華理微生物實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的使用一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、基本原理、維護(hù)和保養(yǎng)方法；2. 掌握普通光學(xué)顯微鏡的正確使用方法。二實(shí)驗(yàn)原理1. 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)組成。 圖. 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖1. 目鏡；2. 鏡筒；3. 物鏡轉(zhuǎn)換器；4. 物鏡；5. 鏡臺(tái)；6. 聚光器；7. 可變光闌；8. 反光鏡；9. 鏡座；10. 粗調(diào)節(jié)螺旋；11. 細(xì)調(diào)節(jié)螺旋； 12. 鏡臂。（1）機(jī)械裝置（圖）鏡座上顯微鏡的基座，起穩(wěn)定和支持整個(gè)機(jī)身的作用，使顯微鏡能平穩(wěn)放置在平面上，有的顯微鏡在鏡座內(nèi)裝有照明光源等。鏡柱是連接鏡座和鏡臂的短柱。鏡臂用以支持鏡筒，

2、也是移動(dòng)顯微鏡時(shí)用手握住的部分。直筒顯微鏡的鏡座和鏡臂之間有一傾斜關(guān)節(jié)，可以使鏡臂傾斜一定的角度，便于觀察。但傾斜度一般不超過(guò)45°，避免顯微鏡失去重心而翻倒。鏡筒傾斜式顯微鏡無(wú)此關(guān)節(jié)。鏡筒是連接目鏡與物鏡的金屬筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光學(xué)顯微鏡可以分為單筒式和雙筒式兩類(lèi)。單筒式又分為直筒式和傾斜式兩種；雙筒式均為傾斜式。鏡臺(tái)又被稱(chēng)為載物臺(tái)，在鏡筒下方，是放置標(biāo)本的地方，為方形或圓形。鏡臺(tái)中央有一圓形通光孔，兩側(cè)各有一個(gè)用于固定被檢標(biāo)本片的壓片夾。有的顯微鏡則有標(biāo)本移動(dòng)器，移動(dòng)器上裝有彈簧夾，可固定標(biāo)本片。轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋可以使標(biāo)本片前后和左右移動(dòng)。有的標(biāo)

3、本移動(dòng)器上還帶有游標(biāo)尺，可指明標(biāo)本所在的位置。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有35個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡，使用時(shí)可通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器選用合適的物鏡。為使用方便，物鏡應(yīng)按從低倍到高倍的順序安裝。轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，必須用手按住圓盤(pán)旋轉(zhuǎn)，切勿用手指直接推動(dòng)物鏡，以免使物鏡和轉(zhuǎn)換器間的螺旋松脫而損壞顯微鏡。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂基部或鏡柱兩側(cè)的粗、細(xì)螺旋上，可調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本片之間的距離，以便清晰地觀察標(biāo)本。粗調(diào)螺旋旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒升降約10 mm，一般用于低倍鏡調(diào)焦；細(xì)調(diào)螺旋旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒升降約0.1 mm的距離，用于高倍鏡、油鏡或分辨物像清晰度的調(diào)焦。（2）光學(xué)部分物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，是顯微鏡中很重

4、要的光學(xué)部件，是由多塊透鏡組成的一個(gè)鏡頭組。根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，物鏡可以被分為低倍鏡、高倍鏡和油鏡三類(lèi)。低倍鏡的放大倍數(shù)常為4´、10´、20´；高倍鏡的放大倍數(shù)常為40´、45´；油鏡的放大倍數(shù)常為90´、95´、100´，油鏡鏡筒上刻有OI或HI或oil字樣，也有刻一圈紅線或黑線為標(biāo)記的，借以區(qū)別于其他物鏡。物鏡上標(biāo)出了物鏡的重要參數(shù)，包括放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑（NA）、物鏡鏡筒高度（單位是mm）及要求蓋玻片的厚度等?，F(xiàn)舉例說(shuō)明其含義如下（圖）： 圖. 顯微鏡物鏡上的重要參數(shù)及大致的工作距離目鏡呈短

5、圓筒狀，裝在顯微鏡上端。目鏡的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡由兩片透鏡組成，上面一塊為接目透鏡，下面一塊為聚透鏡，在兩塊透鏡之間或聚透鏡的下方有一視野光闌。在進(jìn)行顯微鏡測(cè)量時(shí)目鏡測(cè)微尺要放在視野光闌上。目鏡上刻有放大倍數(shù)，如5´、10´、15´、20´等，可以根據(jù)需要選擇合適的目鏡。聚光鏡又稱(chēng)聚光器，安裝在鏡臺(tái)下，由多塊透鏡組成，其作用是把平行的光線聚焦到標(biāo)本上，增強(qiáng)亮度。一般在鏡柱一側(cè)有一旋紐，可使聚光鏡升降。聚光鏡與物鏡配合使用，通常用低倍鏡時(shí)聚光鏡應(yīng)下降，而當(dāng)使用油鏡時(shí)聚光鏡應(yīng)升到最高位置。在聚光鏡的上方是虹彩光闌，俗稱(chēng)光圈。光圈由十幾張金屬

6、游片組成，通過(guò)調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，可以調(diào)節(jié)進(jìn)入物鏡的光線的強(qiáng)弱。在觀察較透明的標(biāo)本時(shí)，光圈宜小一些，這時(shí)分辨率雖然降低，但反差增強(qiáng)，從而使透明的標(biāo)本看得更清楚；但不宜將光圈關(guān)得太小，以免由于光干涉現(xiàn)象而導(dǎo)致成像模糊。當(dāng)使用油鏡時(shí)，把光圈完全打開(kāi)，增強(qiáng)射入光線的強(qiáng)度。在光圈下常裝有濾光片架，可以放置不同顏色的濾光片。在聚光鏡下方的鏡座上，安裝有反光鏡。反光鏡是一個(gè)有平、凹兩個(gè)面的雙面鏡，可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)，其作用是采集光線并將光線射向聚光鏡。凹面鏡還能起到聚光的作用。因此，未安裝聚光鏡的顯微鏡及光源較弱時(shí)可應(yīng)用凹面鏡，而在光源較強(qiáng)及用聚光鏡時(shí)一般可用平面鏡。有的顯微鏡安裝有電光源

