細胞培養(yǎng)常用設(shè)備及試驗技巧

1、細胞培養(yǎng)常用設(shè)備及實驗技巧 常用設(shè)備準備室的設(shè)備： 單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜 （放置未消毒物品）、儲品規(guī)（放置消毒過的物品）、包裝臺。 配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、 磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物） 、日光燈和紫外燈、 空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。 必須放在無菌間的設(shè)備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置 顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4 C 冰箱（放置 serum 和培養(yǎng)用液）。無菌操作

2、無菌室的滅菌：1. 定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超 凈工作臺等，然后用3 %。來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5 %過氧乙酸 擦拭。2. CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用75 % 酒精擦拭或者 0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射3. 實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各 20-30分鐘4. 實驗后滅菌：用75%酒精（3%。新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、 倒置顯微鏡的載物臺。實驗人員的無菌準備：1. 肥皂洗手。2. 穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3. 用 75%酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：1. 凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS

3、、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子 均要用 75%酒精擦拭瓶子的外表面2. 靠近酒精燈火焰操作。3. 器皿使用前必須過火滅菌4 .繼續(xù)使用的器皿 （如瓶蓋、 滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5. 各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不 能碰到廢液缸。6. 吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1. 自來水刷洗，除去灰塵。2. 烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 %稀鹽酸中 12 小時以除去臟物、鉛、砷等物。3. 刷洗、烘干： 12 小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗， 自來水沖干凈后用烤箱烘干。4.泡酸、

4、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀 120g ：濃硫酸 200ml ：蒸餾 水 1000ml ）浸泡 12 小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗 15 次，最后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。 5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。 6. 高壓消毒： 包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安 全閥，當蒸氣成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當指針指向 15 磅時， 維持 20-30 分鐘。7. 高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑 溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然 后烘干。2.泡酸、清洗

5、：烘干后泡入清潔液（酸液）， 12 小時后從酸缸內(nèi) 撈出器皿立即用自來水沖洗 （避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以 清洗），再用蒸餾水沖洗 3 次。 3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包 裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。3-54. 高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和 安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出 分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升， 當指針指向 15 磅時， 調(diào)節(jié)電開關(guān)維持 20-30 分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕 輕蓋上）5. 烘干備用： 因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱 內(nèi)烘干備用。

6、金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸， 洗消時可先用洗滌劑刷洗， 后用自來水沖干凈， 然后用 75 酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干 或空氣中晾干。 放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi) 15 磅高壓（30 分 鐘）消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是： 先用洗滌劑洗刷干凈， 再分別用自來 水和蒸餾水沖干凈， 再用烤箱烘干， 然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的 處理程序：1 . 針式濾器帽不能泡酸液 ,用 NaOH 泡 6-12 小時 ,或者煮沸 20 分鐘 ,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上 （凹向 上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi) 15 磅 30

7、 分鐘消毒，再烘干備用。 注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應該立即將螺 旋旋緊。2. 膠塞烘干后用 2 氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理 30 分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁 盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在 2 氫氧化鈉溶液中浸泡 6-12 小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸 液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入 鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。4. 膠頭可用 75酒精浸泡 5 分鐘，然后紫外照射后使用即可。5. 塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管

8、：6. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可 用 70 酒精浸泡消毒。 塑料培養(yǎng)皿打開蓋子， 放在超凈臺臺面上， 直接暴露在紫外線下消毒。 也可用氧化乙烯消毒塑料制品， 消毒后 需要用 23 周時間洗除殘留的氧化乙烯。用 20000 100000rad 的 r 射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆， 可在紙包裝后， 用密 寫墨水作好標記。 其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水， 在包裝紙 上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從 而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆（CoCi2?6H2O）2g , 30 %鹽酸 10m1，

9、蒸餾水 88m1。注意事項：1. 嚴格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時燒干， 水不能過多因為其將使空氣流暢受阻， 會 降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。2. 安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上， 否則起不到過濾的作用。3. 注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防 止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面， 會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡 酸不徹底。細胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 . 純凈水系統(tǒng)、電子 天平、P

