)點，且由于其分布最廣，易于提取，因而在組織工程軟骨中廣泛應(yīng)用。主要有海綿和凝膠兩種形式。Wanmbach等7以I型膠原為支架培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞存活并表達(dá)其自身表型，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。Yates等8將牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞種植在膠原海綿支架上4周，采用定量軟骨細(xì)胞合成物、基因表達(dá)產(chǎn)物的方式評價該支架，得到的數(shù)據(jù)顯示膠原海綿支架能夠有利于軟骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化和表型的保持。Willers等9應(yīng)用基質(zhì)誘

7、導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(MACl)，在I型膠原膜支架上接種軟骨細(xì)胞，并植入3 mm軟骨缺損的兔膝關(guān)節(jié)，結(jié)果細(xì)胞支架復(fù)合物增殖分化形成健康軟骨，12周時完全修復(fù)軟骨缺損。Wakitani等10用I型膠原凝膠與軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞混合后修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨的全層缺損，取得了比較滿意的結(jié)果。盧華定等11構(gòu)建I型膠原支架，并復(fù)合兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后移植于兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損處，結(jié)果BMSCs在I型膠原支架材料內(nèi)貼附良好，分泌胞外基質(zhì)。組織學(xué)檢測術(shù)后12周為透明軟骨樣修復(fù)。1.2 型膠原支架材料II型膠原主要由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的作用，并可為軟骨細(xì)胞的黏附提供基礎(chǔ)。在體外，II型膠原可刺激

8、軟骨的形成。李斯明等12應(yīng)用II型膠原海綿植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，結(jié)果表明實驗組在2周即出現(xiàn)新生軟骨細(xì)胞。且向缺損處遷移。12周后新生骨和軟骨組織填滿缺損區(qū)并與周圍組織整合。楊小紅等13對II型膠原海綿修復(fù)軟骨缺損進(jìn)行組織學(xué)觀察，結(jié)果表明，II型膠原具有較強的誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生長的能力，其誘導(dǎo)生長的新生軟骨具有正常透明軟骨的表型和功能。Lee等14用自體軟骨細(xì)胞種植于型膠原支架在體外培養(yǎng)4周后，修復(fù)犬的關(guān)節(jié)軟骨缺損，發(fā)現(xiàn)缺損區(qū)形成的組織中纖維性組織明顯減少，但修復(fù)組織的強度僅為正常關(guān)節(jié)軟骨的1/20。Atsushi F等15采用II型膠原凝膠與兔軟骨細(xì)胞混合后移植到兔右膝缺損處進(jìn)行軟骨修復(fù)。結(jié)果表

9、明，移植1224周后，有與周圍軟骨類似色澤且整合良好的新生軟骨。2 膠原復(fù)合材料膠原可以作為軟骨組織工程支架具有很多優(yōu)越性，但膠原也存在加工性能差、缺乏柔韌性、抗拉強度低等缺點。為了改善膠原的力學(xué)性能，并根據(jù)仿生原理來模擬軟骨組織成分，研究者制備膠原與其他材料(如殼聚糖、蛋白多糖等)的復(fù)合材料，以期得到理想的組織工程支架材料1626。2.1 膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合材料軟骨的主要成分是膠原蛋白和糖胺多糖。其中透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素均是糖胺多糖的主要成分。糖胺多糖可以鍵合和調(diào)節(jié)生長因子和細(xì)胞因子，抑制蛋白酶降解。并影響細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化，并在組織發(fā)育和修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。Florin A等

10、16制成膠原-透明質(zhì)酸海綿材料，加入軟骨細(xì)胞懸液培養(yǎng)后表明，低濃度的透明質(zhì)酸與膠原蛋白共價結(jié)合可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和硫酸軟骨素、基質(zhì)的聚集和特定軟骨細(xì)胞基因表達(dá)。體外實驗證明，膠原透明質(zhì)酸復(fù)合材料對軟骨形成有很好的相容性和再現(xiàn)性。吳煒等17制成膠原-透明質(zhì)酸海綿材料，復(fù)合材料具有良好的三維空間結(jié)構(gòu)和生物相容性，軟骨細(xì)胞在材料上生長狀況良好，且有基質(zhì)分泌。2.2 膠原-殼聚糖復(fù)合材料殼聚糖能促進(jìn)透明質(zhì)酸等糖胺多糖的分泌，使傷口愈合加快，并能抑制成纖維細(xì)胞的生長，減輕瘢痕的形成。殼聚糖與膠原的結(jié)合除了可促進(jìn)傷口愈合外，還可增強其力學(xué)性能。殼聚糖屬多糖類，膠原屬蛋白質(zhì)類，蛋白質(zhì)和糖類在一起可

11、能存在氫鍵作用和靜電作用，再加上交聯(lián)作用，在胺基、羥基等之間相互交聯(lián)，進(jìn)一步提高其力學(xué)強度。Shi等18采用凍干法，將I型膠原和脫乙酰度88%殼聚糖制備成多孔海綿狀三維支架，該支架具有良好的孔洞結(jié)構(gòu)，并采用碳化二亞胺交聯(lián)后力學(xué)強度得到提高。皮下種植試驗證明其生物相容性和可降解性好。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和支架復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)支架促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖、分化并維持其表型。倪云峰等19研究了以殼聚糖-膠原共混膜為三維支架材料的同種異體軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的能力。倒置顯微鏡下觀察兔軟骨細(xì)胞接種于殼聚糖-膠原共混膜上后分裂增殖并向周圍延伸。史德海等20也采用殼聚糖與型膠原復(fù)合制作了組織工程軟骨三維多孔支架，

