重組抗體藥物的質(zhì)量控制_高凱解析

1、Chi nese Journal of New Drugs 2011,20(19基金項目國家 重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2009ZX09307-001 ;國家高 技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃（2007AA021601,2007AA021204作者簡介高凱，男，博士，副研究員，主要從事生物技術(shù)藥物質(zhì)量 控制研 究。聯(lián)系電話:（010 67095684,E-mail :gaokainicpbp. org. cn。通訊作者王軍志，男，研究員，博士生導(dǎo) 師，主要從事生物技術(shù)藥 物的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。聯(lián)系電話:（010 67095380, E-mail :wangjznicpbp. org. c

2、n。重大新藥創(chuàng)制專項巡禮重組抗體藥物的質(zhì)量控制高凱，陶磊,王軍志（中國食品藥品檢定研究院重組技術(shù)產(chǎn)品室，北京100050摘要重組抗體藥物是生物工程關(guān)鍵技術(shù)的前沿成果，在腫瘤、自身免疫、 器官移植和感染性疾病的 治療中均取得了顯著療效，在生物技術(shù)藥物市場中的比重 也在迅速攀升。作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域最成功的產(chǎn)品之一，如何通過質(zhì)量控制 確保抗體藥物的安全有效一直是本領(lǐng)域的關(guān)注熱點。文中就重組抗體藥物質(zhì)量控 制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、進(jìn)展及未來需要進(jìn)一步開展的工作作一簡要綜述。關(guān)鍵詞生物技術(shù)藥物；重組抗體；質(zhì)量控制中圖分類號R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號1003-3734（2011 19- 1848 08Qua

3、lity con trol for recomb inant therapeutic an tibodiesGAO Kai , TAO Lei , WANG Jun-zhi(Division of Biopharmaceuticals , National Institutes for Food and Drug Control, Beiji ng 100050, Chi na Abstract Recomb inant therapeutic an tibodies are one of the great achieveme nts of moder n biotech no logy.

4、There is no doubt that the uses of recomb inant therapeutic antibodies were successful in treating various life-threat-ening and chronic diseases , including cancer , autoimmunity , transplantation and infectious diseases Its share in the global biopharmaceutical market also in creased rapidly in re

5、ce nt years Mea nwhile , as one of the most success-ful outcome biotherapeutics ,how to en sure the safety and efficacy of recomb inant an tibody products through well es-tablished quality con trol system is always the focus of atte nti on from both the views of regulatory authorities and in-dustrie

6、s This article briefly reviewed the key points , research progress for the con trol of recomb inant an tibodies , as well as raised further work on quality con trol issues.Key words biopharmaceutics ; recomb inant therapeutic an tibodies ; quality control 藥品的質(zhì)量源于設(shè)計，而非依賴終產(chǎn)品的檢 測1,重組抗體藥物也不例外。廣義 的質(zhì)量控制包括

7、生產(chǎn)過程控制、終產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。抗體由兩條重鏈和輕 鏈以鏈間二硫鍵形成連接，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相對分子質(zhì)量大，采用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體 系制備通常含有翻譯后修飾，與原核體系制備的生物技術(shù) 產(chǎn)品相比，其質(zhì)量控制難 度相對較大。重組抗體藥物的生產(chǎn)過程包括工程細(xì)胞的構(gòu)建及傳代擴(kuò)增、細(xì)胞培養(yǎng)、抗體的純化、產(chǎn)品分裝保存等。因此生產(chǎn)單位需遵循藥品生產(chǎn)質(zhì) 量管理規(guī)范（GMP的總體要求建立質(zhì)量體系，并通過質(zhì)量保證部門對生產(chǎn)過程實 施全程監(jiān)控才能確保終產(chǎn)品的安全有效。鑒于抗體藥物生產(chǎn)過程與其他生物技術(shù) 藥物類似，本文未對抗體藥物生產(chǎn)的過程控制進(jìn)行闡述（相關(guān)內(nèi)容可參見國家食品 藥品監(jiān)督法規(guī)與ICH指導(dǎo)原則等，而主要側(cè)重

8、于介紹重組抗體藥物生產(chǎn)細(xì)胞、質(zhì) 控用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、產(chǎn)品質(zhì)量控制方面的研究進(jìn)展。1生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量控制重組單抗的生產(chǎn)細(xì)胞應(yīng)來自于共同的原始細(xì)胞，具有相同的遺傳和生物學(xué)特征，經(jīng)全面檢測無病 源微生物污染，在特定的培養(yǎng)條件下，可以穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)結(jié)構(gòu)正確并具有生物學(xué)活性的抗體2。ZTlflT 11848 “屮阿職旳仁丄卷j io耳Chi nese Journal of New Drugs 2011,20(19184919期1.1工程細(xì)胞的構(gòu)建 首先應(yīng)清楚所采用細(xì)胞系的來源及培養(yǎng)歷史等有關(guān)背景資料，包括細(xì)胞種屬及地域來源、病原體檢測結(jié)果、最初分離培養(yǎng) 和建系信息、采用的方法與原材料等。在構(gòu)建中應(yīng)說明構(gòu)建和篩選

9、的手段與步 驟、克隆基因的序列、插入載體目的基因編碼區(qū)和相關(guān)側(cè)翼序列，說明載體引入 細(xì)胞的方法及載體在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)與拷貝數(shù)，并應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳 穩(wěn)定性資料。同時還應(yīng)明確細(xì)胞的生長特征、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)液組成、導(dǎo)入目的基因的表達(dá)水平等3 - 4。1. 2細(xì)胞庫的建立細(xì)胞庫的建立可為重組抗體藥物提供質(zhì)量穩(wěn)定以及能持續(xù)傳代的細(xì)胞種子，從而確?？贵w藥物生產(chǎn)的批間一致。與其他生 物技術(shù)藥物的要求類似，抗體生產(chǎn)的細(xì)胞庫為三級管理，即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞 庫及工作細(xì)胞庫5。原始細(xì)胞庫是由一個原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體或經(jīng)過克隆選 擇而形成的均一細(xì)胞群體。主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫則分別由原始細(xì)胞