7、，使用時(shí)不用通過(guò)反光鏡就可以進(jìn)行觀察。2. 普通光學(xué)顯微鏡的光學(xué)原理由單透鏡構(gòu)成的放大鏡和由幾塊透鏡組成的實(shí)體顯微鏡稱(chēng)單式顯微鏡?，F(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡是利用兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，故又被稱(chēng)為復(fù)式顯微鏡。其光學(xué)原理是：由外界入射的光線經(jīng)反光鏡反射向上，或由內(nèi)光源發(fā)射的光線經(jīng)聚光鏡向上匯聚在被檢標(biāo)本上，由標(biāo)本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進(jìn)入，使光軸與水平面傾斜45°角的棱鏡在目鏡的視場(chǎng)光闌處，成放大的側(cè)光實(shí)像，該實(shí)像再經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像。（1）顯微鏡的放大倍數(shù)被檢標(biāo)本經(jīng)顯微鏡的物鏡和目鏡放大后的總放大倍數(shù)是：標(biāo)本放大倍數(shù)物鏡的放大倍數(shù)´目鏡的放大倍數(shù)。如：用40´的

8、物鏡和10´的目鏡，總放大倍數(shù)是400´。（2）分辨率評(píng)價(jià)一臺(tái)顯微鏡的精密程度，不僅要看其放大倍數(shù)，更重要的是看其分辨率。分辨率是指顯微鏡能夠辨別發(fā)光的兩個(gè)點(diǎn)的最小距離的能力，該最小的距離被稱(chēng)為鑒別距離或分辨距離（R）。R的計(jì)算公式如下：R l（2NA）；其中，l代表入射光的波長(zhǎng)，NA代表物鏡的數(shù)值孔徑。 圖：物鏡的進(jìn)口角1. 物鏡；2. 進(jìn)口角；3. 標(biāo)本面。NA的計(jì)算公式如下：NA= n´ sinq。其中，n代表光線進(jìn)入物鏡前所在介質(zhì)的折射率，q代表進(jìn)口角a（圖）的半數(shù)。q的最大值不可能達(dá)到90°，故sinq<1。當(dāng)介質(zhì)為空氣時(shí)，n 1。所以干

9、燥系下物鏡的數(shù)值孔徑都小于1。使用油鏡時(shí)，物鏡與標(biāo)本片之間的介質(zhì)是香柏油（n= 1.515）或液體石蠟（n= 1.52），故而數(shù)值孔徑增大。因而油鏡的分辨率要優(yōu)于其他物鏡。（3）工作距離工作距離是指觀察標(biāo)本最清晰時(shí)，物鏡透鏡的下表面與標(biāo)本之間（無(wú)蓋玻片時(shí)）或與蓋玻片之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)越大，工作距離越短。油鏡的工作距離最短，約為0.2 mm。不同放大倍數(shù)的物鏡的工作距離不同，但在同一臺(tái)顯微鏡中，不同放大倍數(shù)的物鏡切換時(shí)，只須進(jìn)行細(xì)調(diào)焦便可清晰地觀察到標(biāo)本。三實(shí)驗(yàn)器材普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、無(wú)水乙醇、香柏油、微生物標(biāo)本片（包括枯草芽孢桿菌Bacillus substilis、大腸埃希氏菌E

10、scherichia coli、四聯(lián)球菌Tetraggenococcus sp.、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）觀察前的準(zhǔn)備1顯微鏡的放置置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約34 cm。2調(diào)節(jié)光源接通電源后，取下目鏡，直接向鏡筒內(nèi)觀察，調(diào)節(jié)聚光鏡上的孔徑光闌，使光闌孔徑與視野恰好一樣大或略小于視野。該步驟的目的是使入射光展開(kāi)的角度與物鏡的數(shù)值孔徑相一致，既可充分發(fā)揮該物鏡的分辨率，又能把超過(guò)該物鏡可能接受的多余光擋住，避免產(chǎn)生干擾。放回目鏡后，通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡上的視野光闌或調(diào)節(jié)照明度控制鈕，選擇最佳的照明效果。（二）觀察一般情況下，特別是初學(xué)者

11、，進(jìn)行顯微鏡觀察時(shí)應(yīng)遵循從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的順序，因?yàn)槲镧R的放大倍數(shù)越小，視野相對(duì)也越大，越易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。1低倍鏡下觀察標(biāo)本（1）放置標(biāo)本：下降鏡臺(tái)或升高鏡筒，將標(biāo)本片放置在鏡臺(tái)上，用壓片夾夾緊，調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使標(biāo)本片上有染色劑的部分處于物鏡正下方。（2）調(diào)焦：轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，升高鏡臺(tái)或下降鏡筒，使低倍鏡頭的前端接近載玻片。用雙眼在目鏡上觀察，并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)下降或鏡筒上升直到可看到物像。然后轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，使物像清晰。（3）觀察：尋找合適的目的菌，仔細(xì)觀察。2高倍鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在低倍鏡下找到合適的目的菌，通過(guò)調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使其移至視野中心。（2）轉(zhuǎn)

12、換高倍鏡：用手按住物鏡轉(zhuǎn)換器慢慢旋轉(zhuǎn)，當(dāng)聽(tīng)到“咔嚓”一聲即表明物鏡已轉(zhuǎn)到正確的工作位置上。（3）調(diào)焦：一般情況下，通一臺(tái)顯微鏡上的物鏡是同焦物鏡。也就是說(shuō)，從低倍鏡切換到高倍鏡后，只要稍微調(diào)節(jié)一下細(xì)調(diào)螺旋就可以看清物像。（4）觀察：仔細(xì)觀察標(biāo)本，比較與低倍鏡下的異同。3油鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在高倍鏡下找到合適的目的菌，通過(guò)調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使其移至視野中心。（2）加香柏油：從小瓶?jī)?nèi)取香柏油12滴，加到欲觀察的涂片上。（3）轉(zhuǎn)換油鏡：將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，下降鏡筒，使油鏡浸入香柏油中，并從側(cè)面觀察，使鏡頭降至既非常接近標(biāo)本片，又不能與標(biāo)本片相接觸的合適位置。（4）調(diào)節(jié)亮度：調(diào)節(jié)聚光器到最高位

