血清尿素測定參考方法

1、WS/T 3452011ICS 11.020C 50wsI中華人民共和衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 3452011血清尿素測定參考方法Reference procedure of the measurement of urea in serum2011-09-30 發(fā)布2012-04-01 實(shí)施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布目 次前言ID1范圍12規(guī)范性引用文件13術(shù)語和縮略語14測定原理35測定樣品36測定試劑36.1警示與安全注意事項 36.2試劑原料36.3試劑性能要求 36.4試劑制備46.5標(biāo)準(zhǔn)液的制備67測定條件77.1儀器77.2最終反應(yīng)混合液的濃度107.3 血清尿索盹定條件117.4校準(zhǔn)的

2、擴(kuò)展不確定度118測定118.1無蛋白濾液的制備11& 2試劑準(zhǔn)備12&3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作128.4測定方法128.5測定范圍138.6謀差的來源13& 7測定樣品要求139結(jié)果計算139.1計算實(shí)際吸光度值139.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作139.3樣品測定結(jié)果的計真149.4單位換算14附錄A （規(guī)范性附錄）L谷氨酸脫氫酶催化活性濃度測定15附錄B«范性附錄）麻酶催化活性濃度測定 18WS/T 3452011本標(biāo)準(zhǔn)修改采用由國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(JCTLM)批準(zhǔn)的CDC入血清尿累參考方法(分 光光度法”,并參考ISO 15193:2009(體外診斷器具生物源樣品中

3、最的測定參考測定程序的表述 適當(dāng)增加內(nèi)容.本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給岀的規(guī)則起章本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會提出.本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心.本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人，楊振華、陳寶榮、邵燕、陳琦、孫慧穎胡濱。WS/T 3452011血清尿素測定參考方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，測定血清尿素濃度的參考方法.本標(biāo)準(zhǔn)主要適用于參考實(shí)驗(yàn)室作為血清尿素測定的溯源，也可作為與血清尿素檢驗(yàn)有關(guān)的儀貉和 試劑生產(chǎn)企業(yè)的潮源，可供有關(guān)認(rèn)可單位及質(zhì)量管理部門應(yīng)用.2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本 文件.凡是不注日期的

4、引用文件其最新版本（包括所有的修改單適用于本文件。ISO 15193-2:2009體外診斷器具生物源樣本中量的測定參考方法的表述3術(shù)語和縮略語3.1術(shù)語下列術(shù)語和定義適用于本文件。3. 1. 1原始樣本 primary sample最初從一個系統(tǒng)中取出的一個或幾個部分的集合物，旨在提供該系統(tǒng)的信息或作為對該系統(tǒng)做岀 決定的基礎(chǔ)注：在某些情況下所提供的信息可以適用于一個較大的系統(tǒng)或一組系統(tǒng)此時取樣系統(tǒng)是這些聚統(tǒng)的組成部分. 3. 1.2實(shí)驗(yàn)室樣本 laboratory sample準(zhǔn)備送到實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)室接收的用于測定的原始樣本或原始樣本的分樣本.3. 1.3分析樣本 analytical sam

5、ple自實(shí)驗(yàn)室樣本制備的、可從中僉由分析部分的樣本。注：在取岀分析祁分之前，分析樣本可經(jīng)過各種處理3. 1.4分析部分 analytical portion從分析樣本中取岀的用于實(shí)際測定和觀察的物質(zhì)部分.注：如果不需E（處理，分析部分直接從原始樣本或?qū)嶒?yàn)室樣本中取出某些情況下，希將分析部分溶解成分析溶液 再上機(jī)甜定.3. 1.5分析溶液 analytical solution將分析部分溶解在氣體、液體或固體中而制備的溶液，溶解過程中可以有反應(yīng)發(fā)生或無反應(yīng)發(fā)生。 3. 1.6（某一物質(zhì)系統(tǒng)的）基質(zhì) matrix （of a material system）一個物質(zhì)系統(tǒng)中除被分析物之外的所有成分W

6、S/T 34520T13. 1.7參考方法 reference procedure在校準(zhǔn)或表征標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時為提供測定結(jié)果所采用的測定方法，適用于評定由同類童的其他測定方 法獲得的彼測定董值的測定正確度。3. 1.8測定系統(tǒng)的靈敏度 sensitivity of a measuring system簡稱靈敏度(sensitivity)測定系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)的披測定值變化所得的商.注h測定系統(tǒng)的靈敏度可能與被測定的it值有關(guān)注2：所考慮的被測定值的變化必須大于罔定系貌的分辨力.3. 1.9分析特異性 analytical specificity測定方法只測定可測定的最的能力.3. 1. 10分析

7、干擾 analytical interference由一個影響輦引起的系統(tǒng)測定謀差，該彩坊量自身在測定系統(tǒng)中不產(chǎn)生信號，但它會引起示值的增 高或降低.3. L11影施:& influence quantity被測定以外的可影響測定結(jié)果的誥.3.1.12擬測定的量。注1:對被測定的說明要求了解量的種類以及含有該址的現(xiàn)象、物體或物質(zhì)狀態(tài)的描述包括有關(guān)成分及所涉及的 化學(xué)實(shí)體.注2,在VIM第二版和IEC 60050300:2001中彼曲定定義為受到渕定的注3：測定包括測定系統(tǒng)和實(shí)施測定的條件它可能會改變研究中的現(xiàn)象.物體或物質(zhì)，使被測定的量可能不同于定 義的被澳定.在這種情況適當(dāng)?shù)男拚潜?/p>