10、庫和主細(xì)胞庫經(jīng)傳代后均勻混合而成。其中主 細(xì)胞庫最多不得超過2個細(xì)胞代次，同時限定工作細(xì)胞庫代次。工作庫凍存時細(xì)胞 的傳代水平須確保復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞量能滿足生產(chǎn)一批制品。復(fù)蘇后細(xì)胞的 傳代水平不應(yīng)超過批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的最高限定代次。細(xì)胞庫的管理要求建立臺賬，每支細(xì)胞有明確標(biāo)記，包括名稱、代次、批號、凍存日期等。主庫和工作庫應(yīng)分別存放，非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。上述各級種子庫的細(xì)胞應(yīng)按照特定的要求經(jīng)過全面檢定合格后方可使用。1 3細(xì)胞檢定抗體藥物的生產(chǎn)細(xì)胞檢定包括鑒別、病源微生物、致瘤性等檢查，同時以基 因工程技術(shù)構(gòu)建的重組抗體生產(chǎn)細(xì)胞，還應(yīng)包括特異的鑒別試驗與細(xì)胞基質(zhì)穩(wěn)定性內(nèi)容6

11、o1. 3. 1細(xì)胞鑒別細(xì)胞鑒別可通過形態(tài)、生化方法（同工酶等、免疫學(xué)檢測（組織相容性抗原等、遺傳學(xué)檢測（染色體核型等7、遺傳標(biāo)志檢測（DNA指紋圖譜等等方法,并應(yīng)采用不同方法 進(jìn)行聯(lián)合檢測?？贵w基因或其表達(dá)產(chǎn)物可通過PCR、限制性內(nèi)切酶譜、Southern雜交以及免疫印跡等方法進(jìn)行鑒別。建庫后應(yīng)對主庫和生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行全檢，同時新建的工作庫細(xì)胞也需按規(guī)定要求進(jìn)行檢定。1. 3. 2病源微生物檢測該項檢測包括無菌、支原體、細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查。其中病毒檢測的種類及方法須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源及細(xì)胞特性決定8。通常病毒因子可通過細(xì)胞形態(tài)觀察、紅細(xì)胞吸附試驗、不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法及接種動物和雞胚法檢

12、測，其中，中華人民共和國藥典2010年版三部中新增規(guī)定：用不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子時，應(yīng)設(shè)立可 觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對照及血吸附陽性對照 。對于重組工程細(xì)胞來說，還應(yīng) 當(dāng)對細(xì)胞裂解物或收獲液進(jìn)行外源因子檢測9對于逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測，可采用逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定、透射電鏡以及感 染性試驗方法。根據(jù)待 檢細(xì)胞系的種屬及組織來 源，還應(yīng)進(jìn)行特殊外源病毒因子的檢測。如鼠源細(xì)胞系, 需檢測出血熱病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病 毒、呼腸孤病毒等；如為人源細(xì) 胞系，應(yīng)檢測鼻咽癌病毒、巨細(xì)胞病毒、乙型、丙型肝炎病毒等。1. 3. 3致瘤性檢查致瘤性檢查可通過裸鼠和新生小鼠體內(nèi)試驗以 及

13、軟瓊脂克隆形成等體外方法 進(jìn)行。目前重組抗體 生產(chǎn)的CHO等細(xì)胞株已證明具有致瘤性，通常不再 要求進(jìn) 行該項檢查，但也有觀點認(rèn)為插入抗體等特定基因序列的重組工程細(xì)胞應(yīng)當(dāng)被視為 全新細(xì)胞，須進(jìn)行致瘤性檢查，并在傳代/擴(kuò)增過程中進(jìn)行試驗對比，觀察致瘤性特征的改變。基于安全性考 慮，還需要優(yōu)化抗體藥物的純化工藝，并在終產(chǎn)品的放行中嚴(yán)格限量控制殘余DNA等具有 潛在致瘤性風(fēng)險的組分。1. 3. 4細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性作為經(jīng)DNA重組技術(shù)獲得的含有特定基因序 列的重組抗體生產(chǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)者 還須具有細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性資料，包括重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn) 定性、目標(biāo)產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及在保存時細(xì)胞

14、生產(chǎn)抗體產(chǎn)品能力的穩(wěn)定 性等資料92質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測方法是抗體藥物質(zhì)量控制的兩個重要技術(shù)支撐點，而性質(zhì)穩(wěn)定均一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是 方法學(xué)建立中必不可少的重 要因素。包括抗體在內(nèi)的生物大分子的結(jié)構(gòu)決定其功能，因此其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也 包括理化對照品及活性標(biāo)準(zhǔn)品。2. 1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均一、穩(wěn)定至關(guān)重要。因此原料需進(jìn)行全面的質(zhì)量分析，甚至在部分關(guān)鍵質(zhì)控項目上Chi nese Journal of New Drugs 2011,20(19的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)高于產(chǎn)品。原料的選擇應(yīng)遵循與供試品相同的原則，其配方研究要 在基于不干擾測定結(jié)果的前提下，盡可能提高穩(wěn)定性。理化對照品在經(jīng)過全面的 分析和鑒

15、定后，主要在常規(guī)質(zhì)控中用于結(jié)構(gòu)和 翻譯后修飾的確證?；钚詷?biāo)準(zhǔn)品則 通過協(xié)作標(biāo)定進(jìn) 行賦值。安瓿分裝凍干后熔封的制備方式因其良好的氣密性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的首選10。標(biāo)準(zhǔn)品的分 裝應(yīng)在潔凈環(huán)境下進(jìn)行，在保持條件一致的前提下，于分裝前、中、后階段以相同時間間隔抽樣進(jìn)行分裝精度控制(< 1 0% ,凍干后還應(yīng)進(jìn)行無菌、水分等檢測,通常標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的殘留水分應(yīng) < 3 0%11，但該指標(biāo)與穩(wěn)定性相關(guān)，因此應(yīng)盡量降低標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分的殘留量抗體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般進(jìn)行冷藏或低溫冷凍保存，其有效期需根據(jù)穩(wěn)定性評價 確定。穩(wěn)定性研究包括熱加速試驗、期間核查及長期穩(wěn)定性試驗。熱加速試驗 是通過在不同溫度條件下

