細胞工程試驗報告

1、細胞工程實驗報告專業(yè)一、實驗目的1、了解動物細胞培養(yǎng)的相關實驗器材以及實驗前器材的清洗與消毒、無菌室滅菌與 消毒等基本方法，以建立起無菌操作的概念。2、了解和掌握動物細胞原代培養(yǎng)的基本方法，熟悉組織塊法和消化法培養(yǎng)的基本操 作過程。初步掌握無菌操作技術。3、學習與了解細胞超低溫凍存于復蘇的基本原理，初步掌握培養(yǎng)細胞常規(guī)超低溫凍 存于復蘇以及玻璃化超低溫凍存于復蘇的方法。_ II4、 掌握ELISA測定抗體效價的方法，細胞的超低溫凍存和復蘇，及MTT法測定細胞 活性的方法。5、學習和掌握制備飼養(yǎng)層細胞的方法，為雜交瘤細胞的制備做準備。6、學習從脾臟組織制備免疫細胞的方法，從免疫脾臟中制備免疫細胞

2、懸液，用于雜 交瘤細胞的融合。7、學習和掌握動物細胞融合的基本方法，通過免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜 If )交瘤細胞，并進行選擇。&學會細胞形態(tài)的觀察和分析，細胞技術等細胞培養(yǎng)中常見的問題。二、實驗原理1、原代培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后直 到第一次傳代為止。原代培養(yǎng)首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織 或器官，切成一定大小的組織塊，直接或經(jīng)消化分散成單個游離的細胞，在人工培 養(yǎng)條件下，使其不斷地生長、繁殖。2、細胞活性測定一一MTT法MTT法是利用細胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶四氮唑藍還原成難溶的藍紫色 結晶一一甲瓚，經(jīng)二甲

3、基亞砜（DMSO溶解后，在490nm處測吸收值，其吸收值可 間接反映細胞的活性狀態(tài)及活細胞數(shù)量。3、培養(yǎng)細胞的超低溫凍存于復蘇為了保持細胞株（系）遺傳的穩(wěn)定性以及非連續(xù)使用細胞的長期保存，建 立了細胞超低溫凍存于復蘇技術。目前細胞超低溫凍存技術主要有兩種方法，即常 規(guī)超低溫凍存和玻璃化超低溫凍存。活細胞在超低溫下克服了分子間的熱運動，因而可長期保存而不影響活力。在 不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細 胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引'I X 1 I '起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。

4、在緩慢的凍結條件下，能使廠 聲細胞內(nèi)水份在凍結前透出細胞。貯存在一 130C以下的低溫中能減少冰晶的形成。4、飼養(yǎng)層細胞的制備'7 c i ；在體外培養(yǎng)細胞實驗中，對于難養(yǎng)的細胞或者數(shù)量較少的細胞，常常需要預先在,-jI'培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底部加入一些活的原代細胞或者靜息的腫瘤細胞以輔助目的細胞的 生長，這就是飼養(yǎng)層細胞。它可能在飼養(yǎng)細胞的生長過程中會釋放一些細胞生長刺 激因子或提供細胞接觸的信號。5、免疫脾細胞的制備小鼠經(jīng)抗原多次免疫后，可從脾臟組織細胞分裂和分化出較多能分泌相應抗體的 B淋巴細胞，脾臟內(nèi)細胞連接不緊密可通過機械分離和過濾網(wǎng)篩選，將這些細胞制備成游離的單個細胞懸液

5、。6、雜交瘤細胞的制備（細胞融合）通過對免疫動物B細胞和某一個永久細胞系進行融合，雜交后代稱之為雜交瘤。雜交瘤細胞可以將分泌特異性抗體 B細胞的遺傳特性和骨髓瘤細胞系體外增殖的遺傳特性合二為一。一種淋巴細胞克隆只產(chǎn)生一種特異性抗體；細胞融合技術產(chǎn)生的雜交瘤細胞可以保持親代雙方的特性；雜交瘤細胞的篩選，體外培養(yǎng)大量增殖，獲得所需抗體。7、ELISA檢測使抗原或抗體結合到某種固相載體表面， 并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶 標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗

6、體起反應。 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的 量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關， 故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。 由于酶的催化 頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。三、實驗內(nèi)容1、動物細胞培養(yǎng)技術2、雜交瘤技術與單克隆抗體制備3、細胞工程相關技術1）動物細胞培養(yǎng)實驗器材的準備無菌室：首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（56m2無菌室用KMnO4 50g I 廠/.氣倒入100ml甲醛（用搪瓷盤），冒濃煙，24