8、要的。3. 1. 13檢出限 detection limit,limit of detection由給定測定方法獲得的測得值，其聲稱的物質(zhì)成分不存在的誤判概率為d,聲稱物質(zhì)成分存在的誤 判概率為5注1：國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)推薦a和0的默認(rèn)值為0.05.注2：有時使用第寫詞LOD.注3：不要用術(shù)語靈敏度”表示"檢岀限J3. 1. 14 校準(zhǔn)品 calibrator用于校準(zhǔn)的測定標(biāo)準(zhǔn).3.2縮略語下列縮略語適用于本文件.GLDH: L谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)NADH：還原型 A煙酰胺腺嗥吟二核昔酸(|3-nicotinamide-a

9、denine-dinucleotide,reduced form)IFCC：國際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(international federation of clinical chemistry and laboratory medicine)5SOP：標(biāo)椎操作方法(Stmntiard Operation Eroecdurc), 4謂定原理尿索在隰酶催化下T水解生成氮和CO"亂在w酮戊二戢和胚原性輔酶存在下.腔睿熬醴脫氫酶繼化生成谷氨酸，同時還原性輔酶i被氧優(yōu)成氧化型輔酶I 反應(yīng)式如下1尿素+ HO吧NHJgOff-(NHJJC0J-2NHJ + C0iGLDHMH+a 駅戊二駿

10、+ NADH + fT 卷盤醸 + N啟D'+HO在還原性輔酶I轉(zhuǎn)牝成氧化型輔酶I同時伴有340 nm處吸光度的下降吸光度下降的桂度與樣本中尿索含世成正比，酒定反應(yīng)30 min后,nm St吸光度變優(yōu)即可測定樣本中尿素含童.5測宦樣品標(biāo)準(zhǔn)物壓、校準(zhǔn)品*質(zhì)控品、血諸°6測定試劑6. 1 示與安全注意事項6. 1. 1氫筑化極；奇婁類物質(zhì)，吸人及接觸可引起中毒表現(xiàn)為惡心、臥吐、職循、腹洋，.脈緩、進(jìn)行住肌 麻痹、心律紊亂、血鉀明顯降低等.接融髙溫度溶灌可造成皮膚灼舫毒.稱朵及配制試劑時應(yīng)進(jìn)行有效 阱護(hù)帶防護(hù)跟鍍、橡膠手套，穿隔離軽'6, 1.2碩酸鋅：對眼睛有中度剌激性，

11、對皮膚無剌激性，謀服可引起急性胃腸炎，嚴(yán)重可引起林克至死 亡”稱量及配制試劑時癥進(jìn)行有效防護(hù)，帶防護(hù)眼擁、橡膠手套穿隔離脈.6.2試劑用料本方洙使用F列試剤.6.2.1氣雙(4-輕基苯基卜LGHA異苯并相對分子質(zhì)ft-318,33.6.2.2毓酸(ZnSOt7已0人相對分子質(zhì)ft即5靈6. 2.3氫霍化鎖BMOHh * &HIOL相對分子質(zhì)最=31乩46.6, 2.4苔靈矇脫氫酶(glmam血dehydrog陽陰“GLDH),來源于牛肝臟，要求高純度.6. 2,5 2”氨基瞥輕基-1,3 丙二醉(TripHClHN區(qū)CXCHOHh * HCDt 相對分子質(zhì)4 = 157.60.6, 2

12、-6三寰甲基氨基甲烷(Tris-Base)rNH.CCCHzOH),t相對分子質(zhì)S-12L14.鼠工7 ®<Ur«St),來源于川豆,晝求高城度.6. 2,8 r酮戊二醸fNaOCXXHKHUXXXJN#2H：Oh相對井子質(zhì)卷，相對分子質(zhì)量= 226,096.2.9 還原型A煙疏胺腺環(huán)吟二核昔酸二鈉鹽(NADHXQlH即N，N出0“比工H,O),相對分子曉 M-709.40.6.2,10乙二胺四乙醸二抽鹽2H2O)T相對分子質(zhì)量=3允丄4.6.Z11附二磷酸腺噪吟單鉀鹽(ADPHG°H“KI*Om匕2已0人相對分于質(zhì)fi = 50L32 6.3試刑性能裏求6

13、. 3.1宜使用最高純度的試劑.6. 3.2 GLDH：試劑純度'70%,每毫克蛋白酶含fi20單位。6. 3. 3 Urease：試劑含就每克固體酶含址為（15 00050 000）單位.6. 3.4牛血清白蛋白五級，相對分子質(zhì)1 = 68000.6.4試劑制備6. 4. 1試劑原料含試劑的原料純度應(yīng)為100%,如果試劑原料含fit小于100%例如，（）,按公式（1）計算實(shí)際W*. N 咒監(jiān)（1）式中：W實(shí)耳實(shí)際稱量；W毗理論稱量,y 試劑原料純度，注每次衣ft過程中的擴(kuò)展不確定度（* = 2）（包括物質(zhì)純度的不確定度）應(yīng)Vl5%.稱蛀時顯示的值與靶值的差異 不應(yīng)）6過05%6. 4

