貼壁細(xì)胞培養(yǎng)

1、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)一、 克隆形成抑制試驗(yàn)原理 ：克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一， 其基本原理是單 個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖 6 代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體， 成為克?。洌?， 這時(shí)的每個(gè)克隆可含50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0 mm之間。通過(guò)克隆形成 實(shí)驗(yàn)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做出作定量分析， 了解細(xì)胞的增殖力和對(duì)生存環(huán) 境的適應(yīng)性。 這種方法常用于抗癌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、 腫瘤放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等。 常 見(jiàn)的有平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。本法適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞， 包括培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。材料與方法（一）用品：含 15%新生牛血清的 RPMI- 1 640培養(yǎng)液

2、、含 10%新生牛血清的 RPMI-1640、 培養(yǎng)液PBS 0.25%胰酶、細(xì)胞染色液（劉氏染液）、相機(jī)、12孔板、EP 管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江蘇南通精華制藥有限公司），用無(wú)菌生理鹽水配制成100卩g/ mL溶液，使用前稀釋至所需 濃度。（二）操作： .制備細(xì)胞懸液：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌 SW620細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并吹打 成單個(gè)細(xì)胞，含10%!清的RPMI-1640培養(yǎng)液倍比稀釋到所需的體積，使細(xì)胞密 度為3X 102個(gè)/mL,接種于12孔板，1000卩L/孔。PBS過(guò)一遍，力卩1ml消化液，棄消化液，10%培養(yǎng)液2ml沖洗細(xì)胞，再用槍吸

3、出 0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培養(yǎng)液，混合（搖15次，吹15次），取1001到 EP管混合，取101細(xì)胞計(jì)數(shù)倍比稀釋（吸出1ml，加2ml培養(yǎng)液。Mix。）吸出1ml，棄剩余液體，將1ml液體倒回小瓶，加2ml培養(yǎng)液。重復(fù)。直到需要的細(xì)胞數(shù)。12600個(gè)細(xì)胞/3ml，或8400個(gè)細(xì)胞/2ml。種板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml細(xì)胞，不用搖。 .待細(xì)胞貼壁后加入藥物，終體積為2000卩L,設(shè)6組0, 0.33，0.66,1.33 ，2.66，3.99 4.66 卩g/ml藥物組，每組2復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后置37C, 5%CO,飽和濕度條件培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 7 天。計(jì)數(shù)：滿體積 2000ul

4、 其中 藥物濃度 100ug/ml 100ul NS: 0 100 N=20.33 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =6.6ul + NS 93.4ul N=20.66 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =13.2ul + NS 86.8 ul N=21.33 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =26.6ul + NS 73.4ul N=22.66 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * XX =53.2ul+NS 46.8ulN=23.99卩 g/ml *2000ul =100ug/ml *

5、XX =79.8 ul+NS 20.2ulN=14.66卩 g/ml *2000ul=100ug/ml * XX =93.2 ul+ NS6.8 ulN=1eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix在EP管中。等待加藥。N=2.吸去培養(yǎng)液，加入PBS洗滌后，染色,干燥:劉氏染色法加 Liu A Solution 0.5 ml 染色 30 s。滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,輕吹使其充分混合，染色1 min。水洗, 干燥、拍照二、細(xì)胞傳代原理 :培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后，需分離再培養(yǎng)，否則細(xì)胞因生存空間不夠，細(xì) 胞密度過(guò)大， 致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足而引起細(xì)胞衰老、

6、停止生長(zhǎng)甚至死亡。 為了維持細(xì)胞的 存活和生長(zhǎng)，必須進(jìn)行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。材料與方法（一）用品:含10%生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液PBS 0.25%胰酶、EP管，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。（二）操作: 制備細(xì)胞懸液：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌 SW620細(xì)胞，PBS過(guò)一遍，力卩1ml0.25% 胰酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，棄消化液，10%培養(yǎng)液2ml沖洗細(xì)胞，再用槍吸出 0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培養(yǎng)液，混合（搖15次，吹15次），取1001到 EP管混合，取101細(xì)胞計(jì)數(shù)用。 細(xì)胞傳代： 在之前制備的細(xì)胞懸液 2.5ml 中，用滴管吸取 1/3

7、滴管至細(xì)胞培養(yǎng) 瓶，后用滴管吸取3滴管含10%生牛血清的RPMI-1640至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，關(guān)緊瓶 蓋用酒精棉球搽拭后，放入37C 5%CO培養(yǎng)箱中孵育。三、MTTt匕色法原理：MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。實(shí)驗(yàn)所用的顯色劑是一種 能接受氫原子的染料?；瘜W(xué)名 3- （4，5-二甲基噻唑 -2 ）-2,5- 二苯基四氮唑溴 鹽。商品名噻唑藍(lán)，MTT活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的蘭紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中。而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜 DMSOh溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量，在一定的范圍內(nèi)，MT

8、T結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。與其他檢測(cè)方法如細(xì)胞計(jì)數(shù)法，3H摻入法，LDH法有良好的相關(guān)性。 材料與方法（一）用品：1 MTT液：稱取250mgMTT放入小燒杯內(nèi)，加 50ml PBS （0.01M，pH7.4 ）在電 磁力攪拌儀上攪拌30min。用0.22 um的微孔濾器除菌，分裝 4度保存，2 周內(nèi)有效。2. 10%新生牛血清的RPMI-1640, 0.25%胰酶，DMS（分析純）3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江蘇南通精華制藥有限公司），用無(wú)菌生理鹽水配制成100卩g/ mL溶液，使用前稀釋至所需濃度。（二）步驟1. 接種細(xì)胞，用0.25%的胰酶消

9、化細(xì)胞，1min,棄胰酶。2. 用10%、牛血清的1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞，取1001到EP管中，吹打， 計(jì)數(shù)。3. 配 5000 個(gè)細(xì)胞/120ul。用 96 孔板，設(shè) 0, 2，4，8， 16，24 卩 g/ml組每空加入120卩l(xiāng)細(xì)胞。培養(yǎng)。4. 第二天，加入藥物40卩l(xiāng)。5. 培養(yǎng)48h。每孔加入MTT（5mg/ml） 20卩l(xiāng)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸棄孔內(nèi)的上清液。6. 每孔加入150卩l(xiāng)的DMSO震蕩10min, 570nm測(cè)吸光值。滿體積160ul 其中藥物40卩l(xiāng)藥物濃度100ug/ml（對(duì)照組加40卩INS）2 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =3.

10、2 ul+ NS36.8 ul4 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =6.4ul+ NS33.6 ul8 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =12.8ul+ NS27.2 ul16 卩 g/ml *160ul= 100ug/ml * XX =25.6 ul+NS 14.4 ul24 卩 g/ml *160ul= 100ug/ml * XX =38.4 ul+ NS1.6 ul5-FU 3.2 * 4 + NS 36.8 * 4 mix在 EP管中。等待加藥。CCK-8法步驟1. 接種細(xì)胞， 用 0.25%的胰酶消化細(xì)胞， 1min, 棄胰酶。2. 用10%小牛血清的1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞，取100卩1到EP管中，吹