16、加速樣品的化學(xué)降解或物理變化，通過熱動力學(xué)參數(shù)與數(shù)學(xué)模型分析預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在既定儲存溫度下的活性、含量變化。長期試驗則是指在既定的保存 條件下進(jìn)行的實時穩(wěn)定 性監(jiān)測。為反映出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性特征的全貌，應(yīng)設(shè)定多個指標(biāo)進(jìn)行評價，如效價、純度、含量等12。2. 2理化對照品正確的結(jié)構(gòu)是重組抗體發(fā)揮其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。理化對照品不僅是建立抗 體藥物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的前提和基礎(chǔ)，而且還可簡化常規(guī)質(zhì)控方法，無需涉及質(zhì)譜等大型分析儀器，通過 產(chǎn)品與理化對照的比對分 析，即可發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)是否存在異常。理化對照品結(jié) 構(gòu) 的全面鑒定一般包括質(zhì)譜相對分子質(zhì)量測定、末端氨基酸序列測定、液質(zhì)肽圖 或肽指紋圖譜分析、二硫鍵配對方式

17、以及代表翻譯后修飾的糖基化分析等132. 2. 1質(zhì)譜相對分子質(zhì)量測定抗體由4條肽鏈組成，且Fc段具有糖基化修飾,可直接測定完整抗體的相對分子質(zhì)量，也可以用糖苷酶切除糖基后再測定 抗體蛋白部分的相對分子 質(zhì)量，或者以還原劑將二硫鍵打開后分別測定抗體輕、重鏈相對分子質(zhì)量。目前質(zhì)譜相對分子質(zhì)量測定主要采用電噴霧離子化 (electrospray ionization , ESI 及基質(zhì)輔助激光解析離子化 (matrix-assisted la-ser desorption ionization , MALDI等離子源。蛋白離子化后，通過質(zhì)量分析器測定其 質(zhì)荷比計算相對分子質(zhì)量，并與理論相對分子質(zhì)量

18、進(jìn)行比較，以初步驗證抗體結(jié)構(gòu)是否正常。2. 2. 2末端氨基酸序列測定末端氨基酸序列測定也是抗體一級結(jié)構(gòu)鑒定的方式之一。通常N-末端氨基酸測定以Edman降解法最為常用。由于抗體的特殊結(jié)構(gòu),測序時須首先將二硫鍵還原，并以適當(dāng)?shù)姆椒▽⑤p、重鏈分離后再測定。 如果抗體的N-末端存在封閉，則需針對封閉 類型，采用相應(yīng)方法去封閉后再按上 述程序進(jìn)行測定14。常見封閉形式及去封閉方法見表1。表1常見N-末端封閉形式及去封閉方法封閉基團(tuán)修飾殘基去封閉方法 甲?；?甘氨酸、蛋氨酸酸水解,肼解乙?；z氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨 酸酸水解，肼解焦谷氨酰 谷氨酸、谷氨酰胺 焦谷氨肽

19、酶水解目前C-末端氨基酸序列測定可采用酶法或化學(xué)法收集C-末端肽后，再以N-末端測序方法進(jìn)行；也可以直接對收集的C-末 端肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。此外,還可通過質(zhì)譜儀測定被羧肽酶酶解后獲得的C-末端長短不一肽段的相對分子質(zhì)量，并根據(jù)相鄰相對分子質(zhì)量的差值確定 C-末端序列15 16。2. 2. 3液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜分析為了進(jìn)一步鑒定重組抗體的一級結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜分析。液質(zhì)肽圖是將抗體用蛋白酶酶解為肽段后 先經(jīng)色譜分離后再以質(zhì) 譜檢測，通過相對分子質(zhì)量測定結(jié)果與蛋白酶酶解 特性的 綜合分析來確定各肽段的序列17。而將酶解所得肽段直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測則稱為肽質(zhì)量指紋圖譜。液質(zhì)肽

20、圖的優(yōu)勢在于各肽段經(jīng)過液相分離后，在質(zhì)譜相對分子質(zhì)量測定時相互之間的干擾較弱，但耗時較長；而后者則適宜高通量分析。2. 2. 4二硫鍵分析lgG1型抗體中，共有16條二硫鍵，正確配對的 鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵是維持重組 抗體空間結(jié)構(gòu)和發(fā)揮生物學(xué)功能的重要保障。二硫鍵的確定方式可采用液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜法。即在非還原條件下，將重組抗體直接進(jìn)行蛋 白酶酶切，酶切后有些肽 段仍通過二硫鍵連接在一起，通過對這些肽段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定即可驗證抗體的二硫鍵配對方式18。為確?？贵w的完全酶解，必要時可分別采用兩種或以上的蛋白酶進(jìn)行酶切，并通過綜合分析對抗體二硫鍵配對的方式進(jìn)行鑒定。(07 I1B50 “屮幌衛(wèi)w M

21、m】j mmChi nese Journal of New Drugs 2011,20(19185119期2. 2. 5糖基化分析糖鏈在維持抗體正常結(jié)構(gòu)及與其他蛋白的相互作用中均發(fā)揮了重要作用19 20,抗體Fc段的糖鏈改造可顯著改變其生物學(xué)活性21 22。因此在抗體的質(zhì)量控制中，翻譯后糖基化修飾的分析是十分必 要的。目前主要包括寡糖圖譜、糖基化 位點分析及糖鏈結(jié)構(gòu)分析等23寡糖圖譜是對重組抗體藥物中不同修飾形式的寡糖鏈所占比例的分析。即將糖苷酶從抗體上切下的糖鏈衍生、純化后，再以液相色譜分析確定各寡糖 鏈所占 的比例。寡糖多樣性形式的進(jìn)一步分析，可結(jié)合文獻(xiàn)資料并采用相應(yīng)的寡糖參考 品進(jìn)行綜合