14、.2試劑制備用水6.4.2. 1 純水宜使盡高純廈的水（導(dǎo)電性2 PS - cnT',pHA7,硅酸鹽C. 1 mg：）制備試齊J.6. 4.2.2 無 CO2 水試劑水在敞口的容器中煮沸15 min,密閉冷卻至使用前。64.2.3無氨水試劑水在敞口的容器中煮沸15 min,密閉冷卻至使用前.6. 4.3血清尿素試劑6. 4. 3. 1 0.5%酚耿指示劑準(zhǔn)確稱取0.125 g酚駄，放入燒杯內(nèi)，用20 mL 95%乙醉溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶內(nèi)，用95%乙 醇補(bǔ)足至刻度線.密閉玻璃瓶28保存.穩(wěn)定1個月.6. 4. 3. 2 22g- L-' 的 ZnSQ 溶液準(zhǔn)確稱取22

15、 g ZnSO7H：O,放入燒杯內(nèi)，用800 mL熱的無CO：水（水溫大于50 9）溶解后轉(zhuǎn)移 至1 000 mL容量孫內(nèi)，用無CO?水補(bǔ)足至刻度線.密閉玻璃瓶室溫保存。稔定1個月.64.33飽和Ba（OH）2溶液準(zhǔn)確稱取80 g Ba（OH）, 8HZO,放人燒杯內(nèi)用800 mL熱的無CO,水（水溫大于50 9溶解后 轉(zhuǎn)移至1 000 mL容敵瓶內(nèi)，用無CO?水補(bǔ)足至刻度線.需至少24 h后使用采用帶有祓石灰帽的玻 璃瓶密閉室溫保存，祓石灰帽中的饋石灰每兩夭更換1次稅定1個月.6434 0.11 mol L" Ba（OH）2 溶液6. 4. 3.4. 1用無CO,水稀釋245 mL

16、飽和Ba（OH）,溶液f1 000 mL.密閉玻璃瓶室溫保存，穩(wěn)定1 d.WS/T 345-Z0116, < 3. 4. 2 0,11 mol L-'BaCOH 溶潘的檢査方怯用中和漓定法檢査諫溶穢的摩爾誡度* 在渭請干燥的燒杯中準(zhǔn)確加人10 mL的ZnSO.需裁；在燒杯中如人2滴0. 5%的酚軌瘩液作為指示劑j準(zhǔn)確吸取10 mL 0.11 mol * L Ba(OH)3帶槪進(jìn)行滴定，至潢粉色為終點(diǎn)i結(jié)果判斷:如果消耗tbo!LBaCOHh溶液在10 mL±0.1 mL范圈內(nèi).說明配制的溶液符 合要求匚如果趨耗。.口 molL"1 BatOH)；帶液>1

17、工1 mL或V9, 9 mL,說明0. 11 mol - L-1 BaOHh溶液當(dāng)屋謹(jǐn)度過髙或過低，應(yīng)按公式佗計算補(bǔ)償量：亠料X V吟丿擊鼻黑 2*“*.£ )式中Jr祓度單位為摩爾毎升5川 L")*V休積單位為髦升(mL).6. 4. 3.5105 nunol 的 Tris-HCl準(zhǔn)確稱眾L654 8 g Trts-HCl,放人燒杯內(nèi)，用SO mL無氨水洛解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶內(nèi)，用無 氨水補(bǔ)足至刻度線.便用電于天平、清沽干燥的燒杯、容輦瓶及稱董杯配制.密閉試?Pifea r-sr保 存.穗定2周.氐 4h 3, 6105 mmol * L_1 Tris-Bas準(zhǔn)確

18、稱取L 272 0 g TriBase人燒杯內(nèi).用SO mL試劑水幫解后轉(zhuǎn)移至100 mL容駐瓶內(nèi)用試 刑水補(bǔ)足至刻度皺.密閉試劑瓶裸存n穩(wěn)定戈周.6.4. 3. 7 溶范 2CpH7.筋 105 mmol < L" TriHCl 集沖液)ICO tnL的105 mmol L'1 Tris-HCl倒人燒杯內(nèi)，用105 mmolf1 TEa瑪共凋節(jié)pH值至九呂 密閉試刑瓶2匸咅弋保存.穩(wěn)定2周+6. 4.3. 8310 mmol * L"的 TriHCl準(zhǔn)確稱取3. 309 6 g Tus-HCh放入燒杯內(nèi)，用80 mL無氮水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶內(nèi)用無

19、 甄水補(bǔ)足至剽度統(tǒng).密閉試?yán)跨C亡保存.穩(wěn)定2周"6. 4. 3.9 2T0 mmol LJ1 Tris-Base準(zhǔn)確稱取3” 309 g 白卜氐放入燒杯內(nèi),80 mb無氨本溶解百轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶內(nèi)，用無 氨水補(bǔ)足至剽度線*嘗閉試劑瓶31C肆存.穩(wěn)定2周.6. 4, 3. 10 pH7.8,210 mmol ' L-1 Tris-HCl 3(沖潦100 mL 的 105 mmol L" TriHCl 倒入燒杯內(nèi)*用 105 mmol L Tns-Base 調(diào)節(jié) pH 值至7.肛 密閉試劑賊8 9保存爭趙宦？周*6.4.3. 11 flftl準(zhǔn)確稱取1.06S

