資料-多糖含量測定的各種方法優(yōu)缺點

1、苯酚-硫酸法測多糖含量、原理多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。二、試劑1、濃硫酸：分析純，95.5%2、 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加 20克水使之溶解，可置冰箱中避光長 期儲存。3、6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測定均需現(xiàn)配）4、標準葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia或分析純葡萄糖。5、15%三氯乙酸（15%TCA）： 15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。6、5%三氯乙酸（5%TCA）: 25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。7、6mol/L氫氧化鈉：12

2、0克分析純氫氧化鈉溶于500ml水。8、6mol/L 鹽酸三、操作1、制作標準曲線準確稱取標準葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取 0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸餾水補至 2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃 硫酸5.0ml，搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操 作為空白，橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為光密度值，得標準曲線。2、樣品含量測定1）取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5%TCA溶液研磨，倒上清 液于10毫升離心管中，再加少許5% TCA溶

3、液研磨，倒上清液，重復(fù)3次。最后一次將殘渣 一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。2） 離心，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。后兩次各 5分鐘取 上清液到25毫升錐形比色管中。最后濾液保持 18毫升左右。3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L鹽酸之后搖勻，在96C水浴鍋中水浴2小時。4） 定容取樣。水浴后，用流水冷卻后加入 2毫升6mol/L氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升 的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml, 搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度。

4、每次測定取雙樣對照。以標準曲線計算多糖含量。四、注意1、此法簡單、快速、靈敏、重復(fù)性好，對每種糖僅制作一條標準曲線，顏色持久。2、 制作標準線宜用相應(yīng)的標準多糖，如用葡萄糖，應(yīng)以校正系數(shù)0.9校正yg數(shù)。3、對雜多糖，分析結(jié)果可根據(jù)各單糖的組成比及主要組分單糖的標準曲線的校正系數(shù)加 以校正計算。4、 測定時根據(jù)光密度值確定取樣的量。光密度值最好在 0.10.3之間。比如：小于0.1 之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大于0.3可以減半取0.1ml的樣品液測 定，即可無礙。蒽酮-硫酸比色法測定多糖含量一、實驗原理糖類在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫水生成糠醛或羥甲基糖醛后，與蒽酮

5、（C14H10O）脫水縮合，形成糠醛的衍生物呈藍綠色。該物質(zhì)在 620nm處有最大吸收，在150pg/mL范圍 內(nèi)，其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。 該法有很高的靈敏度，糖含量在30 pg左右就能進 行測定。二、試劑器材1、蒽酮試劑：精密稱取0.1g蒽酮，加80%濃H2S04100mL使溶解，搖勻。當(dāng)日配制使 用；2、 葡萄糖標準液：將無水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密稱取100mg，用 蒸餾水定容至100ml;3、 其他器材：分析天平、分光光度計、容量瓶（100ml、50ml、10ml）、燒杯、具塞試 管、移液器、移液器吸頭、渦旋振蕩器和廢液缸等。三、操作步驟1、葡萄糖標準曲

6、線的制作取7支具塞試管，按下表數(shù)據(jù)精密配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液，每個濃度做23個重復(fù)：管號0123456標準葡萄糖溶液 /mL00.20.40.60.81.01.22蒸餾水 /mL2.01.81.61.41.21.00.8在每支試管中立即加入蒽酮試劑6mL,振蕩混勻，各管加完后一起置于沸水浴中加熱15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻 15mi n。在625nm波長下以第1管為空白，迅速測定其余各管吸光值。以標準葡萄糖含量（g.）為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。2、樣品的測定將樣品溶液糖濃度調(diào)整到測定范圍，精確吸取2mL置于干燥潔凈試管中，在每支試管中立即加入蒽酮試劑6mL，振

7、蕩混勻，各管加完后一起置于沸水浴中加熱15mi n。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15min，每個濃度做23個重復(fù)。在625nm波長下迅速測定各管吸光值。根據(jù)葡萄糖含量的標準曲線，由樣品溶液吸光值 計算各樣品溶液中糖的濃度，并計算其糖含量。四、注意事項該法的特點是幾乎可測定所有的碳水化合物，不但可測定戊糖與已糖，且可測所有寡糖 類和多糖類，包括淀粉、纖維素等（因為反應(yīng)液中的濃硫酸可把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)） 所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多 麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值，但在測定