22、比對?？贵w的糖基化主要有N-糖與0-糖兩種，位于N-糖還原端的N -乙酰葡糖胺（GIcNAc與抗體中的天冬酰胺（Asn的酰胺氮以B 1,4糖苷鍵相連,且糖基化位點處有特殊的序 列子結(jié)構(gòu)“ As-X- Ser /Thr '其中“ X為除脯氨酸（Pro外的任意氨基酸,只有 該序列子中的Asn才有可能發(fā)生N-糖基化。0 -糖雖無特殊序列子結(jié)構(gòu),但可與抗 體中絲氨酸（Ser或蘇氨酸（Thr的羥基相連24。糖基化位點可通過切除糖鏈 前、后的液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖 譜的方法確定，通過對圖譜中相對分子質(zhì)量的 差異肽段進(jìn)行分析，即可確定糖基化位點。糖鏈結(jié)構(gòu)分析目前有多種方法：可通過測定糖鏈的相對分子質(zhì)

23、量結(jié)合已有的文 獻(xiàn)資料對糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測25;也可通過串聯(lián)質(zhì)譜的方法測定糖鏈結(jié)構(gòu)26;或結(jié)合多種糖苷酶對糖鏈進(jìn)行分步酶切測定單糖的連接方式262. 3生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)品活性測定是抗體質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié) 。生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)品同樣需要遵從 材料均勻、性質(zhì)穩(wěn)定的要求，同時還需要進(jìn)行準(zhǔn)確的賦值。重組抗體質(zhì) 控用活 性標(biāo)準(zhǔn)品的制備、穩(wěn)定性評價同上所述。通常其凍干制備過程中需要添加穩(wěn)定 劑或賦形劑等輔 料，但可通過提高活性成分的分裝量，并在梯度稀釋 進(jìn)行活性測定 刖，以提高預(yù)稀釋倍數(shù)的方式將輔料 對活性測定的干擾降至最低。雖然目前大多 數(shù)抗體生物學(xué)活性測定是通過供試品與活性標(biāo)準(zhǔn)品EC 50值的比較確定

24、的相對活性，即沒有對生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值，但如果在儲存過程中供試品、活 性標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)活性降低的速率和趨勢一致時，以百分含量表示的相對生物學(xué)活性是 無法客觀反應(yīng)樣品有效性的變化的，因此其標(biāo)準(zhǔn)品賦值可借鑒其他生物技術(shù)藥物活性測定標(biāo)準(zhǔn)品的方式，即在確定的實 驗條件下，將其EC 50值對應(yīng)的重量單位定義為一個 生物學(xué)活 性單位，并通過協(xié)作標(biāo)定研究進(jìn)行賦值。協(xié)作標(biāo)定一般至少選擇3家以上實驗室參與，被邀請單位需要具備相關(guān)的實踐 經(jīng)驗，不包括預(yù)試驗在 內(nèi)，每家單位應(yīng)能提供符合要求、不同日期進(jìn)行的至 少3 次獨立試驗結(jié)果。協(xié)作標(biāo)定需按統(tǒng)一的方法進(jìn) 行，方法應(yīng)包括樣品復(fù)溶、稀 釋、樣品排列順序等具體的操

25、作步驟，按統(tǒng)一的方式計算后，借助統(tǒng)計學(xué)方法合并處理結(jié)果并對活性測定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值27。3重組抗體產(chǎn)品的質(zhì)量控制重組抗體產(chǎn)品的質(zhì)量控制根據(jù)相關(guān)法規(guī) 、指導(dǎo)原則的要求及產(chǎn)品自身特性， 其原液檢定主要包括各種理化分析、活性測定、殘留雜質(zhì)分析等，成品除包括 含量與活性測定外，還需要對安全性和注射劑 的常規(guī)項目進(jìn)行質(zhì)控28- 303. 1理化分析3. 1. 1結(jié)構(gòu)確證抗體藥物批檢驗的常規(guī)質(zhì)控中，針對結(jié)構(gòu)的理化分析主要包括N-末端氨基酸序列、肽圖、糖基化分析等測定等，并通過 引入已全面分析的理化對照品進(jìn)行比對，因此在常規(guī)批檢驗質(zhì)控中，將簡化結(jié)構(gòu) 鑒定的工作量。N-末端 氨基酸測定同理化對照品。在肽圖分析中

26、，由于抗體的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊密，導(dǎo) 致蛋白酶酶解的效果不理想，因此在蛋白酶酶解前，一般先采用化學(xué)或物理方法將抗體變性后，再以二硫蘇 糖醇等還原劑打開二硫鍵，并對還原后的游離 巰基進(jìn)行烷基化保護(hù)，按上述相同條 件制備的樣品與理化對照品酶解將更完全，同時后續(xù)的HPLC分離也將獲得較理 想肽圖。為避免糖鏈對肽圖測定的影響，有時還需要在酶解前先將其切除。糖基 化分析根據(jù)抗體藥物自身的理化特性，結(jié)合理化對照品并 通過唾液酸含量、寡糖 圖譜分析等方式進(jìn)行控制，并可依據(jù)供試品唾液酸、各寡糖峰面積與對照品的相 應(yīng)比例進(jìn)行判定。通過N-末端氨基酸序列、肽圖、糖基化分析等測定結(jié)合與理化對照品的比對，可以有效 確保