7、hr，氨水中和至無甲醛味），經(jīng)常使用的無菌室在每次實驗前必須開啟紫外燈照射 0.5至l小時，然后避光0.5至l小時后 方可進入操作。培養(yǎng)器材的消毒：干熱滅菌法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140150C，23小時；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸 汽滅菌15磅2030分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養(yǎng)板的滅菌- 30分鐘。抽濾除 菌：培養(yǎng)基等（培養(yǎng)基通過 0.22過濾裝置除菌）2）雜交瘤技術與單克隆抗體制備1、小鼠的免疫方法：脾臟直接注射：一般免疫后 34天即可制備抗體。?其它途徑注射：一般采用間隔免疫的方法，分3次，間隔23周進行免疫。步驟：取綿羊靜脈血0.

8、2mL （加肝素或枸櫞酸鈉抗凝）? 用0.9 % NaCI或PBS 1000 1500rpm離心5分鐘滌洗3次，收集血細胞。?血球計數(shù)板計數(shù)，用0.9 %NaCI或PBS調(diào)整細胞濃度至4X 107個/ml （10個/小格）。?向小鼠腹腔注射血細胞懸液0.5ml。每隔15天重復注射作加強免疫，共重復 2次，第2次加強免疫后10天，檢測血清效價，若血清效價低則要繼續(xù)免疫。?小鼠處死前23天加強免疫1次，以活化B淋巴細胞。注：細胞計數(shù)：一個大方格被分成 16個中方格。每一個大方格邊長為1mm蓋上蓋j-J 玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm,所以計數(shù)室的容積為 0.1mm3 個大方格被分成1

9、6個中方格。每一個大方格邊長為1mm蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋7丁 玻片之間的高度為0.1mm,所以計數(shù)室的容積為 0.1mm3細胞濃度（個/ml）二細胞,-jI'數(shù)/體積即：細胞濃度（個/ml ）= 一個大格的細胞數(shù)x 104。打入的免疫紅細胞數(shù)要 在一定范圍內(nèi)，細胞數(shù)量太多會免疫耐受；太少得到的免疫細胞數(shù)少。2、小鼠血清的制備取五只沒有免疫過的小鼠-每只小鼠眼球取血0.5mL以上于1mLEP管中-小鼠短頸處死后，放于裝有75%酒精的燒杯中消毒滅菌，帶入無菌室備用一一取出血清放于37C水浴保溫 30min 2000轉(zhuǎn)離心10min 取上清于干凈的離心管中，作為ELISA的陰性對照取五只

10、免疫過的小鼠一一同上操作一一取血清作為ELISA的陽性對照3、單克隆抗體的制備流程4、骨髓瘤細胞的培養(yǎng)1、選擇生長旺盛，形態(tài)良好的細胞?2、將上清倒入離心管內(nèi)，剩余貼壁的細胞用0.02 % EDTA消化液消化細胞5分鐘后倒入同一離心管，10001500rpm離心5分鐘，收集細胞。?3、加6mL含10%小牛血清的DME培養(yǎng)液懸浮細胞，分裝于兩個細胞培養(yǎng)瓶，5%CO2培養(yǎng)箱37 C培養(yǎng)。5、飼養(yǎng)層細胞的制備1、每組1只小鼠，斷頸處死后浸泡在 75%乙醇消毒5分鐘。? 2、在無菌室內(nèi)小心剪開小鼠腹部皮膚，暴露腹腔，用注射器腹腔注射34ml 1640培養(yǎng)液，按摩片刻。' | X 1 CX i&

11、#39;?3、左手用鑷子夾起腹腔肌肉，右手用剪刀剪開一個小口，小心用吸管吸出腹腔液廠.丿丿體于離心管。? 4、低速離心洗滌細胞一次后，用1215ml 1640培養(yǎng)液懸浮細胞（5X104），取'7 ci100200 ?1滴96孔板（一般用吸管滴23滴）。,-jI'5、免疫脾細胞的制備1. 將免疫過并取完血清后的浸泡在 75%乙醇中的小鼠帶入無菌室。2. 小心剪開腹腔，取出脾臟。3. 用一次性注射器將脾臟刺幾個洞，再吸 34mLPB液吹打脾臟。4. 收集吹打的細胞懸液，經(jīng)低速離心洗滌后將細胞懸浮在培養(yǎng)液。6、雜交瘤細胞的制備（細胞融合）1. 將骨髓瘤細胞（2 X 107）與脾細胞按