13、置，打開(kāi)光圈到最大位置，使進(jìn)入油鏡的光線最多。（5）調(diào)焦：從目鏡中觀察，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，緩慢拉開(kāi)油鏡和標(biāo)本片的距離，至出現(xiàn)模糊的物像時(shí)再用細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)至物像清晰為止。若按上述操作找不到物像，有可能使開(kāi)始時(shí)油鏡頭下降未到位，也有可能是油鏡上升太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過(guò)的物像。遇此情況，應(yīng)重新操作。（6）觀察：仔細(xì)觀察標(biāo)本，比較與低、高倍鏡下的異同，并細(xì)心繪制形態(tài)圖。（三）觀察后對(duì)顯微鏡和標(biāo)本片的處理1處理顯微鏡（1）轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡筒和鏡臺(tái)的距離拉開(kāi)，取出標(biāo)本片。（2）清潔油鏡：先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用蘸少許無(wú)水乙醇的擦鏡紙擦掉殘留的香柏油，再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的無(wú)水乙醇

14、。若使用液體石蠟作鏡油，可以只用擦鏡紙擦凈，不必使用無(wú)水乙醇。（3）清潔目鏡和其它物鏡：用擦鏡紙擦凈其它的物鏡及目鏡。（4）清潔后應(yīng)將物鏡轉(zhuǎn)成“八字形”，緩慢上升鏡臺(tái)，使物鏡擱置在鏡臺(tái)上。將聚光鏡降至最低位置。在顯微鏡上套上鏡罩后放入顯微鏡柜中。2處理標(biāo)本片：對(duì)標(biāo)本片上的香柏油，要用拉紙法擦試。先把一張小擦鏡紙蓋在油滴上，再滴上23滴無(wú)水乙醇，平拉擦鏡紙，使其輕輕在標(biāo)本片上拖過(guò)。重新?lián)Q上干凈擦鏡紙后重復(fù)。23次后，肉眼觀察標(biāo)本片上無(wú)香柏油殘留即可。五注意事項(xiàng)1取顯微鏡時(shí)應(yīng)該用右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡身保持直立。切忌單手拎提顯微鏡。2. 所有鏡面切忌用手指、紗布、普通紙張擦試，以免磨損鏡

15、面，需要時(shí)只能用擦鏡紙擦試。3. 粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋調(diào)焦時(shí)，切忌采用對(duì)著目鏡邊觀察邊上升鏡臺(tái)的錯(cuò)誤操作，應(yīng)從側(cè)面注視，以免壓壞標(biāo)本片和損壞鏡頭。油鏡的工作距離很短，操作時(shí)要尤其小心謹(jǐn)慎。4. 觀察標(biāo)本片時(shí)注意標(biāo)本片的正面，也就是涂布有微生物的一面向上。5. 觀察完畢后注意用正確的方法擦試標(biāo)本片上的殘余香柏油。動(dòng)作要輕柔，切勿將標(biāo)本片上涂有微生物的部分擦去。六實(shí)驗(yàn)記錄繪制四個(gè)形態(tài)圖，分別記錄油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、四聯(lián)球菌、釀酒酵母的個(gè)體形態(tài)。七預(yù)習(xí)思考題列出顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡的觀察對(duì)象。八思考題1. 使用油鏡觀察時(shí)為何要在標(biāo)本片和鏡頭之間滴加香柏油？2. 使用油鏡觀察時(shí)

16、應(yīng)如何調(diào)節(jié)顯微鏡的聚光鏡和光圈？3. 如果放置標(biāo)本片時(shí)不小心放反，使標(biāo)本片正面在下，用低倍鏡和高倍鏡都可以正常觀察，但用油鏡卻找不到觀察對(duì)象，為什么？4. 油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過(guò)多的酒精擦試會(huì)有什么危害？實(shí)驗(yàn)二 微生物的形態(tài)觀察一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)和群體形態(tài)。2. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)放線菌的基本形態(tài)、孢子絲的形態(tài)和群體形態(tài)。3. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)真菌的基本形態(tài)、特化結(jié)構(gòu)和群體形態(tài)。4. 鞏固光學(xué)顯微鏡的使用方法，重點(diǎn)掌握油鏡的使用方法。5. 學(xué)習(xí)微生物個(gè)體形態(tài)圖畫(huà)法。二實(shí)驗(yàn)原理微生物種類(lèi)繁多，不同的微生物其個(gè)體形態(tài)和群體形態(tài)是不同的。因此微生物的形態(tài)

17、是其分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。最常見(jiàn)的細(xì)菌個(gè)體形態(tài)分為三類(lèi)，分別為球菌、桿菌和螺旋菌，放線菌和霉菌的個(gè)體形態(tài)都為絲狀菌，酵母菌的個(gè)體形態(tài)為卵圓形。放線菌根據(jù)其孢子絲的不同分為螺旋和直型等，根據(jù)分化的情況分為叢生和輪生等。霉菌的特化型菌絲有青霉菌的青霉穗，曲霉的足細(xì)胞和根霉的假根等。一個(gè)細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上繁殖集聚成肉眼可見(jiàn)的集落稱(chēng)為菌落。各種微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落具有一定的特征，包括菌落的大小、形狀、光澤、顏色、氣味、與培養(yǎng)基結(jié)合的牢固度等。一般而言細(xì)菌的菌落較小，表面光滑或粗糙，濕潤(rùn)或干燥，具有臭味，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固（易被挑起）。放線菌的菌落大小與細(xì)菌菌落大小相似，表面大多呈干燥粉狀，具

18、有土腥味，與培養(yǎng)基結(jié)合牢固（不易被挑起）。有些放線菌的基內(nèi)菌絲能產(chǎn)水溶性或脂溶性色素（圖）。 A B圖 放線菌的基內(nèi)菌絲產(chǎn)生的色素（A.水溶性色素，B.脂溶性色素）霉菌的菌落比細(xì)菌和放線菌的菌落大幾倍至幾十倍，菌落疏松呈絨毛狀或絮狀，具有霉味，與培養(yǎng)基結(jié)合牢固（不易被挑起）。酵母菌的菌落形態(tài)與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大且厚，表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固（易被挑起）。常見(jiàn)酵母菌大多為乳白色，釀酒酵母具有酒香味。三實(shí)驗(yàn)器材1.微生物基本形態(tài)標(biāo)本片（1）細(xì)菌：四聯(lián)球菌（Tetraggenococcus sp.）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、金黃色葡萄球菌（Staphyloc