27、生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定及抗體藥物的批間 致。3. 1. 2純度分析抗體藥物的純度直接反應(yīng)了純化工藝水平及產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣。為避免一種檢測方法在蛋白純度檢 測中的偏差，一般選用至少兩種不同原理的方法進(jìn) 行檢測，以盡可能地分離相關(guān)雜質(zhì)并得到相對準(zhǔn)確的純度結(jié)果。測定抗體純度的常用方法包括 SDS-Chi nese Journal of New Drugs 2011,20(19PAGE法及毛細(xì)管電泳等方法,以及反相、分子排阻和離子交換等高效液相 色譜法。還原型SDS-PAGE電泳是較常用的方法，標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定輕、重鏈條帶 含量之和 95 0%。液相色譜法進(jìn)行純度測定時應(yīng)選擇合適的色譜柱及流動相，避免在分析過程中抗

28、體蛋 白沉淀掛柱；在正式分析之前應(yīng)充分平衡色譜柱并 做空白對照，空白對照中應(yīng)無雜峰出現(xiàn)；按面積歸一化 法計算主峰面積，一般不 應(yīng)低于總面積的95. 0%。3. 1. 3蛋白含量測定蛋白含量測定目前常用的方法主要包括分光光 度法、Lowry法、Bradford 法、BCA法、凱氏定氮法等。除凱氏定氮法以外，其余方法的原理均與蛋白結(jié) 構(gòu)和氨基酸組成相關(guān)，并且所需含量測定對照品要和 供試品一致31。目前絕大多數(shù)重組抗體的含量測定采用的是分光光度法。其消光系數(shù)是根據(jù)Edel-hoch研究建立的色氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸模型化 合物在6mol - 1鹽酸胍條件下，可被用于同等變性 條件下對其他非折疊蛋白

29、消光系數(shù)進(jìn)行估算的原理所確定。結(jié)合該變性消光系數(shù)，再通過與不同濃度天然蛋白、變性蛋白吸光值的校正計算即可獲得該目標(biāo)蛋白的消光系數(shù)32，但該消光系數(shù)是通過模型 化合物以及與變性蛋白的比對分析估算獲得。目前國外生物技術(shù)產(chǎn)品含量測定中，已多采用與供試品 具有相同結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn) 行含量測定，但均無公 開的含量溯源資料。凱氏定氮通過含氮量分析進(jìn)行 蛋白含 量測定，反應(yīng)中消耗的標(biāo)準(zhǔn)酸滴定液可溯源至恒重?zé)o水碳酸鈉的重量33,因此無需其他蛋白標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)，可作為含量標(biāo)準(zhǔn)品溯源的方法，同時氨基酸 組成分析也是可供選擇的手段之一 。3. 1. 4其他理化特性分析此類質(zhì)控主要包括相對分子質(zhì)量和等電點等指標(biāo)。相對分子

30、質(zhì)量也主要采用還原型 SDS-PAGE電泳的方法,標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定 為理論相對分子質(zhì)量？ 10%以內(nèi)，并通過與理化對照的遷移率進(jìn)行校正。等電聚焦電泳是重組抗體等電點測定的常用方法 ，其pH梯度主要由兩性電解質(zhì)建 立。由于溶媒中存在的鹽會 破壞pH梯度，因此可采用透析、超濾、過柱等方 法進(jìn)行脫鹽。測定重組抗體的等電點時，由于其糖基化的 不均一使抗體所帶電荷 不同，測定結(jié)果中會出現(xiàn)多個 電泳條帶，因此重組抗體的等電點測定結(jié)果通常為一 個pH范圍，并且應(yīng)與已全面分析的理化對照品一致 。3. 2生物學(xué)活性生物學(xué)活性測定是確保重組抗體有效性的重要質(zhì)控指標(biāo)?？贵w與其特異的靶點結(jié)合后通過細(xì)胞因子信號的阻斷、補體

31、系統(tǒng)的活化、耦聯(lián)毒素殺傷等生物學(xué)作用 發(fā)揮重組抗體的治療功效，其生物學(xué)活性測定主要是在體外建立相應(yīng)的細(xì)胞評價模 型，模擬其作用機制產(chǎn)生客觀的全程量效反應(yīng)，并通過與活性標(biāo)準(zhǔn)品的比較對其生物學(xué)活性進(jìn)行評價。根據(jù)其作用機制主要分為補體依賴的細(xì)胞毒法、細(xì)胞/生長因子信號通路阻斷后產(chǎn)生的殺傷活性中和 或細(xì)胞增殖抑制法、報告基因測定等方法。如無法建立特 異的細(xì)胞學(xué)量效反應(yīng) 模型，也可以測定重組抗體與 其作用靶點的結(jié)合能力作為其功能性的評價指標(biāo)，主要測定方法包括ELISA法、流式細(xì)胞儀法和基于 表面等離子共振技術(shù) (surface plasm on res onance , SP的 生物分子相互作用分析法

32、(biomolecular interaction analysis , BIA 等。3. 2. 1重組抗體的生物學(xué)活性測定3. 2. 1. 1 補體依賴的細(xì)胞毒(complement depend-ent cytotoxicity ,CDC法重組抗CD20單抗的活性測定即采用該方法。將重組抗體進(jìn)行系列 稀釋后與 表達(dá)CD20的效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，重組抗體與細(xì)胞表面 抗原形成抗原抗體復(fù) 合物的過程中，使抗體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并暴露Fc段的補體結(jié)合位點；通過與補 體的孵育及其級聯(lián)激活，完成攻膜復(fù)合物的裝配并 在細(xì)胞表面打孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞 溶解。細(xì)胞染色后，以抗體濃度對吸光度作圖，并以4參數(shù)方程擬合曲 線

33、可得到 全程反應(yīng)的 反S形”曲線,通過供試品與 活性標(biāo)準(zhǔn)品EC 50值的比較即可對重組 抗體的相對活性進(jìn)行計算和評價。3. 2. 1. 2信號通路阻斷法細(xì)胞因子等激動劑需要與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合、激活相應(yīng)的信號通路后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。以此類細(xì)胞/生長因子或其受體為靶點的重組抗體 的生物學(xué)活性可基于這一特點建立相應(yīng)的生物學(xué)活性測定方法，主要包括殺傷中 和活性或特異的細(xì)胞增殖抑制活性等 。以抗腫瘤壞死因子-a (TNF a單抗為例，該重組單抗能特異識別結(jié)合TNF- a并 通過阻斷TNF- a與受體結(jié)合而拮抗TNF- a的細(xì)胞毒性，使其免受TNF- a誘導(dǎo)的凋 亡。該抗體活性測定采用對TNF- a