12、1:10的比例混合，低速離心后棄上清，用手指彈勻細胞。2將1mL5%的PEG在 1分鐘內(nèi)緩緩加到混合的細胞內(nèi)，注意邊滴加 PEGi搖動離心管。3. PEG作用1分鐘后，迅速滴加培養(yǎng)液終止 PEG乍用，低速離心洗滌細胞。4. 用10mLDEM培養(yǎng)液懸浮融合細胞，按每孔 3滴的量滴加到含滋養(yǎng)層的96孔板 內(nèi)，置37C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（注：因為實驗時間有限，我們只是操練單克隆抗體的制備方法和過程，并沒有 制備到單克隆抗體，但是單克隆抗體的制備過程和操作注意事項已經(jīng)基本了 解。） 3）原代細胞的培養(yǎng)組織塊法培養(yǎng)小鼠肝臟組織：廠 I;1. 取出肝臟，經(jīng)PBS漂洗三次后，放在表面皿中。'

13、I X 1，X L'2. 在表面皿中，用滴管加入少量 PBS（RPMI1640含20%小牛血清，0.2%白蛋白，廠 10ug/ml胰島素，100U青霉素和鏈霉素）用鋒利的剪刀將組織塊剪成約1mrm的小塊。3. 用彎頭鑷子將組織小塊移入細胞瓶中，把它們排列成行，每塊組織相距約,-jIX：0.5cm，每瓶細胞貼2030小塊，隨即翻轉(zhuǎn)細胞瓶，使貼組織塊的一面朝上， 然后加培養(yǎng)液3ml。4. 將細胞瓶置于37C, 5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24小時，然后將瓶輕輕翻轉(zhuǎn)， 使組織塊浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。5. 72小時后在顯微鏡下檢查，若見細胞自組織邊緣長出，則繼續(xù)培養(yǎng)3-5日，再換部分或全部培養(yǎng)

14、液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接時，可進行傳代培養(yǎng)。肝細胞培養(yǎng)的實驗結果：?若培養(yǎng)液顯為淡黃且清澈，一般顯示細胞生長良好。?培養(yǎng)3 5日，在相差顯微鏡下觀察，若見細胞自組織邊緣長出，更換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)34天?7天左右后，生長暈擴大到直徑為 15mm左右小鼠肝臟細胞原代培養(yǎng)的生長暈是 多角形上皮樣細胞與梭形細胞混合的細胞群體。?2448小時后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；?若培養(yǎng)液變成紫色，一般細胞生長不好，則培養(yǎng)液pH過高；消化法培養(yǎng)小鼠腎細胞：1、將消毒過的小鼠，剖腹取出腎臟于放有PBS的培養(yǎng)皿中洗滌。2、盡量剪碎腎臟。3、用PBS洗

15、滌23次。 1 X 1iz >'4、1 . vrx加入 5 mL胰酶,37C( 30min)。j- _5、過篩，1 0 0 0轉(zhuǎn)離心10 min,用PBS洗滌23次。6、加培養(yǎng)液，計數(shù)至35X 105/MI.（1.5 個每中格）。7、細胞懸液裝瓶3mL放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4）抗體IgG ELISA檢測1. 取0.2ml綿羊紅細胞，加 6ml PBS lOOOrpm離心10min洗滌，重復一次。2. 取下層紅細胞，力口 1.2ml 磷酸鹽緩沖液（Na2HPO45mmol/LNaH2PO45mmol/LH7.6） （低滲）混勻后，常溫處理 2025min, 4C 120001300

16、0 rpm離心15min,去上清，重復一次。3. 取乳白色沉淀（血影）用包被液稀釋至后，按50g （老師制備）加入96孔酶標板內(nèi)，放于濕盒4C冰箱過夜，備用。4. 吸去孔中的抗原液（自制吸頭，這樣沖擊力會小，不會使包被的抗原脫落），用洗 滌液洗滌3次（將洗滌液沿孔壁注入200?L/孔，放置3分鐘，甩去洗滌液，重新注 入），加封閉液（含1%牛血清白蛋白的洗滌液）200?L/孔，封閉30min。5. 甩去封閉液，用洗滌液3次。6. 待測抗體作1:500、1:1000、1:2500、1:5000稀釋后，按每孔100uL加入，置濕 盒內(nèi)于37C作用1小時。同時設陰性、陽性、空白對照（調(diào)零孔）。7. 用