19、occus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、逗號(hào)弧菌（Vibrio comma）（2）放線菌：林可鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）（3）霉菌：青霉菌（Penicillium sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、毛霉（Mucor sp.）（4）酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2.微生物特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)本片（1）殺螟桿菌（Bacillus cereus）不同生長(zhǎng)階段標(biāo)本片：用于觀察芽孢的形成（2）圓褐固氮菌（Azo

20、tobacter chroococcum）：用于觀察莢膜（3）鏈霉菌（Streptomyces sp.）孢子絲：用于觀察不同鏈霉菌孢子絲的形態(tài)（4）青霉、曲霉、根霉、毛霉特化菌絲：用于觀察霉菌菌絲的不同特化形態(tài)3微生物菌落平板：大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌、林可鏈霉菌、青霉菌、曲霉、毛霉、根霉、釀酒酵母、噬菌斑4儀器和其他材料：顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，無(wú)水乙醇四實(shí)驗(yàn)步驟1. 微生物個(gè)體形態(tài)的觀察（1）將需觀察的標(biāo)本片置于光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上，用十字推進(jìn)器夾住。（2）先用低倍鏡觀察，找到目標(biāo)物。（3）在標(biāo)本片上滴上1滴香柏油，然后換成油鏡觀察。（4）畫(huà)出微生物的個(gè)體形態(tài)圖。（5）實(shí)驗(yàn)完畢后，取

21、下標(biāo)本片，顯微鏡的油鏡用擦鏡紙擦拭干凈后，放回指定地方。2. 微生物群體形態(tài)的觀察取分別培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等的培養(yǎng)皿，用肉眼觀察他們的群體形態(tài)并描述其特征。五實(shí)驗(yàn)記錄1.描繪微生物個(gè)體形態(tài)圖表 微生物個(gè)體形態(tài)圖菌名：菌名：菌名：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：個(gè)體形態(tài)描述個(gè)體形態(tài)描述個(gè)體形態(tài)描述個(gè)體形態(tài)圖個(gè)體形態(tài)圖個(gè)體形態(tài)圖2.微生物群體形態(tài)描述表 微生物群體形態(tài)描述：微生物名稱(chēng)菌落大小菌落顏色菌落形狀菌落邊緣情況菌落隆起情況菌落透明情況粘稠度是否有光澤干燥與粗糙程度與培養(yǎng)基結(jié)合的牢固度氣味其它六實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 標(biāo)本片要正面朝上放置。2. 香柏油從瓶中取出時(shí)，不要

22、攪動(dòng)，滴上載玻片后也不要涂抹，以免形成氣泡，影響觀察。3. 香柏油不宜過(guò)多，只需一小滴。4. 使用油鏡時(shí)盡量將聚光器向上，光闌放大。5. 注意不同物鏡的工作環(huán)境，低倍鏡和高倍鏡不能浸入香柏油中，而油鏡在觀察時(shí)一定要浸入香柏油中。6. 實(shí)驗(yàn)完畢后，顯微鏡的油鏡用擦鏡紙擦拭干凈后，放回相應(yīng)的地方。七預(yù)習(xí)思考題列表比較細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌的個(gè)體形態(tài)和群體形態(tài)的異同點(diǎn)。八思考題1. 為什么使用油鏡觀察時(shí)，油鏡一定要浸入香柏油中？2. 使用油鏡時(shí)該如何調(diào)節(jié)聚光器和光闌？3. 如果標(biāo)本片放反，分別用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，會(huì)出現(xiàn)怎樣的結(jié)果？為什么？實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的配制和高壓蒸汽滅菌一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.

23、了解微生物的營(yíng)養(yǎng)需求。2. 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基配制的方法。3. 學(xué)習(xí)并掌握高壓蒸汽滅菌原理和培養(yǎng)基的滅菌方法。二實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是由人工配制的、微生物在實(shí)驗(yàn)室的生長(zhǎng)環(huán)境。在合適的營(yíng)養(yǎng)物組成的培養(yǎng)基上，微生物吸收培養(yǎng)基中的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從中獲得能量并合成組成細(xì)胞所需的物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。微生物的種類(lèi)繁多，不同營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也不同，必須根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求以及研究的目的配制合適的培養(yǎng)基。除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，培養(yǎng)基的pH也是一個(gè)很重要的。因?yàn)閜H會(huì)影響到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，還會(huì)影響到微生物代謝過(guò)程中的各種酶的活性。因此配制培養(yǎng)基時(shí)一定要了解微生物對(duì)環(huán)境pH的要求。 為防止配置好

24、的培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)，因此配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌。對(duì)于培養(yǎng)基的滅菌，一般采用濕熱滅菌即高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌是利用高溫引起菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌效果的。 三實(shí)驗(yàn)器材1. 培養(yǎng)基成分：牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂2. 試劑：1mol/L NaOH溶液，1mol/L HCl溶液3. 玻璃器皿：三角燒瓶，燒杯，量筒，試管，漏斗4. 其它材料：pH試紙，攪棒，紗布，臺(tái)秤，藥匙，棉塞，牛皮紙，棉線，記號(hào)筆等四實(shí)驗(yàn)步驟1. 培養(yǎng)基的配制（1）稱(chēng)量：根據(jù)培養(yǎng)基配方和配制培養(yǎng)基的量計(jì)算出各種成分所需用量，選用精度合適的臺(tái)秤準(zhǔn)確稱(chēng)取各種成分。（2）溶解：一般情況下，幾種培養(yǎng)基成分可一起倒入燒杯內(nèi)