34、殺傷敏感的細(xì)胞系，將抗體做系列稀釋后與TNF- a共孵育，使抗體與TNF- a結(jié) 合。待孵育結(jié)束后加入 對TNF- a殺傷敏感的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，未被中和的TNF- a將 與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并誘導(dǎo)凋亡。通過對存活細(xì)胞的染色、測定其吸光度值，將抗體濃度與(07 11852 *中國駅藥麻上Mill祁訛加 卷釧 細(xì)Chinese Journal of New Drugs 2011, 20 ( 19 )存活細(xì)胞 的 量效關(guān) 系進(jìn)行4參數(shù)擬合后，計算其EC50 ,并與標(biāo)準(zhǔn)品比較后即可評價抗體的相對活性 。 而表皮生長因子受體 (EGFR )單抗的生物學(xué)活性測定則是采用細(xì)胞增殖抑制方 式，即通過特異結(jié)合并

35、有效抑制腫瘤細(xì)胞生長， 并封閉表皮生長因子受體， 通 過供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋獲得增殖抑制的量效曲線，并計算重組抗體的生物學(xué)活性。3. 2. 1. 3報告基因法也是通過重組 抗體與相應(yīng)靶點結(jié)合后， 測定信 號通路變化效應(yīng)的活性評價方式。一般在細(xì)胞株難于獲得，以及殺傷中和或增殖抑制法產(chǎn)生量效曲線的信噪比不理想 時，可基于對該通路的現(xiàn)有了解，將攜帶抗體作用靶點反應(yīng)元件與報告基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過重組抗體與相應(yīng)靶 點的作用，啟動報告基因的表 達(dá)來檢測重組抗體的生物學(xué)活性。如在VEGF單抗 將攜帶VEGF受體和螢光素酶報告 的活性測定中，基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞， 篩選后得到穩(wěn)定攜帶上述質(zhì)

36、粒的細(xì)胞。當(dāng)VEGF與該重組細(xì)胞膜上的受體結(jié)合 后，可通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)與相應(yīng)信號通路的作用，活化螢光素酶報告基因的 表達(dá)。將系列梯度稀釋的供試品與標(biāo)準(zhǔn)品與一定濃度的 VEGF孵育后，與該重 組細(xì)胞共培養(yǎng)即可獲得VEGF單抗的1陣抗也采用了攜帶類似報告 活性量效曲 線。IL基因的細(xì)胞株進(jìn)行活性測定。3 . 2 . 2重組抗體的結(jié)合活性測定3. 2. 2. 1競爭ELISA是最常用的重組抗體結(jié)合活性測定方法。首先將制備的 可溶性抗原 包被后，將系列梯度稀釋的供試品、 標(biāo)準(zhǔn)品與一定濃，度的酶標(biāo)抗 體競爭結(jié)合包被抗原將抗體濃度與吸光值的量效關(guān)系進(jìn)行4參數(shù)擬合后，計算供 試品、標(biāo)準(zhǔn)品的EC50值評價

37、重組抗體的結(jié)合活性。3. 2. 2. 2流式細(xì)胞儀法 該方法原理與競爭ELISA相同，只是以帶有特異結(jié)合位點或膜表面標(biāo) ELISA法 報告基因法待測抗體通過微液流片可固化可溶性的抗原和細(xì)胞，系統(tǒng)流經(jīng)芯片 時，一旦與固化抗原結(jié)合， 芯片表面的蛋 白濃度就會增加，進(jìn)而引起芯片表面液 體折射率的變 化而被檢測到。BIA技術(shù)的優(yōu)勢還在于能實時動態(tài)監(jiān) 并測定親和常 數(shù)等反應(yīng)參數(shù)。測抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，3. 3殘留雜質(zhì)重組抗體一般由哺乳動 物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)，因此需要對制品中來自表達(dá)體系及純化過程中可能存在的外源組分進(jìn)行限量控制。 根據(jù)其生產(chǎn)工藝，相關(guān)雜質(zhì)的限量控制主要包括殘余 DNA、殘余宿主細(xì)胞 蛋白、殘

38、留蛋白A等。其中針對宿主細(xì)胞蛋白、 蛋白A（親和純化柱的配基）的殘留限量檢測主要采 用夾心ELISA的方法。傳代細(xì)胞 系的DNA理論上具有致瘤性的潛在 FDA將生物制品可以允許的殘余 DNA限度 風(fēng)險，30 我國也規(guī)定須用敏 規(guī)定為每劑量不超過100 pg,感的方法測定來 源于宿主細(xì)胞（包括轉(zhuǎn)化的哺乳動其限量規(guī)定為每物傳代細(xì)胞）的殘余DNA含 量，劑量小于100 pg。目前殘余DNA的檢測方法主要 37 40 。雜交包 括雜交、熒光染色、定量PCR等方法法主要采用地高辛等非放射性材料標(biāo)記核 酸探針，無36 需特殊儀器設(shè)備，但在實際工作中通常需要對供試品及DNA 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白酶消化等同步處理，會

39、造成檢 測靈敏度的降低。熒光染料法采用PicoGreen等可特41 以熒光酶異與雙鏈DNA形成復(fù)合物的熒光染料，標(biāo)儀 檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與供試品的熒光強度，計算DNA殘留量。該方法簡便快捷，但由于抗體藥物殘 余DNA質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)較高和檢測限的原因，熒光染色法DNA通常不適用于抗體藥物的 殘量控制。3. 4重組抗體藥物的成品質(zhì)控 重組抗體藥 物的成品除含量、生物學(xué)活性及必 要的理化特性檢測外， 還應(yīng)該按照注射劑的要 求，進(jìn)包括鑒別試驗、外觀、可見行其他常規(guī)項目的檢測，pH值、異物、裝 量、水分、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢 查、異常毒性檢查等，具體測定方法參見 現(xiàn)行中華 及其他相關(guān)技術(shù)文件。 人民共和國藥