20、 2窖曠酹戊二酸和1. 172 5暫EDTA，故人燒杯內(nèi)，用200 mL溶液2(105 mmol * r1 Tris-HCl沖液)溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶內(nèi)，用Tris-HCl緩沖淒補(bǔ)足至刻度線.密閉試劑刪 匸 咅匸保存.穗定2周。#WS/T 34520116. 4.3. 12 溶液 3準(zhǔn)確稱取0. 789 6 g ADP,放人燒杯內(nèi)用200 mL 105 mmol f1 Tris-HCl緩沖液溶解后轉(zhuǎn)移至 250 mL容量瓶內(nèi)，用Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足至刻度線。密閉試劑瓶2P8P保存.穩(wěn)定2周，6. 4.3. 13 溶液 4準(zhǔn)確稱取0.178 8 g NADH,放入燒杯內(nèi)用200

21、mL 105 mmol Tris-HCl緩沖液溶解后轉(zhuǎn)移 至250 mL容量瓶內(nèi)，用Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足至刻度線.密閉試劑瓶2 *C8 *C保存.穩(wěn)定2周.6.4.3.14 0.2%牛血清白愛白溶液準(zhǔn)確稱取0.5g牛血清白蛋白，放入燒杯內(nèi)，用200 mL無氨水溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容最瓶內(nèi).用 無氨水補(bǔ)足至刻度線.密用試劑瓶2 8 *C保存.穩(wěn)定2周.6 4.3.15 756 000 U f1 GLDH 溶液采用稱歎法依據(jù)L-谷氨酸脫氫酶測定的含量獲得總活性為37 800 U L谷氨酸脫氫酶，放入燒杯 內(nèi)，用40 mL 0.2%牛血清白蛋白溶液溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶內(nèi)，用0.2%

22、牛血清白責(zé)白溶液補(bǔ)足 至刻度線.密閉試劑瓶2 P8 "C保存。穩(wěn)定1周.6. 4. 3. 16100 800 U L-1 Urease 溶液采用禰量法依據(jù)脈酶演定的含量獲得總活性為37 800 U脈瞬放入燒杯內(nèi)后40 mL 0. 2%牛血清 白蛋白溶液溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容最瓶內(nèi)，用0. 2%牛血清白螢白溶液補(bǔ)足至刻度線，密閉試劑瓶 2C保存.穩(wěn)定1周。6. 4. 3. 17空白試劑按以下步驟配制：準(zhǔn)確移取等最的756 000 U - L'1 GLDH溶液及pH 7. 8,210 mmol L*1 Tris-HCl緩沖液進(jìn) 行混合備用；準(zhǔn)確移取10 mL溶液110 mL溶液

23、25 mL溶液42. 5 mL混合后的GLDH溶液及2.5 mL pH7. 8.105 mmol L1 Tris-HCl緩沖液，并進(jìn)行混合制備為空白試劑.6.4.3.18反應(yīng)試劑按以下步驟配制：準(zhǔn)確移取等最的756 000 U- L-1 GLDH溶裁及pH7. 8,210 mmol L'1 Tris-HCl緩沖液，進(jìn) 行混合備用；準(zhǔn)確移取等量的100 800 U- L" Urease溶液及pH7. 8,210 mmol L"1 Tris-HCl緩沖液，進(jìn) 行混合備用； 準(zhǔn)確移取10 mL溶液110 ml溶液25 mL溶液42.5 mL混合后的GLDH溶液及2. 5

24、mL混合后的Urease溶液，并進(jìn)行混合制備為反應(yīng)試劑°6.5標(biāo)準(zhǔn)液的制備6. 5. 1尿素標(biāo)準(zhǔn)原液(100 mmol L")的配制準(zhǔn)確稱取0600 6 g SRM 912a標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，放入清潔干燥經(jīng)過滅菌處理的燒杯內(nèi)加入80 mL無氨 水進(jìn)行溶解，溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL A級容量瓶中用無氨水多次沖洗燒杯將燒杯內(nèi)的尿素溶液全部 轉(zhuǎn)移至容量瓶，用無氨水補(bǔ)足密閉頗倒混勻至少10次，每一次顛倒后旋轉(zhuǎn)倒置容最瓶10s配制完成 后進(jìn)行分裝，每15 mL 一份，放人帶有螺旋蓋的硼硅酸鹽的瓶中，蓋緊并標(biāo)記，注明日期，保存在4匸或 一20匸如無污染，標(biāo)準(zhǔn)原液可以長期穩(wěn)定.建議每6個月重新配

25、制.注1： SRM 912a的參址溟差應(yīng)控制在土0.0002g以內(nèi).注2：尿素標(biāo)準(zhǔn)原液(100 mmol )的配制也可采用其他國際或國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì).6.5.2工作標(biāo)準(zhǔn)液的配制將尿素標(biāo)準(zhǔn)原液和無氨水在室溫平衡30 miru按表I配制工作標(biāo)準(zhǔn)液.衰1工作標(biāo)準(zhǔn)液配制方法原液mL無氨水 mL用無氨水稀釋的最終體枳 mLJR終尿索誑度 mmol L"1010. 001000. 509. 50105.001.009.001010.001.25& 751012. 501.50& 501015.001.758.2510- - !17. 502.008.00. - -10I-J20.00