25、，然后加入少于所需要的水量，加熱溶解。加熱溶解時(shí)要不斷攪拌，待各成分完全溶解后，補(bǔ)足水分至所需配制的體積。如有磷酸鹽和鈣鹽等混合在一起時(shí)易產(chǎn)生沉淀，則要分別溶解，另外配制有淀粉的培養(yǎng)基，應(yīng)先將淀粉糊化。（3）調(diào)節(jié)pH值：培養(yǎng)基配好后，先用pH試紙或pH計(jì)測(cè)出其原始pH值，然后用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至需要的pH。（4）分裝：a斜面培養(yǎng)基分裝：量取所需體積的液體培養(yǎng)基倒入燒杯中，加入1.5%2.0%（w/v）瓊脂，攪拌均勻并加熱使其完全融化，最后用熱水補(bǔ)足因蒸發(fā)而損失的水分（注意在加熱融化瓊脂的過(guò)程中要不斷攪拌，以防瓊脂沉淀而燒焦）。趁熱分裝于15×1

26、50cm試管中，每支試管加量約23ml。b. 半固體培養(yǎng)基分裝：除了瓊脂加量為0.5%1.0%（w/v），其他同斜面培養(yǎng)基分裝。趁熱在15×150cm試管中加入4ml培養(yǎng)基。c. 液體培養(yǎng)基的分裝：直接將配制好的培養(yǎng)基分裝于15×150cm試管或250ml三角瓶中。15×150cm試管裝34 ml，250ml三角瓶裝25100ml。d. 固體培養(yǎng)基三角瓶的分裝：直接在三角瓶中按1.52.0%（w/v）加入瓊脂，然后加入一定體積的液體培養(yǎng)基。一般250ml三角瓶裝100ml培養(yǎng)基。注意瓊脂不必加熱融化，因?yàn)樵跍缇鷷r(shí)瓊脂會(huì)融化的。（5）加塞：試管口和三角瓶口塞上合適的

27、棉塞或硅膠塞。（圖×-×） 圖×-×（6）包扎a三角瓶的包扎：在棉塞外包一層牛皮紙，用棉線扎好。圖×-×b. 試管包扎：58支為一捆，在棉塞外包一層牛皮紙，用棉線扎好。圖×-×（7）滅菌：將包扎好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121滅菌30min。操作詳見(jiàn)×-×a滅菌鍋內(nèi)加水：滅菌前檢查滅菌鍋的水位是否在刻度范圍，如水位低于要求，務(wù)必向鍋內(nèi)加水，使水位在要求的刻度范圍。加的水要求最好用去離子水。b. 放置滅菌物品：為了達(dá)到良好的滅菌的效果，每次放置物品的量要適合，培養(yǎng)基和物品疊放不能過(guò)于緊密。c

28、. 蓋上滅菌鍋鍋蓋，旋緊滅菌鍋的螺絲，使滅菌鍋密閉。d. 接通電源進(jìn)行加熱，同時(shí)打開(kāi)滅菌鍋的排氣閥，當(dāng)水煮沸時(shí)，大量蒸汽從排氣閥中沖出，冷空氣也隨之排出，冷空氣被排盡后關(guān)上排氣閥。e. 升溫保壓：此時(shí)滅菌鍋內(nèi)蒸汽壓力和溫度逐漸上升，當(dāng)滅菌鍋壓力指示達(dá)到額定工作壓力時(shí)，如果滅菌鍋有自動(dòng)控制系統(tǒng)，則自動(dòng)控制壓力，此時(shí)開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間。如果無(wú)自動(dòng)控制系統(tǒng)，必須仔細(xì)的控制滅菌鍋的壓力，保持其在整個(gè)滅菌時(shí)間內(nèi)處于所需的壓力，盡可能減小波動(dòng)。滅菌常用的壓力為0.11MPa，對(duì)應(yīng)的溫度為121。滅菌時(shí)間30min。f. 降壓冷卻：滅菌時(shí)間到后，停止加熱，讓滅菌鍋內(nèi)的壓力自然下降，當(dāng)壓力表指示為“0”時(shí)，再打

29、開(kāi)排氣閥，打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品。（8）斜面的擺放：對(duì)于斜面培養(yǎng)基，滅菌后趁熱將試管擱在長(zhǎng)木條上圖×-×，并調(diào)整坡度，使斜面培養(yǎng)基的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半，待冷卻凝固后備用。五實(shí)驗(yàn)記錄1. 培養(yǎng)基配制和滅菌記錄培養(yǎng)基名稱(chēng)配制量(ml)配制日期消前pH消后pH培養(yǎng)基成分藥品名稱(chēng)含量（%）稱(chēng)量值（g）生產(chǎn)廠商規(guī)格培養(yǎng)基分裝液體滅菌前滅菌后15×150試管250ml三角瓶15×150試管250ml三角瓶裝量（ml）數(shù)量（支）裝量（ml）數(shù)量（瓶）數(shù)量（支）數(shù)量（瓶）半固體15×150試管15×150試管裝量（ml）數(shù)量（支）數(shù)量（支）固體

30、15×150試管250ml三角瓶15×150試管250ml三角瓶裝量（ml）數(shù)量（支）裝量（ml）數(shù)量（瓶）數(shù)量（支）數(shù)量（瓶）培養(yǎng)基滅菌滅菌溫度（）滅菌時(shí)間（min）滅菌鍋壓力（Pa）滅菌鍋型號(hào)滅菌過(guò)程開(kāi)始滅菌時(shí)間達(dá)到121時(shí)間保溫結(jié)束時(shí)間保溫維持時(shí)間滅菌鍋打開(kāi)時(shí)間整個(gè)滅菌時(shí)間備注：六實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 培養(yǎng)基成分中的鹽類(lèi)，如放在一起溶解會(huì)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，則要分別溶解。2. 淀粉糊化：用一燒杯盛一定量的水，加熱至沸騰后，慢慢倒入事先用少量冷水調(diào)勻的淀粉，混勻即可。3. 注意培養(yǎng)基對(duì)pH的要求。4. 加熱融化瓊脂時(shí)，要不斷攪拌，以免瓊脂沉淀燒焦。5. 滅菌鍋是高壓容器，使用時(shí)必