40、典4重組抗體藥物未來需要開展的工作我國重組抗體藥物的質(zhì)量控制技術(shù)隨著抗體藥物研發(fā)的深入也在不斷的發(fā)展和完善。未來抗體藥物質(zhì)控仍需進(jìn)一步關(guān)注以下幾個主要方面。4. 1生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量控制目前現(xiàn)行版藥典關(guān)于細(xì)胞庫管理和檢定要求，經(jīng)多年的實踐證明可以保障重組抗體等生物技術(shù)藥 1853中國新藥雜志2011年第20卷第19期記分 子的細(xì)胞替代了包被的可溶性抗原或受體，通過流式細(xì)胞儀測定陽性細(xì)胞率來檢 測競爭結(jié)合的效 對難于獲 果。該方法避免了相應(yīng)抗原的制備過程，得可溶性抗原的重組抗體可采用該方法進(jìn)行結(jié)合活性測定，同時細(xì)胞表面抗原的空間結(jié)構(gòu)近乎 于天然存在形式，其測定結(jié)果應(yīng)更加客觀。3. 2. 2. 3 B

41、IA法34 35基 于SPR的BIA法測定周期短、待測樣品消耗量少，該方法在測定抗原抗體結(jié) 合 活性時無需標(biāo)記，避免了標(biāo)記對分子結(jié)構(gòu)的影響，可更加真實地反映抗原抗體的 結(jié)合情況。其檢測芯Chinese Journal of New Drugs 2011， 20 ( 19 )物生產(chǎn)細(xì)胞株的總體質(zhì)量，但作為逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測常用方法的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測仍有待進(jìn)一步完善，即需建立 均一、穩(wěn)定的RNA模板和逆轉(zhuǎn)錄酶活性標(biāo)準(zhǔn) 品，并采用諸如定量PCR等方法進(jìn) 行酶活性定量。4. 2重組抗體結(jié)構(gòu)分析質(zhì)譜儀、毛細(xì)管電泳儀、新型高效液相 系統(tǒng)等新其專屬性、檢測限、回收率法。如采用商用試劑盒， 等參數(shù)需經(jīng)驗證 通過后方

42、可使用。由于重組抗體藥物劑量大， 雜交法、熒光染色法 待檢樣品中 核酸雖然可以通過增加標(biāo)準(zhǔn)品回收率、富集等前處理步驟， 對制品中的核酸殘量進(jìn)行控制，但由于方法的局限性仍需進(jìn)一步完善。而定量PCR方法在特 異性、靈敏度、準(zhǔn)確性方面具有獨特 的優(yōu)勢，可比較客觀地對殘余DNA定量， 并且反映片段的相對分子質(zhì)量分布。但該方法仍需要對引物設(shè)計、標(biāo)準(zhǔn)品等做進(jìn)一步的優(yōu)化與規(guī)范。同時殘余DNA的檢測也需要結(jié)合工藝驗證來綜合控制 。5 結(jié)語如何更加科學(xué)有效地對重組抗體藥物的質(zhì)量進(jìn) 還需要結(jié)合臨床評價及上市后 的安全性監(jiān) 行控制，測，進(jìn)一步對質(zhì)控方法學(xué)、 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展深入研 究。 本文對國內(nèi)外有關(guān)重組抗體藥物

43、的質(zhì)量控制研旨在拋磚引玉，究進(jìn)展和亟待解決的問題進(jìn)行綜述，引發(fā)大家對相關(guān)問題的關(guān)注和討論。志謝：感謝中國食品藥品 檢定研究院重組技術(shù)產(chǎn)品室饒 春明研究員對于本文提供的相關(guān)資料及修改意見。參考文獻(xiàn)型儀器的應(yīng)用，可有效提升抗體質(zhì)控中結(jié)構(gòu)分析的 水平。例如國外研發(fā)單位在重組抗體理化對照品充 分研究、鑒定的基礎(chǔ)上，已在重組抗體肽圖 的質(zhì)控中，將質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)從對翻譯后修肽段的定性分析提高為定量檢測，而由于各 種條件的制約，目前我國重組 抗體藥物質(zhì)控理化對照品的研究還不夠詳盡，并且質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中肽圖分析結(jié)果僅要求與對照品一致。同時重組抗體翻譯后修飾的糖鏈 十分復(fù)雜、并且其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能相關(guān)，因此糖基化分析十分具

44、有挑 因此也是 抗體質(zhì)量控制的重點和難點。目前戰(zhàn)性，雖然可以采用質(zhì)譜等分析手段對唾液酸、寡糖圖譜 并反映一定的糖基化信息，和糖基化位點進(jìn)行分析，但目前沒有一種簡便易行的方法，能快速地對糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的分析和鑒定。4. 3重組 抗體生物學(xué)活性檢測抗體活性檢測方法因其功能各異而具有多樣性，通常于體外 采用細(xì)胞評價模型模擬其作用機制 產(chǎn)生量效反應(yīng)進(jìn)行，但在實際工作中，有些活性檢測步驟繁瑣、影響因素多，重復(fù)性不理想，并周期較長，且有些重組抗體 藥物無法找到合適的細(xì)胞株進(jìn)行活性測定，進(jìn)而采用抗體結(jié)合活性作為其功能性 評價指標(biāo)。針對上述有待進(jìn)一步完善的環(huán)節(jié)，可基于對，胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的了解構(gòu)建相應(yīng)的轉(zhuǎn)