10、H計、磁力攪拌器。具體步驟：一. 水的制備：細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈， 不含有離子和其他的雜質(zhì)。 需要用新 鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二. PBS的制備與消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制 ）：1. 溶解定容：將藥品（ NaCl 8.0g， KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO40.2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動， 充分溶解， 然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至 1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。2. 移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi) 8 磅消毒 20

11、分鐘。注意高壓 消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。三. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒： 胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。 不同的 組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。 胰酶分散細胞的活性還與 其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在 pH為8.0、溫度為37C時，胰 酶溶液的作用能力最強。 使用胰酶時，應把握好濃度、 溫度和時間， 以免消化過度造成細胞損傷。因 Ca2+、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克 降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或 者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。1. 稱取胰蛋白

12、酶： 按胰蛋白酶液濃度為 0.25，用電子天平準確稱 取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水 （若用雙蒸水需要調(diào) PH 到7.2 左右） 或PBS （D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于4 C內(nèi)過夜。2. 用注射濾器抽濾消毒： 配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以 備使用。四. 青、鏈霉素溶液的配制于消毒1. 所用純凈水（雙蒸水）需要 15 磅高壓 20 分鐘滅菌。2. 具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是 80 萬單位/瓶，用注射器 加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20 萬單位3. 使用時溶

13、入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1 單位=1微克？五. RPMI 1 640 的制備與消毒：1. 溶解、調(diào) PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積 2/3 的 雙蒸水中 ,并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3 次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基 中）,充分攪拌至粉劑全部溶解 ,并按照包裝說明添加一定的藥品 .然 后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml, 使青 鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和 NaOH 調(diào) PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，搖勻。2. 安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將 不銹鋼濾器和支

14、架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消 毒。3. 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。4. 分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于 4 C冰箱內(nèi)待用。5. 使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C時兩周 有效）。六血清的滅火：細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56 C水浴中滅火30 分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。七. HEPES溶液：HEPES 的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸 (N '-a-hydroxythylpiperazine-N ' -ethanesulfanic acid )。 對細胞無毒性作

15、用。 它是一種氫離子緩沖劑， 能較長時間控制恒定 的 pH 范圍。使用終濃度為 10-50mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES 即可達到緩沖能力。1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌， 分裝后4 C保存。注意：因為現(xiàn)在市售 HEPES 為約 10g 包裝的小瓶， 所以可根據(jù)實 際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi) HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中， 過濾除菌后可完全(20ml)加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng) 液中

16、加入 2ml 即可。八. 谷氨酰胺： 合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺， 其作用非常重要， 細胞需 要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)， 谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良 甚至死亡。 在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。 由 于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4C下放置1周可分解50%,故應 單獨配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰 胺的培養(yǎng)液在4C冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨 酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷 氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成

17、200mmol/L 的溶液， 充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20 C保存，使用時可向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。九. 肝素溶液的配制： 含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高， 肝素加入全培養(yǎng)液中 最終濃度為 50ug/ml 。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56 克/瓶，配制時，可將其溶于 100ml 三蒸水中，定容，過夜， 然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為？ C 。使用時，向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml）即可。十.I型膠原酶：0.1 % I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因 為I型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不

18、容易過濾，因此可以用蔡式濾 器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20 C保存。十一.明膠溶液：因為明膠難于過濾，所以配制 0.1 %明膠溶液必須用無菌的 PBS 配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。 首要的問題是如何無 菌準確稱量 0.1 克（配成 100ml 溶液） 即解決無菌分裝藥品的 問題。其次要注意即使是 01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖 勻，過夜放置，然后無菌分裝入 50ml小瓶中，4C保存。 其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml 內(nèi)皮生長因子，注意事項：1. 配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。2. 安裝蔡式濾器時通常使用孔徑 0.45 微米 和 0.22 微米濾膜各一 張，放置位置

19、為 0.45 的位于 0.22 微米的濾膜上方， 并且要特別注 意濾膜光面朝上。3. 配制 RPMI1640 培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清， 而小牛血清略 偏酸性，為了保證培養(yǎng)液 PH 值最終為 7.2 ，可在配制時調(diào) PH 至 7.4。細胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一. 傳代前準備：1. 預熱培養(yǎng)用液： 把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、 PBS 液和胰蛋白酶 的瓶子放入37 C水浴鍋內(nèi)預熱。2. 用 75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3. 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且 可減少污染。4. 點燃酒精燈：注意火焰不能太小。5. 準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，