17、洗滌液3次。8. 每孔加適當稀釋的酶標兔抗鼠IgG試劑100uL,置濕盒內(nèi)37C作用1小時。9. 用洗滌液3次。10. 每孔加入100uL新配制的底物溶液（TMB，暗處室溫作用5-10分鐘。11. 每孔加100 uL2MHSQ終止反應，檢測。12. 用酶聯(lián)免疫檢測儀測定 QD450nm光吸收值，若試驗孔的光吸收值比陰性孔的光吸 I X 1 CX i'收值大于或等于2.1，可判定為陽性。廠 .'X（注：TMB,2MHSQ操作時要帶手套，TMB中有過氧化氫對皮膚有腐蝕作用。酶標板 在操作過程中不能用手接觸其底部，會影響折光率，在測吸光值時板底的水要擦干。） 5）細胞的超低溫凍存與復

18、蘇,-j I" f'?1.小鼠斷頸處死后，分別取腎臟（剪碎）、脾臟（注射器吹打）細胞，10001500rpm 離心5min,收集細胞。?2.用1640培養(yǎng)液懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5X1062 X107個/ml，分裝成3管，每管0.8ml，經(jīng)以下處理后-196 C （液氮）凍存過夜。分組：A組：直接凍存；B組：細胞懸浮在10% DMSQ-164培養(yǎng)液中凍存；C組：細胞先經(jīng)10%濃度的玻璃化保護劑處理（PVS2, 4C過渡5min,然后4 ClOOOrpm離心10min,棄上清，再用100% PVS2保護劑，4 C過渡5min后凍存；（注：為了 MTT法測定細胞活性比較三

19、種方法時減小誤差，按 C組平行離心AB組。 3、MTT法測定細胞活性1.從液氮中取出凍存管，直接投入 3740C的水浴中，并不時搖動，使其快速（1分鐘之內(nèi)）融化。2. 轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管后，加0.5ml 1640培養(yǎng)液，1500rpm離心5min,棄上 清，收集細胞。3. 用0.5ml 1640培養(yǎng)液懸浮細胞后，再加 80uL MTT反應液，37C水浴中培 養(yǎng)3小時。4.15002000rpm離心5min,棄上清，收集細胞；再用 800uL DMS（溶解細胞， 按每孔200uL的量轉(zhuǎn)移至96孔酶標板內(nèi)，室溫放置10分鐘，并不時搖動， I X 1 CX i z ./'以溶解細胞。j-

20、J 5. 無細胞組為調(diào)零孔。選擇 570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定 MTT反應 孔的光吸收值（OD570 ,6. 比較不同處理方法，細胞的存活情況。,-jI/四、實驗結果及分析2- -1、細胞培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)液顯為淡黃且清澈，無污染現(xiàn)象；細胞呈球狀，密集2、 細胞的超低溫凍存與復蘇后活性檢測：ODT2，3，4，10.0000.1060.1090.08720.0880.0890.06630.1010.1070.08540.0980.1120.07850.0840.0660.07360.0710.0760.06870.0610.0640.06380.1060.1260.095T -1 ：調(diào)零孔

21、2 -1、2、3、4:腎細胞直接凍存3 -1、2、3、4:腎細胞加 10%DMSO存4 -1、2、3、4:腎細胞玻璃化凍存2 -5、6、7、8:脾細胞直接凍存3 -5、6、7、8:脾細胞加 10%DMSO存4 -5、6、7、8:脾細胞加玻璃化凍存就結果而言：加10%DMS凍存的細胞存活率最高，而理論上是玻璃化凍存的細胞存 活率最高。、 從液氮中取出時玻璃化凍存也結成冰晶，與理論不符，實驗存在問題。 zz 廠丿I I 'j我們小組將兩只小鼠的細胞混在一起，細胞數(shù)增多，損傷也增多。3、ELISA檢測:OD123456f7/89101112f10.000.160.120.040.020.20

22、0.130.060.0300834823420.000.150.120.040.020.190.130.050.0260647303830.010.160.140.050.030.180.120.070.0420265911940.000.160.130.040.010.190.120.040.0279107587850.040.120.080.020.020.180.090.040.0308762132060.160.120.080.020.020.150.090.030.0127772162770.180.130.090.020.010.160.090.040.0392575612780.