45、基因細(xì)胞，以期建立更加準(zhǔn)確、 耐用和便捷的活性測定方法。另一方面，目前抗體生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)主要是以 相對于標(biāo)準(zhǔn)品活性的百分含量體 現(xiàn)的，即是一個相如能夠借鑒其他生物學(xué)技術(shù)藥對生物學(xué)活性結(jié)果，物質(zhì)控經(jīng) 驗，對重組抗體藥物的生物學(xué)活性單位進(jìn)行科學(xué)的賦值和定義，并加強標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的研 將可以更加客觀有效地評價重組抗體產(chǎn)品的有究，效性，同時也便于類似抗體產(chǎn)品之間的比對研究。4. 4重組抗體殘留雜質(zhì)分析 在重組抗體質(zhì)控 中，需要對宿主細(xì)胞蛋白、蛋白1 RATHORE AS，MHATRE R . Quality bydesign for biopharmaprinciples and case stu

46、die$ M . John Wiley & Sons, ceuticals, 2009 : 1. 2國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心.重組制品生產(chǎn)用哺乳EB / OL . 2006 10.動物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則http： / / www . cde. org. cn / zdyz. do? method = largePag&id =59. 3 Derivati on and characterizati on of cell substrates used for product ion ofbiotechnological / biological produc

47、ts EB / OL . 1997 . http： / /www . ich. org / fileadmin / Public_Web_Site / ICH_ 07 16 Products / Guideli nes / Quality / Q5D / Step4 / Q5D_Guideli ne. pdf. 4 Food and DrugAdmi nistratio n Cen ter for Biologics Evaluati on and Research Bethesda Poi nts to consider in the characterization of USA 1987

48、. cell lines used to produce biologicalsS. MD , 5國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)S . 2010年2010 : 15.版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，6國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)S. 2010年2010 : 16 17.版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，7張巖銳，C28細(xì)胞染色體鑒定段麗娟，茍凝虹，等.重組CHOJ.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2006 , 34(4 ) : 40 43.方法的研究8國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中 心.生物組織提取制品 和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評價技術(shù)審評一般原則EB / OL . 2005

49、12 . http: / / www. cde. org. cn / zdyz. do?method = largePagek id = 53. 9國家藥典委員會.中華人民共和國藥典( 三部)S . 2010年2010 : 19.版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，10周海鈞.藥品生物檢定M .北京：人民衛(wèi)生出版社，2005 : 163 172. A 殘留進(jìn)行限量控制。雖然抗體生產(chǎn)中主要采用CHO細(xì)胞和蛋白A，但各單位細(xì) 胞株、生產(chǎn)工藝均 非一致，因此研發(fā)單位應(yīng)根據(jù)各自的生產(chǎn)工藝制備抗體，并建立相應(yīng)檢測方 相應(yīng)的殘量控制對照品、1854中國新藥雜志2011年第20卷第19 期Chinese Jour

50、nal of New Drugs 2011， 20 ( 19 ) 11王軍志. 生物技術(shù)藥 物研究開發(fā)和質(zhì)量控制M .第2版.2007 :138 140.北京：科學(xué)出版社, 12 Quality of biotech no logical products： stability test ing of biotech no logical / biological products EB / OL. 1995 11 30. http： / /www . ich. org / fileadmin / Public_Web_Site / ICH_Products / Guidelines / Qu

51、ality / Q5C / Step4 / Q5C_Guideli ne pdf. 13陶磊，饒春明，高凱，等.重組嵌合抗CD20 IgG1型單克隆抗J.藥學(xué)學(xué)報，2010，45 ( 6 ) : 752 755.體的結(jié)構(gòu)驗證14 HIRANO H， KOMATSU S， KAJIWARA H， et al. Microseque nee an alysis of the Nterm in ally blocked prote ins immobilized on polJ. Electroyvinylidene difluoride membrane by western blotting p

52、horesis, 1993， 14 ( 9 ) : 839 846. 15 HAMBERG A， KEMPKA M，SJ DAHL J, et al. Cterm in al ladder seque ncing of peptides using an alter nativenucleophile in carboxypeptidase Y digests J . Anal Biochem, 2006 , 357(2 ) : 167 172.16 PATTERSON DH , TARR GE , REGNIER FE, etal. Cterm in al ladder seque ncin

53、g via matrixassisted laser desorpti on mass spectrometry coupled with carboxypeptidase Y timedependent and Anal Chem, 1995 , 67 concentrationdependent digestionsJ ( 21 ) : 3971 3978. 17 REHDERDS, DILLON TM , PIPES GD, et al. Reversedphase liquid chromatography / mass spectrometry an alysis of reduce

54、d monoclonal an tibodies in pharmaceutics. J Chromatogr A, 2006 , 1102 ( 1 2 ): 164 175. 18 饒春明，陶磊，史新昌，等.重組人干擾素a 11質(zhì)量肽圖分析2007 , 27 ( 10 ) : 1505 及 二硫鍵定位J.藥物分析 雜志，1510. 19 JONES AJ, PAPAC DI ,CHIN EH , et al. Selective clearanee of glycoforms of a complex glycoprotein pharmaceutical caused by term in

55、al Nacetylglucosam ine is similar in huma ns and cyno mol. Glycobiology , 2007 , 17 ( 5 ): 529 540. gus mon keys J20 NIMMERJAHN F , ANTHONY RM , RAVETCH JV . Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity J . Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104 ( 20) : 8433 8437. 2

56、1 DAVIES J , JIANG L ,PAN LZ , et al. Expression of GnTIII in a recombinant antiCD20 CHO production cell li ne: Expressi on of an tibodies with altered glycoforms leads to an in crease in ADCC through higher affinity for FC gamma RIII J . Biotechnol Bio2001 , 74(4 ) : 288 294. eng, 22 SHINKAWA T , NAKAMURA K ,YAMANE N , et al. The absenee of fucose but not the presenee of galactose or bisect ing Nacetylglucosam ine of huma n lgG1 complextype oligosaccharides shows the critical role of enhancing an tibodydepe ndent cellular cytotoxicity J. J Biol Chem, 2003 ,