31、須按使用說(shuō)明操作，以免發(fā)生事故。6. 滅菌結(jié)束后，一定要等壓力表指示為“0”才能打開(kāi)鍋蓋。七預(yù)習(xí)思考題1. 列表對(duì)比各種滅菌方式，包括原理、適用范圍等。2. 試分析下列高壓蒸汽滅菌操作要點(diǎn)的原理（1）為什么滅菌時(shí)滅菌鍋內(nèi)最好添加去離子水？（2）滅菌時(shí)必須將滅菌鍋中的空氣排盡；（3）滅菌一般條件為121C，15-30分鐘；八思考題1. 用高壓蒸汽滅菌，如何達(dá)到較好的滅菌效果？2. 在同樣條件下，為什么濕熱滅菌的效果比干熱滅菌的效果好？3. 高壓蒸汽滅菌后，為什么鍋內(nèi)壓力要慢慢降低？為什么壓力表指示須降到“0”才能打開(kāi)鍋蓋？4. 配制好的培養(yǎng)基為什么須即刻滅菌？實(shí)驗(yàn)四 微生物的接種分離和純培養(yǎng) 一

32、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)以無(wú)菌操作的手段對(duì)微生物進(jìn)行接種、分離的操作，學(xué)習(xí)斜面接種技術(shù)、液體接種技術(shù)和穿刺接種技術(shù)；學(xué)習(xí)常用的微生物分離操作，如瓊脂平板劃線分離法和稀釋分離法。二實(shí)驗(yàn)原理自然界中的微生物都是雜居在一起的，通過(guò)分離，使它們由混雜狀態(tài)到單個(gè)個(gè)體從而在固體培養(yǎng)基上成為一個(gè)菌落，就可獲得菌落水平的純種。純種分離的方法很多，其原理是將待分離的樣品進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)⑹怪稚?，在固體培養(yǎng)基上形成由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的菌落，再轉(zhuǎn)接到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，一般就認(rèn)為是純種。微生物接種技術(shù)是將微生物接到適于生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基或生物體內(nèi)的過(guò)程，是生物科學(xué)研究中最基本的操作技術(shù)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑴囵B(yǎng)基種類(lèi)及容器等不同，

33、接種方法也不同，如斜面接種、液體接種、半固體穿刺接種等。接種方法的不同，采用的接種工具也不同，如接種環(huán)、接種針、移液管和刮鏟等。為獲得生長(zhǎng)良好的純種微生物，接種必須在一個(gè)無(wú)雜菌污染的環(huán)境中進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。無(wú)菌操作有問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠。在發(fā)酵工業(yè)中如無(wú)菌操作不嚴(yán)格會(huì)造成染菌，給生產(chǎn)帶來(lái)危害，所以我們應(yīng)牢固樹(shù)立“無(wú)菌操作”的概念。三實(shí)驗(yàn)器材1. 菌種：四聯(lián)球菌（Tetraggenococcus sp.），大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis），普通變形桿菌（Proteus vulgaris），三種細(xì)菌（四聯(lián)球菌，大腸桿菌，枯草芽孢

34、桿菌）的混合菌液 2. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基3. 其他：接種針，接種環(huán)，培養(yǎng)皿，吸管，記號(hào)筆等。四實(shí)驗(yàn)步驟1. 接種法（1）斜面接種技術(shù)：斜面接種是從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移至另一支新鮮斜面培養(yǎng)基上的一種接種方法。接種前需要在待接種斜面試管上用記號(hào)筆注明菌名、接種日期、接種人姓名等。用接種環(huán)將菌種移接到做好標(biāo)記的試管斜面上。無(wú)菌操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下：a將菌種斜面和待接種新鮮斜面夾在左手的食指、中指和無(wú)名指之間，大拇指按在兩支試管的中間（斜面向上）。用右手將棉塞旋松，以便接種時(shí)拔出。b右手拿接種環(huán)，使其垂直于火焰中，先燒紅環(huán)端，然

35、后將有可能伸入試管的其余部分也過(guò)火滅菌。c用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊夾住兩試管的棉塞，輕輕拔出，將試管口過(guò)火后移開(kāi)，但使試管口仍靠近并面向火焰。d將接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，在試管壁將接種環(huán)冷卻后沾取少量菌體。e將接種環(huán)引入待接種的斜面，自下而上在斜面上劃一直線或曲線即可。f取出接種環(huán)，將試管口再次過(guò)火后塞上棉塞，灼燒用過(guò)的接種環(huán)并放回原處。g將棉塞塞緊，接種好的試管斜面放入37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2448h。（2）液體接種技術(shù)a同上法以無(wú)菌操作挑取少許菌體引入待接種的液體培養(yǎng)基中，在接近液面處的試管壁上輕輕摩擦，并適當(dāng)搖動(dòng)，使之均勻分布在液體中。b塞緊棉塞后，放入37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2448h。（

36、3）穿刺接種技術(shù)：穿刺接種是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并穿刺到半固體的培養(yǎng)基中的接種方法。具體方法如下： a同上法用接種針以無(wú)菌操作挑取少許菌體穿刺于半固體培養(yǎng)基中間，刺至管底，再按原途退出。穿刺時(shí)要做到手穩(wěn)、動(dòng)作輕巧快速。b塞緊棉塞后，放入37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。如生長(zhǎng)只限于接種直線，說(shuō)明細(xì)菌不運(yùn)動(dòng)，如生長(zhǎng)不限于接種直線而四周蔓延，則說(shuō)明細(xì)菌能運(yùn)動(dòng)。2. 微生物分離法 （1）瓊脂平板劃線分離法a將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，冷卻至45左右。b左手持盛有上述培養(yǎng)基的三角瓶，在火焰附近，用右手手掌邊夾取棉塞，將三角瓶轉(zhuǎn)移到右手，并使瓶口過(guò)火。c. 左手取一無(wú)菌培養(yǎng)