26、3. 007. 001030. 00配制好的工作標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)貯存于聚乙烯螺旋帕瓶中、4 X：穩(wěn)定期不超過1個月 注：工作標(biāo)準(zhǔn)浪JC存瓶必須清潔干操且紐過無菌化處理.7測定條件 7. 1儀器 7.1.1紫外可見分光光度計 7. 1. 1. 1環(huán)境條件溫度：5 *C35 濕度：45%85%,避光，不能直接放在風(fēng)口，防震.外圍禁放熱源,放置場所周圍 不能有大容氏變壓器等強(qiáng)厳場,周圍環(huán)境宜清潔無塵，電壓穩(wěn)定，避免共用電源設(shè)備的頻繁開關(guān).應(yīng)有 接地線接地電阻大于100 Q,儀器兩側(cè)各應(yīng)有大于20 cm空間.7. 1.1.2數(shù)據(jù)測定范圍ARS 一3.0003.000 或 00%T2000%T.7. 1.1.3

27、測定模式ABS；T(%);Conce7. 1.1.4技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列要求：波長：190 nm1 100 nm；波長準(zhǔn)確度:±0.2nm；波長重現(xiàn)性:±0.1 nm；吸光度準(zhǔn)確性:土 （0. 0020004） > 吸光度貢現(xiàn)性：士（00010.002）;噪聲：W0. 000 2 Abs：基線穩(wěn)定性:W0000 3 Abs/h；基線平穩(wěn)度：±0. 001 Aj光譜帶寬:Cl.Snm,光學(xué)精度：土0. 005 A；雜散光:WO. 05%T°7.1.1. 5狡準(zhǔn)情況每年至少進(jìn)行一次校準(zhǔn);大型實(shí)驗(yàn)的應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn).7.1.2點(diǎn)式溫度計7. 1.2. 1環(huán)境條件

28、溫度0弋100匸，濕度V90%。7. 1.2.2數(shù)據(jù)測定范圍op loo r.7. 1.2.3測定模式攝氏度（匸）7. 1.2.4技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列要求：“分辨率：o. 001 *c）準(zhǔn)確度：土 0.01 ；重復(fù)性：土0. 005匸丿解析度：土 0.000 17. 1.2.5校準(zhǔn)情況每年至少進(jìn)行一次校準(zhǔn);大型實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。7.1.3 pH 計7.1.3.1環(huán)境條絆溫度5 U45 9,濕度5%85%.7. 1.3.2基本性能待征應(yīng)符合下列要求：pH 范圍：-1.00014.000；pH 分辨率：0 002/0.01；準(zhǔn)確度：士0. 002,斜率：80%120%；溫度范圍：一5匸105：溫度分

29、辨率，士0.397. 1.3.3校準(zhǔn)情況7. 1.3. 3. 1 pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的選擇與便用應(yīng)符合以下要求：應(yīng)使用至少兩種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)緩沖液應(yīng)包含PH6pH8的范圍，即應(yīng)包含需調(diào) 整的測定試劑的pH值；pH標(biāo)椎緩沖液的不確定度應(yīng)=001 pH；所用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液應(yīng)能溯源至國際或國家參考物質(zhì).7. 1.3. 3.2 pH 計校準(zhǔn)按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書制備pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖液:將pH標(biāo)準(zhǔn)溶裁溫度調(diào)整至25匸,按pH計使用說明書進(jìn)行 校準(zhǔn).7.1.4電子分析天平7. 1.4. 1環(huán)境條件溫度5 35 濕度45%85%.7. 1.4.2技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列要求：準(zhǔn)確度級別：特種準(zhǔn)確度級；最大允許誤差:

30、7;0. 000 6 g,7. 1.4.3校準(zhǔn)情況每年一次進(jìn)行校準(zhǔn);必要時可增加校準(zhǔn).7.1.5電子天平7.1.5.1環(huán)境條件溫度5 P35 9,哉度45%85%。7. 1.5.2技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列耍求：準(zhǔn)確度級別：高準(zhǔn)確度級）9WS/T 3452011最大允許謀差：±0.05 g.7. 1.5.3校準(zhǔn)情況每年至少進(jìn)行一次校準(zhǔn);大型實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。7.1.6加樣器7.1.6. 1技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列要求：容量允許誤差:JJG 646-2006計最性能標(biāo)準(zhǔn)；測定重復(fù)性:JJG 646-2006計量性能標(biāo)準(zhǔn).7. 1.6.2校準(zhǔn)悄況每三個月進(jìn)行一次校準(zhǔn);實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn).7.1.7容瓶7