23、130.100.020.010.150.100.040.0450431 1 X 1 , *23271 1:調(diào)零孔1 '2、3、4、5 :陰性對照3'5、6、7、8:1:80 0 04'1、24:1:11 '6、7 :陽性對照6 0 0 02，-一 1、2、13、4:1:10 0 02 00 02-5、6、7、8:1:2 0 0 04 00 03，-一 1、2、3、4:1:4 0 0 02 8 0 0 04'5、65'1、25'5、67 >8:1:34:1:67、8:1:18'9'10 11 于2'3'

24、4'5 '相同加入底物溶液(TMB后，陽性孔呈藍色，陰性孔無色；加入終止液后，陽性孔呈黃色，陰性孔無色。結果(0D ):陰性對照：0 .016251:1000:0.13475 (0.19625)1:2000:0.1305 (0.1625)1:4000:0.13175 (0.12775)1:8000:0.09525 (0.09575)1:16000:0.04575 (0.0585)1:32000:0.026 (0.0395)1:64000:0.02575 (0.04775)1:128000:0.018 (0.03275)i ' I X 1 i'1:1 0 0 0

25、/ 陰性對照：8.292 (12.077)j-J 1:2 0 0 0 / 陰性對照：8.031 (10.000)1:4 0 0 0 / 陰性對照：1 0.54 (7.862) i ；1:8 0 0 0 / 陰性對照：5.862 (5.892),-jI'1:1 6 0 0 0 / 陰性對照：2.815 (3.600)1:3 2 0 0 0 / 陰性對照：1.6(2.431)1:6 4 0 0 0 / 陰性對照：1.585 (2.938)1:1 2 8 0 0 0 / 陰性對照：1 .108(2.015)就結果而言：以2'3'4'5 '為準：1 :1 6 0

26、 0 0 /陰性對照>2.1，為陽性1:3 2 0 0 0 /陰性對照<2.1，為陰性則效價為1:16000以 8'9'10 11 為準：1:64 0 0 0 / 陰性對照>2.1,為陽性1:1 2 8 0 0 0 /陰性對照2.1，為陰性 則效價為1:64000實驗時加液可能存在的誤差或不準確，使液面有高低，影響折光率， 使實驗數(shù)據(jù)不準確；實驗時手碰到了酶標板底部，留有指紋等，影響折光率，使實驗數(shù)據(jù) 不準確；測OD直時酶標板底部有水，影響折光率，使實驗數(shù)據(jù)不準確五、實驗要點及討論1、酶聯(lián)反應常見問題：1、顯色步驟結束后，所有孔均無色，陽性對照不顯色原因：錯加

27、、漏加試劑底物、顯色劑；洗板及加樣過程中，酶標受污染失活，失去催化顯色劑顯色的能力；終止液誤做洗滌液或底物溶液配制；蒸餾水有問題2 、所有孔均較淡原因：加入試劑的體積和時間有誤，或移液器槍頭不潔；洗板及加樣過程中，酶標受污染失活，失去催化顯色劑顯色的能力；培養(yǎng)時間及溫度為達到要求；洗板次數(shù)過多，或洗滌液不符合要求，洗滌沖擊力太大，浸泡時間過久； 底物作用時間不夠3、陰陽性對照正常，待測品未檢出原因：樣品高溫放置過久，或反復凍溶致待測物濃度下降4、出現(xiàn)隨機性的花板、跳板現(xiàn)象原因：樣品離心不完全，反應孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分；加樣時交叉污染；手工洗板時造成交叉污染；5、假陽性原因：洗滌不充分，樣

28、品中有其他成分殘留；血清標本處理不當；加酶量過多；培養(yǎng)溫度超37度，或酶結合物反應時間或底物顯色超時； 底物或樣品污染 -. I ;2、細胞超低溫凍存于復蘇的要點 I 1 CX i'1 ; vr,r1.冷凍速度廠一一_冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關。冷凍速度、細胞收縮引 起細胞膜和細胞器的變化是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向"Oc i細胞外流動的情況也會不同。如果冷凍速度過慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，,-jI'體積縮小，同時細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不發(fā)生結冰；冷凍速度過快，細胞內(nèi) 水分沒有足夠時間外滲，隨著溫度的下降，細胞內(nèi)會發(fā)生結冰；如果冷凍速度非常 快，細胞內(nèi)形成的冰晶反而非常小或不結冰而呈玻璃狀凝固 （玻璃化冷凍）。不同細胞的最適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相匹 配；同時還取決于細胞的表面積與體積之比，以及細胞膜的滲透率。一般來說。小 細胞（如紅細胞等）對水通透性強，適用于快凍，最佳冷凍速率較高，可達103°C/min 或更高；相反大的細