37、皿，在火焰邊稍稍打開(kāi)皿蓋，倒入熔化的上述培養(yǎng)基15ml左右，放在桌面上輕輕搖勻，待凝后即成平板。d. 以無(wú)菌操作用接種環(huán)沾取待分離的混合菌液。e. 左手持培養(yǎng)皿底并使其面向火焰，依次輕輕而迅速地一條條緊接著劃線，劃線距離要恰當(dāng)（盡量靠近，但線與線之間不能碰到，以充分利用表面積），劃過(guò)下面后切勿再回上去重復(fù)劃，劃線方法可參照下圖。（如圖4- 所示）圖4- 平板劃線方法示意圖f. 蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。（2）稀釋分離法a取無(wú)菌生理鹽水（含NaCl 0.85%）試管三支（每支裝量4.5ml），用記號(hào)筆編號(hào)I，II，III。b以無(wú)菌操作取混合菌液一接種環(huán)于I號(hào)試

38、管中，搖勻。c同法自I管至II管，自II管至III管。d用1ml無(wú)菌吸管，分別從III，II，I管中吸取0.2ml稀釋好的菌液于三個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并相應(yīng)地注明編號(hào)。e倒入熔化后冷卻至45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml左右，輕輕搖勻，待凝后倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。五注意事項(xiàng)1. 本實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格無(wú)菌操作。2. 接種環(huán)或接種針在充分灼燒后伸入試管取菌前，一定要在試管壁上進(jìn)行冷卻。3. 在稀釋分離實(shí)驗(yàn)中，取菌前一定要把菌液充分搖勻，使得三種菌在平板上能夠均勻分布。4. 接種過(guò)菌體的金屬接種針或環(huán)要進(jìn)行灼燒滅菌后才能放置到桌面上，菌液或接觸過(guò)菌體的其他器械必須經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅

39、菌后才能倒入下水道或重復(fù)使用。六實(shí)驗(yàn)記錄 記錄接種及分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容固體接種液體接種穿刺接種稀釋分離劃線分離所用菌株四聯(lián)球菌大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草桿菌四聯(lián)球菌變形桿菌細(xì)菌混合菌液細(xì)菌混合菌液實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象結(jié)果判斷七預(yù)習(xí)思考題微生物的純種分離通常采用哪些方法，并說(shuō)明各自的優(yōu)缺點(diǎn)。八思考題1. 微生物的純種分離通常采用哪些方法，并說(shuō)明各自的優(yōu)缺點(diǎn)。2. 什么叫微生物的污染？如何防止？實(shí)驗(yàn)五 微生物的計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)微生物細(xì)胞或孢子的個(gè)數(shù)測(cè)定。二實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱(chēng)計(jì)菌器），于顯微鏡下

40、直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血球計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。其中血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，因此常用于對(duì)個(gè)體較大的酵母、霉菌孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。而后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02 mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02 mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前

41、已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。 A B圖4- 血球計(jì)數(shù)板（A）和Hawksley計(jì)菌器(B)血球計(jì)數(shù)器是一塊特制的厚載玻片，由4條平行的槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。較寬的中間平臺(tái)被單一短槽分隔成兩半，每半平臺(tái)上均刻有長(zhǎng)寬各為1mm的大方格，中間平臺(tái)下陷0.1mm，所以當(dāng)蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)室的體積為0.1mm3即1×10-4ml。血球計(jì)數(shù)器常有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格再分成16個(gè)

42、小方格。兩種規(guī)格的計(jì)數(shù)室一個(gè)大方格均為400個(gè)小方格。圖 血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室（25×16）三實(shí)驗(yàn)器材1菌種 ： 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2儀器或其他用具： 血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)滴管。四操作步驟l. 菌懸液制備：以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?. 鏡檢計(jì)數(shù)室：在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3. 加樣品：將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液沿蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液順縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般

43、計(jì)數(shù)室均能充滿(mǎn)菌液。（取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生）。4. 顯微鏡計(jì)數(shù)：加樣后靜止5min，然后將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)注意調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱要適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。 在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)

44、，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。菌液濃度（菌數(shù)/ml）N×2.5×105×稀釋倍數(shù)（N為中格內(nèi)菌數(shù)的平均值）5. 清洗血球計(jì)數(shù)板 使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。4，7，9，11五注意事項(xiàng)1. 使用血球計(jì)數(shù)板前，要先觀察該計(jì)數(shù)板是何種規(guī)格，并按照相應(yīng)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。2. 菌液一定要搖勻。3. 計(jì)數(shù)室內(nèi)不可以有氣泡。4. 向計(jì)數(shù)室加樣時(shí)，避免滴加到計(jì)數(shù)室表面，以免造成計(jì)數(shù)結(jié)

45、果偏高。六實(shí)驗(yàn)記錄 將顯微技術(shù)的結(jié)果記錄于表 中。表 各中格格數(shù)中格中平均菌數(shù)濃度：菌數(shù)/ml12345第一室第二室七預(yù)習(xí)思考題列表比較血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法、平皿計(jì)數(shù)法、比濁法等各種菌數(shù)計(jì)數(shù)法的原理、適用范圍、所需設(shè)備、操作步驟等。八思考題1.用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確?2. 某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)12種可行的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)六 微生物的計(jì)數(shù)平板活菌計(jì)數(shù)法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)平板活菌計(jì)數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能。二實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)

46、過(guò)培養(yǎng)，每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成肉眼可見(jiàn)的菌落，一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出單位體積樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的多個(gè)細(xì)胞，尤其是像四聯(lián)球菌、八疊球菌等，往往多個(gè)細(xì)胞才能形成一個(gè)單菌落。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位（colony-forming units，cfu），而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。該計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)是操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是這種計(jì)數(shù)方

47、法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)，以及食品、飲料和水等含菌指數(shù)或污染度的檢測(cè)。三實(shí)驗(yàn)器材1. 菌液：釀酒酵母的菌液2. 其他：無(wú)菌吸管，無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌生理鹽水，沙保瓊脂培養(yǎng)基四操作步驟1. 取六套無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4，10-5，10-6各兩套，另取六支盛有4.5ml生理鹽水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。2. 將釀酒酵母菌液混勻，用1ml無(wú)菌吸管吸取0.5ml放入標(biāo)名10-1生理鹽水的試管中，搖勻。依次稀釋至10-6。3. 從10-4，10-5，10-6管中分別吸取0.2ml于標(biāo)明10-4