31、. 1.7. 1技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合下列要求：材質(zhì)、外觀、結(jié)構(gòu)、密合性:JJG 196-2006通用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn);容蜃允許渓差:JJG 196-2006計量性能標(biāo)準(zhǔn).7. 1.7.2校準(zhǔn)情況實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行校準(zhǔn).7.2最終反應(yīng)混合液的濃度7.2.1血清尿素最終完全反應(yīng)混合液（空白液）的濃度見表2.表2血清尿素量終完全反應(yīng)混合液（空白液）的濃度參數(shù)指標(biāo)Tris100 mmol L*1pH(30r)7.8 土 0 05sGLDH30 000 U L (500 pkat L"1)a 期戊二酸6 mmol L"1EDTA4 mmol L"1ADP2 mmol L-1NADH0. 2 mm

32、ol L"1樣品與反應(yīng)混合協(xié)體枳比0.05(1 > 20)a擴(kuò)展不確定度4=2）.WS/T 34520117. 2.2血清尿素最終完全反應(yīng)混合液（反應(yīng)液）的濃度見表3.« 3血清尿素最終完全反應(yīng)混合液（反應(yīng)液）的濃度參數(shù)指標(biāo)Tris100 mmol L*1pH（3OX：）7.8 士 005GLDH30 000 U L"1 （500 pkat L'1）銅戊二酸6 mmol L*1EDTA4 mmol L*"1ADP2 mmol L"1NADH0. 2 mmol L"1Uressc4 000UL（66“l(fā)utL樣品與反應(yīng)混合

33、物體積比0.05（1，20）4擴(kuò)展不確定S（* = 2）t7.3血清尿素測定條件 見表4.表4血清尿素測定條件畚數(shù)18 標(biāo)溫度3o.or±i c波長339 nm土 1 nm1帶寬0 nm光徑10. 00 mm±0. 01 mma屛育時間30 min測定時何孵育后立即測定1擴(kuò)展不確定度（* = 2）e7.4校準(zhǔn)的擴(kuò)展不確定度如果校準(zhǔn)的擴(kuò)展不確定度等于或小于原參考測定程序中規(guī)定的該參數(shù)允許范圍且校準(zhǔn)的不確定 度范圍重疊于規(guī)定的允許區(qū)間，則溫度、pH、光徑和波長的參數(shù)遵從規(guī)定允許范圈.8測定 8.1無愛白涯液的制備按表5所列順序和量，將試刑和工作標(biāo)準(zhǔn)液/樣品加入離心管中。11WS

34、/T 3452011表5無愛白建液的制備步肆Ba(OH)：(0.11 mol> L-1)5.0 mL工作標(biāo)準(zhǔn)液/樣岳0. 5 mL充分混勻5 s10肌立即加入ZnSOiZnSO<5.0 mL劇烈振蕩10$充分混勻立即按1 000g min-1離心10 min,離心后上清液即為工作標(biāo)準(zhǔn)液/樣品的無蛋白濾液.8.2試劑準(zhǔn)備測定前，將足世的空白試劑、反應(yīng)試劑和樣本（無蛋白濾液）在30 *C下平術(shù)20 min.其余空白試劑 和反應(yīng)試劑應(yīng)貯存于2弋88.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作8. 3. 1工作標(biāo)準(zhǔn)液逵液吸光度的測定按表6所列順序和量將工作標(biāo)準(zhǔn)液無蛋白濾液和試劑進(jìn)行混合孵育后加入比色杯表6工作標(biāo)準(zhǔn)液吸

35、光度測定步驟試劑/樣呂反應(yīng)管空白管空白試刑5.0mL0 mL反應(yīng)試劑0 mL5.0 mL工作標(biāo)準(zhǔn)液無蛋白濾液0.25 mL0. 25 mL輕輕倒混勻樣育30 min孵育結(jié)束后輕輕戲倒混勻，將各管液體依次倒入比色扶內(nèi)約3 mL.340 nm處灣定 吸光度.8.3.2制備標(biāo)準(zhǔn)曲線工作標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值經(jīng)過空白校正后，得到實(shí)際吸光度值.將實(shí)際吸光度值按最小二乘法計算, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。比較每個濃度標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際測定濃度與它的理論濃度差值，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：工作標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0 mmolLT17. 5 mmol -范圍內(nèi)，則|實(shí)際測定濃度一理論濃度|應(yīng)W0. 5 mmol L"1 ；工作標(biāo)準(zhǔn)液濃度1

36、7. 5 mmol L"1，則丨實(shí)際測定濃度一理論濃度|應(yīng)=1.0 mmol L"1 8個濃度16個工作標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)際濃度與理論誑度之差最多有3個不在范圍內(nèi).如果超出以上要求，則標(biāo)準(zhǔn)曲線無效,需重新制備。& 4 團(tuán)定方法按表7所列順序和最，將試劑和樣品進(jìn)行混合孵育后加入比色杯°WS/T 3452011«7血清尿素測定步鼻試劑/薦品反應(yīng)管空白管空白試劑.5.0 mL0 mL反應(yīng)試劑0 mL5.0 mL樣品無貴白濾液0. 25 mL0. 25 mL輕輕傾倒混勻，孵育30 min.卿育結(jié)束后輕輕取倒混勻?qū)⒏鞴芤后w依次倒入比色杯內(nèi)約3 rnL340 nm處測