8、水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未 溶解殘渣加入反應(yīng)液中，否則會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而 增加了測定誤差。不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖 較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定 單一糖類時則可避免此種誤差。多糖含量的測定、原理分子量大于10,000道爾頓的多糖經(jīng)80%乙醇沉淀后，加入堿性銅試劑，選擇性地從其他 高分子物質(zhì)中沉淀出葡聚糖，沉淀部分與苯酚-H2SO4反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，在485nm條件下, 有色物質(zhì)的吸光度值與葡聚糖濃度成正比。適用范圍4參照AOAC方法。適用

9、于檢測含有分子量大于 10,000道爾頓葡聚糖的樣品三、儀器1、分光光度計2、離心機3、旋轉(zhuǎn)混勻器4、恒溫水浴鍋四、試劑除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。1、80%乙醇： 800ml 無水乙醇加水 200ml。2、2.5mol/L NaOH溶液：lOOgNaOH加蒸餾水稀釋至1L，加入固體無水硫酸鈉至飽和。3、 銅貯存液：稱取3.0g CuSO4 5出0, 30.0g檸檬酸鈉加水溶解至1L。溶液可貯存2 周。4、 銅應(yīng)用溶液：取銅貯存液50ml，加水50ml混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g,臨用新配。5、洗滌液：取水50ml，加入10ml銅應(yīng)用溶液，10ml 2.5mol/L Na

10、OH溶液，混勻。6、1.8mol/L H2SO4 :取100ml濃硫酸用水稀釋至1L。7、20g/L苯酚溶液：稱取2.0g苯酚，加水溶解并稀釋至100ml，混勻備用。8、 葡聚糖標準液：稱取 500mg葡聚糖（分子量500,000D）于稱量皿中，105C干燥4h 至恒重，置于裝有干燥硅膠的干燥器中冷卻。準確稱取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至 100ml，葡聚糖標準濃度為1.0mg/ml。9、 葡聚糖標準應(yīng)用液：吸取葡聚糖標準液10ml，用水稀釋10倍，葡聚糖終濃度為 0.1mg/ml。五、操作方法1 、樣品處理1）樣品提?。悍Q取樣品15g，加水100ml，沸水浴加熱2h，冷卻至室溫，定容

11、至200ml （ V1 ），混勻后過濾，棄初濾液，收集余下濾液。2） 沉淀高分子物質(zhì)：準確吸取上述濾液 100ml （V2），置于燒杯中，加熱濃縮至10ml， 冷卻后，加入無水乙醇40ml，將溶液轉(zhuǎn)至離心管中以 3000rpm離心5min，棄上清液，殘渣 用 80%乙醇洗滌 3次，殘渣供沉淀葡聚糖之用。3） 沉淀葡聚糖：上述殘渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混勻后過濾，棄初始濾液后， 取濾液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu應(yīng)用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim， 冷卻后以3000rpm離心5min，棄上清液，殘渣用洗滌液洗滌3次，殘渣供測定葡聚糖

12、之用。4）測定葡聚糖：上述殘渣用 2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL （V5）。準 確吸取2.0ml （V6）,置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml濃硫酸，沸水浴煮沸 2 分鐘，冷卻比色。從標準曲線上查得相應(yīng)含量，計算粗多糖含量。2、標準曲線制備精密吸取葡聚糖標準應(yīng)用液 0.10, 0.20, 0.40, 0.60，0.80, 1.00, 1.50, 2.00ml （分別相 當(dāng)于葡聚糖 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.15, 0.20mg）,補充水至 2.0mL,加入苯 酚溶液1.0ml，濃硫酸10m

13、l，混勻，沸水浴2分鐘，混勻，沸水浴2分鐘，冷卻后用分光光 度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，測定吸光度值（A）,以葡聚糖濃度為橫坐標， A 為縱坐標繪制標準曲線。六、計算從標準曲線上查得樣品相應(yīng)含量，計算粗多糖含量。葡聚糖（%） =cx V5 X V3 X V1 X 0.1/V6 X V4 X V2 X m=cX 250/m公式中： c-從標準曲線上查得樣品測定管中葡聚糖含量,mg；V1-樣品提取時定容體積, ml；V2-沉淀高分子物質(zhì)取液量, ml；V3-沉淀葡聚糖時定容量, ml；V4-沉淀葡聚糖時取液量, ml；V5-測定葡聚糖時定容體積, ml；V6-樣品比色管中取樣液體積