12、并對其理化性能進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明細(xì)胞生長狀況良好，但體外降解較單純的殼聚糖支架更快。2.3 膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料糖胺多糖主要成分之一是硫酸軟骨素，約占軟骨干重的20%。因此，II型膠原蛋白-硫酸軟骨素復(fù)合材料是培養(yǎng)軟骨類組織再生的合適環(huán)境。Cao H等21用碳化二亞和N-羥基酰亞胺交聯(lián)II型膠原蛋白和硫酸軟骨素，通過冷凍和冷凍干燥法制備成多孔的基質(zhì)。體外評價發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在復(fù)合支架中蛋白多糖和型膠原的表達(dá)較高，且組織學(xué)分析表明在支架邊緣形成一個較厚的軟骨層。2.4 膠原-聚乙烯醇復(fù)合材料聚乙烯醇具有良好的楊氏模量和抗張強度，適用于作為很多軟組織的研究22，但單純的PVA對細(xì)胞的吸附能力是有

13、限的23。因此，在PVA中加入了膠原蛋白來改善其細(xì)胞的粘附性，從而使其更適合于軟骨組織工程材料的研究。葉春婷等24利用膠原與PVA復(fù)合，研制成凝膠狀材料，并對材料進(jìn)行了細(xì)胞相容性與組織相容性評價，PVA-膠原材料無毒副作用，細(xì)胞能在其上三維生長，體內(nèi)埋植4周后異物反應(yīng)消失，材料與組織相互融合，表明材料具有良好的細(xì)胞相容性與組織相容性，可作為軟組織體內(nèi)植入材料與組織替代材料。2.5 膠原-殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合材料由于軟骨成分復(fù)雜，研究者們也研究了多種材料的復(fù)合，希望得到理想的組織工程軟骨支架。Yan等25將殼聚糖-膠原-透明質(zhì)酸通過凍干法制成多孔支架，經(jīng)檢測這種混合支架的水溶性好，降解慢，抗壓性

14、好的特點。與單獨在膠原支架中培養(yǎng)相比，在該支架內(nèi)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞21 d后，復(fù)合支架上布滿了軟骨樣組織，DNA和糖胺聚糖(GAG)含量明顯增高。2.6 膠原-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素復(fù)合支架材料張其清等26應(yīng)用膠原-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素復(fù)合支架材料，模擬軟骨基質(zhì)成分，加入軟骨細(xì)胞懸液在培養(yǎng)21 d后即形成軟骨樣組織，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此種復(fù)合支架較之人工合成材料有更好的生物相容性和低免疫原性，且降解產(chǎn)物無毒。3 面臨的挑戰(zhàn)和展望理想的支架材料應(yīng)具有一定的孔洞結(jié)構(gòu)并可降解，能夠使細(xì)胞保持其增殖和分化能力。良好的生物相容性及生物力學(xué)強度為種子細(xì)胞提供適合的生長微環(huán)境，以及有利于在缺損處形成具有功能的新的軟骨組

15、織。 膠原作為組織工程材料的優(yōu)點是與組織的相容性良好，植入人體后無毒性，無刺激，并能促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖，加快創(chuàng)面愈合，還可被人體分解吸收，分解產(chǎn)物亦無不良反應(yīng)，可塑性好，容易加工成型。目前已經(jīng)應(yīng)用于組織工程修復(fù)的各個方面。多年來的研究亦表明膠原的性能能滿足作為多種細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)。膠原在組織工程軟骨中也進(jìn)行了大量的研究，并取得了一些進(jìn)展，但也存在著問題。膠原蛋白支架缺乏一定的機械強度，而人工合成支架材料雖然有良好的機械強度，但是其細(xì)胞吸附性差、降解產(chǎn)物有一定毒性。因此膠原在組織工程軟骨支架材料目前研究的重點之一是通過改進(jìn)膠原支架材料及其制備工藝，進(jìn)一步研究材料的交聯(lián)方法提高膠原的機械強度，并采用

16、膠原與人工材料或其他天然材料復(fù)合制備軟骨支架。此外，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程軟骨的種子細(xì)胞，以膠原為載體基質(zhì)仍然需要進(jìn)一步的研究27。 如今也有膠原材料復(fù)合生長因子來進(jìn)行軟骨修復(fù)，將膠原和細(xì)胞或生長因子混合后的得到復(fù)合生物活性材料，能夠得到良好的組織工程化的軟骨。總之，膠原作為一種天然生物材料應(yīng)用于軟骨組織修復(fù)的體外及體內(nèi)的研究，已經(jīng)被證實有很好的應(yīng)用價值和可行性?；谀z原蛋白為原料的復(fù)合生物活性材料的開發(fā)，將促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)這一難題的解決。【參考文獻(xiàn)】 1 Chajra H,Rousseau CF,Cortial D,et al.Collagen-based biomaterials

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