37、定 吸光度注：應(yīng)使用符合測定性能的分光光度計和高準(zhǔn)確度容誕設(shè)備分光光度渕定的不確定度和樣品體積的不確定度宜用已知標(biāo)凌不確定度的測定程序確定；分光光度測定的吸光度擴(kuò)展不確定度(* = 2)不應(yīng)超過1%,樣品體積部分的!T展不確定度(*=2)應(yīng)該1%.8.5測定范圍血清尿責(zé)測定參考方法的線性為0 mmol -30 mmol f1.8.6誤差的來源8.6.1測定過程中器材和去離子水等如果受到気離子的污染，干擾血清只索的漫定弓：起結(jié)果版亡 偏髙。8.6.2高詼度載化物會抑制尿素酸，引起血清尿素測定結(jié)果假性偏低.8.6.3溶血(血紅蛋白含址10 gL-).黃疸(膽紅素含最1 mmol干擾本注測定結(jié)果影響

38、 大于2%&7測定樣品要求& 7. 1校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)嚴(yán)格按照運(yùn)輸條件和貯存條件運(yùn)輸和保存.8. 7. 2靜脈采血應(yīng)空腹10 h14 h,采血3 mL,室溫2 h內(nèi)離心分離血清，厲心速度3 000 r mirT：,離 心時間10 min.9結(jié)果計算9.1計算實(shí)際吸光度值每份樣本的測定包括樣本吸光度值和空白吸光度值，經(jīng)過空白校正的吸光度值為實(shí)際吸光度值，按 實(shí)際吸光度值=測定吸光度值一空白吸光度值.9.2標(biāo)準(zhǔn)曲坡的制作用最小二乘法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率&和截距a,每個單獨(dú)的吸光度作為非獨(dú)立變異丙索給出，濃發(fā)作 為獨(dú)立因素使用16個吸光度值和16個濃度用于8組數(shù)據(jù)分析.

39、設(shè)定倍增系«(F) = l/6»校正因數(shù)(C)=a/fr16個標(biāo)準(zhǔn)液的毎一個實(shí)際測定濃度按公式(3)計算：«««取 X F C( 3 )式中：標(biāo)桂液實(shí)際測定濃度，單位為亳克每分升(mgdL-J；標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)際吸光度值；F倍增系數(shù)，等于1/6；C校正因數(shù)，等于a/九9.3樣品測定結(jié)果的計算標(biāo)準(zhǔn)曲線符合通過標(biāo)準(zhǔn)后，按公式(4)計算樣品濃度： c*g=A“xF C( 4式中：5一樣品測定結(jié)果，單位為毫摩爾(mmolL-1);A “ 一樣品實(shí)際吸光度值；F倍增系數(shù)，等于1/如C校正因數(shù)，等于a/b.9.4單位換算以mgdL單位表示的血清尿素濃度可通過乘以系

40、數(shù)(/=0.167)轉(zhuǎn)化成mmolL'1#WS/T 3452011Ptt ft A （艦范性附錄） 氫酶催優(yōu)話性液度測定A. 1藏定試剤A. 1. 1補(bǔ)克試擁原料aCNHcCl）.相對分子質(zhì)量= 53M9tA. 1.2試劑制備A, L2. 1125 mmol L '的 Tris*HCl淮確稱取1.970g Tris-HCLSt人燒杯內(nèi)，用SOmL無氨水溶解后轉(zhuǎn)移至NO eiL容屋瓶內(nèi)*用無輕 水補(bǔ)足至刻度線.密閉試J2X：-8TC保存。穩(wěn)定2周，A, 1. 2+ 2125 mntol * I.'1 Tris-Base推確諫取1. 514 3 e TrBase.放入燒杯內(nèi)

41、，斥抑rrX試劑水常解后轉(zhuǎn)移至100代匸容量擬內(nèi)+用試 削水補(bǔ)足至刻度線密席訖劑瓶2匸呂弋保存。卷定2周.A, 1.2. 3 pH7. B.125 mmol * L_1 Tris-HCJ 緩沖液100 mb的125 mmol * L 1 Tris-HCl倒人燒擠內(nèi)，用125 mmol鴕調(diào)節(jié)pH值至7. S. 密廚試捌瓶2 P8 X：保存.穩(wěn)定2周.A. 1.2.4溶覆血準(zhǔn)確稱戰(zhàn) HO罰 Eg 滬酶戊二 .O.OOS 9g NADH,O. 093 1 g EDTA .0,062 7 g ADP 別用 5 tnL pH 7. 8J25 mmol * f1 Tris-HCl緩沖菠溶解后轉(zhuǎn)碁至50 m

42、L容量瓶中用Tris-HCl緩沖液充分沖狀 燒杯，使瘩解廉分全部轉(zhuǎn)體至容量瓶中'用TriHCl 沖液補(bǔ)足至刻度線.密閉試劑瓶2 TC-8 U棵 存，穩(wěn)定3血A. LZ5反應(yīng)試刑準(zhǔn)確稱取0.334 3呂NH.CI,用榕液A充分溶解后轉(zhuǎn)移至2S ruL容量瓶中*用溶液A充分沖撫燒 杯*使涪解成龍全部轉(zhuǎn)程至容童瓶中，用溶臧a補(bǔ)足至刻度線.密閉試刑戰(zhàn)ar-e*C裸存*穂定2山A, L2,6 31 500 U L" GLDH 容港采用稱量密嵌據(jù)谷氨酸脫氫酵廠家聲明的含錄獲得總活性為63L1 L-谷氨酸脫氫酶，放人燒杯 內(nèi)，用2mL 0.2牛血清直蚤白酵液完全溶解.密閉試劑婕29=8 保