14、, ml；m-樣品稱量質(zhì)量, g；0.1-將mg/g換算成g/100g的系數(shù)。七、注意事項1、苯酚-H2SO4溶液可以和多種糖類進行顯色反應(yīng)，常用于總糖的測定。所以測定過程 中應(yīng)注意容器及試劑中其他糖類的干擾。2、苯酚-H2SO4溶液和不同類的糖反應(yīng)，顯色的強度略有不同，反映在標準曲線的斜率 不同。如果已知樣品中糖的結(jié)構(gòu),應(yīng)盡量以同類糖的純品做標準品,或以含有已知濃度的同 類產(chǎn)品做對照品進行檢測分析；如果樣品中糖的類型未知或結(jié)構(gòu)多樣,則只能以葡萄糖計或 其他糖計報告結(jié)果。3、 試驗證明葡萄糖、果糖等單糖,蔗糖、乳糖等雙糖、低聚糖-棉子糖,淀粉、糊精等 多糖及甜味劑糖精不干擾粗多糖測定。4、本方

15、法由北京市衛(wèi)生防疫站建立， 經(jīng)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所驗證黑木耳多糖的提取、分離、純化及初步測定一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)真菌多糖的提取方法2、掌握測定多糖組成、總糖含量的基本方法3、掌握柱層析技術(shù)二、實驗原理通過水提法浸提出木耳中的多糖，經(jīng)過有機溶劑脫脂，Sevage脫蛋白，透析除去無機鹽等小分子雜質(zhì)，經(jīng)干燥得粗多糖。粗多糖經(jīng)酸水解后通過紙層析或薄層層析測出多糖的單糖 組成。經(jīng)酚硫酸法測得總糖含量。獲得粗多糖經(jīng) G-100 純化，獲得較純多糖樣品，為進一步 研究奠定基礎(chǔ)。三、設(shè)備及試劑1、設(shè)備： 721型分光光度計、回流裝置、臺式離心機、電熱恒溫水浴鍋、真空干燥箱、 恒溫磁力攪拌器、

16、柱層析系統(tǒng)、層析缸、布氏漏斗2、材料：黑木耳，使用前烘干、粉碎，過 80 目篩，得木耳粉3、試劑：苯酚、硫酸、無水乙醇、 丙酮、乙醚、乙酸、正丁醇、鄰苯二甲酸、 CPC、P2O5、NaSO4、NaCL、NaOH、BaCO3、石油醚、氯仿、粉末狀活性炭、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖 甘露糖、半乳糖、葡萄糖四、步驟1、提取1）取50g粉末，用石油醚回流脫脂2h，反復(fù)兩次，抽濾，取殘渣。2） 殘渣經(jīng)80%乙醇除去低聚糖后，熱水浴浸提 4h，重復(fù)一次，六層紗布粗濾，抽濾， 取濾液。3）向濾液中加入1%粉末活性炭，磁力攪拌器攪拌15mi n，抽濾除凈活性炭。4）濃縮至80ml左右，加入糖液總體積的1/4 Se

17、vage試劑（正丁醇：氯仿=1:4），充分攪拌 2h，靜置，離心，取上清液重復(fù)，至無游離蛋白為止。5）將清液裝入透析袋，流水透析過夜。6）將袋內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至 250ml 燒杯中，加入三倍體積 95%乙醇沉淀多糖，靜置 30min。7）4000rpm 離心 10min。8）棄上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、氯仿洗滌。9）將沉淀置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮凈有機溶劑。10）60C真空干燥過夜，得粗多糖干品。2、G-100 柱純化3、酚硫酸法測總糖含量1）稱量提取出來的多糖粗品100mg，定容于1000ml容量瓶。2）6g 苯酚蒸餾水定容于 100ml 容量瓶中，得 6%苯酚。3）分別取 1 中母液 0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、 0.9ml 分別加蒸餾水定容到 50ml。4）分別從 3中每管精確取 2.0ml 溶液，置于有塞試管中，分別加 1ml 6%苯酚溶液，再 加入5.0ml