48、，10-5，10-6的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。4. 于上述放有各稀釋度菌液的培養(yǎng)皿中，倒入熔化并冷卻至45左右的沙保瓊脂培養(yǎng)基約15ml，立即輕旋混勻，待凝后倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)（選擇菌落數(shù)在30300個(gè)左右的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)）。5. 菌液濃度的計(jì)算：菌液濃度（菌數(shù)/ml）菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×56. 稀釋度選擇與菌落總數(shù)的記錄方式表 稀釋度選擇與菌落總數(shù)的記錄表例次稀釋倍數(shù)兩稀釋倍數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè)/mL）數(shù)據(jù)結(jié)果（個(gè)/mL）10-210-310-41118713521-1350001.4×10522530263451.73565003.6×1053

49、2680270622.32700002.7×1054不可計(jì)數(shù)2130321-32100003.2×106527122-27002.7×1036不可計(jì)數(shù)31227-3120003.1×106以表為例說(shuō)明：（1）一般選取菌落數(shù)30-300之間的培養(yǎng)皿作為菌落總數(shù)測(cè)定的依據(jù)。酵母、細(xì)菌可采用菌落數(shù)偏大者，而霉菌則應(yīng)選取菌落數(shù)偏小者。比如在根霉、毛霉的培養(yǎng)基中可以添加0.1%的去氧膽酸鈉，以限制其擴(kuò)散，方便計(jì)數(shù)。菌種計(jì)數(shù)應(yīng)以菌落間各個(gè)分開(kāi)為宜。（2）若有兩個(gè)稀釋度，其測(cè)量得到的菌落數(shù)都在30-300之間，則應(yīng)比較兩者比值，若其比值小于2，則應(yīng)取平均值；若大于2，

50、則取其較小數(shù)（表中例2、3）（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)都大于300，則需要重新設(shè)定稀釋度后再次稀釋分離，或選擇稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為結(jié)果（例4）（4）若所有的稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則需要重新設(shè)定稀釋度后再次稀釋分離，或選擇稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為結(jié)果（例5）（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為結(jié)果（例6）（6）菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)，按實(shí)有數(shù)記錄，若大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，二位有效數(shù)后的數(shù)字，以四舍五入法計(jì)算，一般以10的指數(shù)形式表示結(jié)果。五注意事項(xiàng)1. 嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免因雜菌污染而

51、影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。2. 前一稀釋度的平均菌落數(shù)應(yīng)大致為后一稀釋度平均菌落數(shù)的10倍左右，若差別太大，實(shí)驗(yàn)應(yīng)重做。3. 菌落稠密成片生長(zhǎng)的平板，不能用來(lái)計(jì)數(shù)。六實(shí)驗(yàn)記錄稀釋度結(jié)果菌落數(shù)123123123CFU/ml平均七預(yù)習(xí)思考題平板活菌計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何正確表述？八思考題1. 要使平板活菌計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，為什么？2. 血球計(jì)數(shù)板法和平板活菌計(jì)數(shù)法二者的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？從兩種方法計(jì)數(shù)得出的菌液濃度是否一致？為什么？3. 平板活菌計(jì)數(shù)法中，為何選擇生長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)？實(shí)驗(yàn)七 微生物染色技術(shù)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片和染色的操作技術(shù)2. 學(xué)習(xí)并掌握微生物

52、簡(jiǎn)單染色和特殊染色的原理和方法二實(shí)驗(yàn)原理染色是一項(xiàng)微生物學(xué)基本技術(shù)。由于微生物細(xì)胞體積小，且含有大量水分，因此其對(duì)光線的吸收和反射與水溶液無(wú)明顯差別，在用普通光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，往往與周?chē)尘皼](méi)有明顯的明暗差，這樣就不能較清晰地觀察到細(xì)胞的形態(tài)。采用微生物染色技術(shù)，使細(xì)胞和周?chē)尘爸g明暗度產(chǎn)生明顯的差異，就能解決這一問(wèn)題。因此，微生物染色技術(shù)是觀察微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要手段。染料按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，主要分為酸性染料、堿性染料和中性（復(fù)合）染料。酸性染料（如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等）電離產(chǎn)生的染料離子帶負(fù)電，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。堿性染料（如美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫

53、、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等）電離產(chǎn)生的染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。中性（復(fù)合）染料是酸性染料與堿性染料的結(jié)合物。細(xì)菌等電點(diǎn)在pH在25之間，故在中性、堿性或偏酸性（pH=67）的溶液中，帶負(fù)電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，所以用堿性染料染色的為多。除觀察細(xì)菌形態(tài)的簡(jiǎn)單染色外，還有一些鑒別染色法和特殊染色法。革蘭氏染色法是細(xì)菌重要的鑒別染色法。經(jīng)該法染色后可將細(xì)菌區(qū)分為兩大類(lèi)，即染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱(chēng)為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱(chēng)為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示?？顾嵝匀旧ㄒ彩且环N重要的鑒別染色法，主要用于鑒別分枝桿菌屬。屬于分枝桿菌屬的細(xì)菌含有分

54、枝菌酸，在加熱條件下完整細(xì)胞中的分枝菌酸能與石炭酸和復(fù)紅所形成的復(fù)合物牢固地結(jié)合，并能抵抗酸性酒精的脫色，故被染成紅色。而非抗酸性細(xì)菌因不含有分枝菌酸，故易脫色，并被復(fù)染劑染成藍(lán)色。芽孢染色法是利用芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)染料親和力不同而使芽孢和營(yíng)養(yǎng)體染上不同顏色，從而更明顯襯托出芽孢，便于觀察。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色（芽孢呈透明）。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦染上后又難以脫色的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽孢著色。 莢膜染色法：莢膜是某些細(xì)菌細(xì)胞壁外面圍著的一層較厚而固定的粘性物質(zhì)，其與染料間的親和力弱，不易著色，因此通常采用負(fù)染色法，即使菌體和背景著色，而使不易著色的莢膜形成一透明區(qū)域，便于觀察。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時(shí)一般不用熱固定，以免莢膜皺縮變形。 鞭毛染色法：細(xì)菌鞭毛極細(xì)，直徑一般為1020nm，一般的光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀察，要使用放大倍數(shù)更高的電鏡才能看到。如采用特殊染色法