43、存.穗定1止A.L2.7 "谷氯醴脫賽*的輛釋便用前進(jìn)行示例扎1.2.M 在2,8mL 0,2%牛血灣白蛋白溶液中加入広ImL i谷畫酸脫氫醐原液充分餛勻.第一5 步的稀釋比刮是1 28*A.L2.7.2 將步驟扎L2.7. 1中的0. 1 mb最蠅協(xié)蔽加入到2. S mL 125 mmol - f0, 2血清白ISWS/T 3452011蛋白溶液中，充分混勻.第二步的稀釋比例是1 « 28.第一步和第二步總稀釋比例是1 « 841.A. 2測定條件A.2. 1最終反應(yīng)混合液的濃度見表A.I.* A. 1 L谷氨酸脫氫議催化活性濃度測定最終反應(yīng)混合液的濃度參數(shù)指標(biāo)

44、TriS100 mmol L"1pH(30r)78±C 05*a 酮戊二酸6 mmol L-1EDTA4 mmol L-1ADP2 mmol L*1NADH0. 2 mmol L_,NH<C12C0 mmol L"1樣品與反應(yīng)混合初體積比0.20(1 » 5)a擴(kuò)履不確定度（*=2）.A. 2.2 "谷氨酸脫氫爾催化活性濃度漠定條件見表A.2.表A.2厶谷氨酸脫氫酶催化活性濃度測定條件# ft指標(biāo)溫度30.0匸±02波長339 nm 士 1 nma帶寬W2 nm光徑10. 00 mm±0. 01 mme再育時間90 s

45、測定時何連續(xù)監(jiān)測孵角后120 s3擴(kuò)展不確定度* = 2）eA.3測定A. 3.1試劑準(zhǔn)備將5 mL反應(yīng)試劑、06 mL L谷氨酸脫氫酶稀釋液和0. 6 mL生理鹽水放在30匸土0. 2 的水浴 箱中大約10 min使液體達(dá)到預(yù)定溫度。#WS/T 3452011A. 3. 2測定方法按表A. 3的順序和扯將試劑和樣品加入比色杯表A3谷氨酸脫氫S|稀釋液催化活性濃度測定步鼻反應(yīng)液2.000 mL平衡到30 I：步鼻A. 1. 2. 7. 2 1 谷氨酸脫氫穂溶液0. 500 mL充分混勻，孵育90再連續(xù)120 s的吸光度.A. 3.3試劑空白采用9 gL-J(154 mmol)氯化鈉溶液代祥L-

46、谷氨酸脫氫酶溶液浪定試劑空白，按上述步驟 進(jìn)行操作.A.4結(jié)果計算通過回歸分析(最小二集法)計算吸光度隨時間的改變減去試劑空白率后即GLDH儲存液稀釋液的吸光度變化率。按公式(A. 1)計箕儲存酹溶液中GLDH催化活性濃廈：GLDH ftoa = FX Fammi X (AA/AX)gldh (A. 1 )注：此公式僅適用于按上述方法稀釋與澳定L谷氨酸脫氫SI催化活性濃度.式中：GLDHgh 祥原液中谷氨酸脫氫酶催化活性濃度單位為微凱塔爾毎升Ska: L-J或單 位每升(U* f1)；注*單位pkat L"除以1 000可得mkat L"1,單位U L"1除以1

47、000可得kU L"1.F系數(shù)，尊于 794(在 339 nm 波長測定(NADH) = 630 m: mor1 為 IFCC 與IRMM推薦卄F GLDH儲存液的稀釋因子.A.1.2.7中為84"(AA/AOcg測定樣品的實(shí)際吸光度變化率，單位為每秒Q7)或每分(mini)。WS/T 3452011規(guī)范性附錄）豚酶催化活性濃度測定B1測定試刑B. t 1試劑制備B, L 1. 1125 mmol 的 Tris-HCl準(zhǔn)確稱取L 970fiTrHCl,放人燒杯內(nèi)，用帥mL無毎水落解厲轉(zhuǎn)移至100tnL睜量瓶內(nèi)，用無輒 水補(bǔ)足至刻度線.密閉試劑瓶2它ET?保存*穩(wěn)定2周.B+

48、 1+ 1. 2125 mmol * L_, Tris-Base準(zhǔn)確稱取1. 5U 3 g Tris-Base人燒杯內(nèi)用80 mb試劑水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容氏瓶內(nèi)，用試 劑水補(bǔ)足至刻度線.茗閉試劑瓶2弋8弋保存.穩(wěn)定2周.B. 1. L3 pH7. 8 J25 mmol I/1 Tris-HCI ij 沖懣100 mL的1藥mmolL_1 Trts-HCi倒人燒杯內(nèi)周125molLc Tris-Base間節(jié)pH值至匸 密閉試劑瓶ar-er保存.種宦2周.B.1.1.4 落酒 B準(zhǔn)確稱取 0, OS4 S 呂“酮戊二議 *0, 008 9 g NADH.O, 093 1 g EDTA.O.