20、放入微波爐內(nèi)高火， 8 分 鐘再次消毒。6. 取出預熱好的培養(yǎng)用液： 取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉 球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。7. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋， 用酒精棉球 擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。8. 打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。二. 胰蛋白酶消化；1. 加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗（沖洗），加入 適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最 佳消化溫度是37 Co2. 顯微鏡下觀察細胞： 倒置顯微鏡下觀察消化細胞， 若胞質(zhì)回縮， 細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。3. 吸棄消化液加入培

21、養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入 新鮮的培養(yǎng)液。三. 吹打分散細胞：1. 吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。2. 吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入 10ml 離心管中。3. 平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以 1000 轉(zhuǎn)/分鐘 離心 6-8 分鐘。4. 棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入 2ml 培養(yǎng)液，用滴 管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。四. 分裝稀釋細胞：1. 分裝：將細胞懸液吸出分裝至 2-3 個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基 旋緊瓶蓋。2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5

22、 x 105/ml。最后要做好標記。五. 繼續(xù)培養(yǎng)： 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù) 培養(yǎng)。傳代細胞 2 小時后開始貼附在瓶壁上。 當生長細胞鋪展面積 占培養(yǎng)瓶底面積 25 時為一個，占 50為，占75 時為 。傳代細胞培養(yǎng)注意事項：1. 嚴格的無菌操作2. 適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶 中的量等諸多因素的影響， 消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變 化，一旦胞質(zhì)回縮， 連接變松散， 或有成片浮起的跡象就要立即終 止消化。附：EDTA （0.02 %乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.

23、20g ， KH 2PO 4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5 %酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min 高壓滅菌，使用時調(diào)節(jié) PH 值到 7.4。注意 EDTA 不能被血 清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時細胞容易脫壁細胞的復蘇細胞復蘇的原則-快速融化：必須將凍存在-196 C液氮中的細胞快速融化至37 C，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。具體操作一. 實驗前準備：1. 將水浴鍋預熱至37 C2. 用75酒精擦拭紫外線照射 30min 的超凈工作臺臺面。3 .在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸

24、管、 培養(yǎng)瓶等 等。二取出凍存管：1. 根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。2. 從液氮罐中取出細胞盒， 取出所需的細胞， 同時核對管外的編號。 三迅速解凍：1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。2. 約 1-2min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存 管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。四. 平衡離心： 用架盤天平平衡后，放入離心機中 3000r/min 離心 3min五. 制備細胞懸液：1. 吸棄上清液。2. 向離心管內(nèi)加入 10ml 培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。六. 細胞計數(shù)：細胞濃度以5 x 105/ml為宜。七. 培養(yǎng)細胞

25、將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37 C和5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼 續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。初學者易犯錯誤：1水浴鍋未預熱或者未預熱到37 C。2. 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。3. 離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。4. 一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。細胞計數(shù)實驗原理： 當待測細胞懸液中細胞均勻分布時， 通過測定一定體積 懸液中的細胞的數(shù)目， 即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù) 目。具體操作：一.準備工作： 取一瓶傳代的細胞，按照傳代細胞培養(yǎng)（消化法）中的傳

26、代方 法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。.細胞懸液制備： 細胞懸液的制備方法是用 0.25 的胰蛋白酶液消化、 PBS 液洗滌 后，加入培養(yǎng)液（或 Hanks 液或 PBS 等平衡鹽溶液），吹打制成 待測細胞懸液。三. 細胞計數(shù)：1. 蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板， 將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù) 槽上。2. 制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸 5 滴細胞懸液到一離心管中， 加入 5 滴臺盼藍染液（ 0.4 ）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加 入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。3. 將細胞懸液滴入計數(shù)板： 將待測細胞懸液吹均勻， 然后吸取少量 懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入， 要保證蓋片下充滿懸液， 注意蓋片下不 要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。4. 統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)： 將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀 察，并移動計數(shù)板， 當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后， 數(shù)出四角的四個 大鉻（每個大格含有 16 個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。5. 計算原細胞懸液的細胞數(shù) :按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml =（四個大格子細胞數(shù)/4） x 2X 104 說明