Vero細胞HCP(宿主殘留蛋白)ELISA試劑盒說明書

1、 Vero 細胞 HCP（宿主細胞蛋白） Vero細胞宿主蛋白酶聯(lián)免疫檢測 目錄 #F500預(yù)期用途 該試劑盒用于檢測用Vero 細胞.生產(chǎn)的制品中是否有宿主蛋白殘留。僅供研究和工業(yè)生產(chǎn)，不能用于人和動物的診斷?？偨Y(jié)與說明 病毒疫苗或其他治療用蛋白在Vero細胞中表達使商業(yè)用大量生產(chǎn)藥物原料產(chǎn)品的經(jīng)濟簡便方法。生產(chǎn)和純化這些產(chǎn)品的過程中會殘留Vero細胞中的一些蛋白質(zhì)（稱為宿主細胞蛋白，HCPs）而造成污染。這種污染可以減少藥物的療效，引發(fā)毒副反應(yīng)和免疫學反應(yīng)，因此最好在實際生產(chǎn)制品過程中將HCPs降低到最低水平。 一些利用抗體來除HCPs的免疫學方法，如Western Blot 和ELISA

2、被廣泛使用。雖然Western blot是一種檢測HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。因為它過程復雜且技術(shù)依賴性強，需要操作者對結(jié)果進行分析解釋。而且，它在本質(zhì)上是一種定性檢測，不能定量分析。Western blot的敏感性易受被檢測樣品量的影響，也受目的產(chǎn)品濃度的干擾。因此Western blot可用來檢測純化上游的蛋白質(zhì)，而對純化下游或終產(chǎn)品的檢測靈敏度與特異性較低。本試劑盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺點，將敏感度提高了100倍。ELISA操作簡單、客觀、可獲得半定量的結(jié)果，是純化工藝，過程控制，常規(guī)質(zhì)量檢測的最佳選擇。這個試劑盒可與純化過程中殘留的可獨立污

3、染產(chǎn)品的所有HCPs反應(yīng)，就這個意義上來說，這個試劑盒是通用的。用Vero細胞輕度裂解物獲得抗體并經(jīng)親和純化，得到的最終抗體可以與用于生產(chǎn)各種病毒疫苗和蛋白質(zhì)產(chǎn)品的四種商用細胞系反應(yīng)。這一分析表明，絕大多數(shù)HCP存在于各種Vero細胞系和純化過程中。如果你需要一個更為敏感和特異性的方法去檢測樣品中的HCP量，Cygnus Technologies公司為你推薦一個優(yōu)于2D Western blot的方法，我們將這個方法稱為2D HPLC-ELISA。2D HPLC-ELISA相較于2D Western blot來說敏感性強，特異性高。要想更多了解此方法，請聯(lián)系我們公司服務(wù)部門。 使用特殊的方法制

4、備抗體，以減少低分子量和低免疫原性污染物以及高分子量組分。例如本試劑盒，可以作為一個工藝過程開發(fā)的工具來監(jiān)控去除宿主細胞污染物的最佳條件，以及確保最終產(chǎn)品發(fā)布。 這種敏感性高的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒已被用于檢測終產(chǎn)品的HCP，通過對來自不同生長狀態(tài)和純化過程的4種疫苗產(chǎn)品的中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的實際檢測來得到結(jié)果。我們鼓勵該試劑盒的的每個使用者進行類似的驗證研究以證明它符合他們的分析需求。這個試劑盒能滿足你們的樣品需求，不用再運用其他的特異性實驗，因為那些實驗提供的信息對這個通用的試劑盒來說是重復多余的。但是，如果你的驗證研究表明此試劑盒中的抗體與你的樣品中的HCP不能充分反應(yīng)，那就需要同時運用一種

5、特異性的ELISA，且需要特異性強的抗血清?；蛘?，如果該試劑盒中使用的多克隆抗體能提供足夠的敏感性和廣泛的抗原反應(yīng)性，可用它替代本試劑盒中經(jīng)共純化的污染物制作的標準品，從而在特異的HCP檢測過程中達到更好的精確性。使用更多的抗原和抗體所做的特異性分析法的應(yīng)用理論上具有更好的特異性，但因為它過于特異而不能檢測出因為操作不規(guī)范或過程改變后產(chǎn)生的一些新的或非典型的污染物。由于這個原因，我們建議用具有廣泛反應(yīng)性的“通用”宿主細胞蛋白檢測實驗分析最終產(chǎn)品純度，即使可使用過程特異性分析。如果你認為有必要進行過程特異性分析檢測， Cygnus Technologies公司將運用其已經(jīng)驗證的方法開發(fā)這種抗體并

6、按顧客要求進行檢測。檢測原理 Vero細胞檢測是一個雙位點酶聯(lián)免疫檢測。樣品中包含的Vero Cell HCPs蛋白與標記有抗-Vero Cell抗體的辣根過氧化酶同時反應(yīng)，反應(yīng)在之前涂有一層吸附性抗-Vero Cell蛋白抗體的微量滴定板中進行。免疫反構(gòu)成為夾層結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標記抗體。反應(yīng)結(jié)束后清洗微量滴定板，去除未結(jié)合反應(yīng)物。添加TMB作用底物反應(yīng)。微量滴定板讀數(shù)器上測定水解物濃度，水解物濃度與Vero Cell HCPs蛋白濃度成正比。試劑&材料（試劑盒提供）成分 產(chǎn)品 #抗-Vero cell:HRP F501羊抗Vero cell親和純化抗體，用辣根過氧化酶標記。

7、排列在加有防腐劑的試劑盒中， 1x12mLAnti-Vero cell coated微量滴定板 F502*12×8孔 裝在含有干燥劑的袋子內(nèi)Vero cell HCP標準液 F503含有Vero cell HCP、牛血清白蛋白與防腐劑。 規(guī)格有 0, 2, 8, 25, 75和 200ng/mL . 1 mL/瓶 終止液 F0060.5N硫磺酸 1x12mLTMB F0053,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺. 1x12mL清洗物（20倍濃縮） F004含防腐劑的Tris緩沖液 1x50ml *除了#F505，所有成分都可單獨購買儲存&穩(wěn)定性*為了保持穩(wěn)定，所有的試劑應(yīng)儲存在2

8、76;C至8°C，直到打印所示的截止日期為止*若作為底物的試劑在450nm吸光度大于0.1，則不要使用*試劑盒所帶的復原液在保質(zhì)期前都是穩(wěn)定的材料和器材（試劑盒不提供）能在450&650nm對微量滴定板進行讀數(shù)的分光光度計（如果你微量滴定板不能不提供雙波長的分析，你可以讀取450nm波長）移液槍 50µL 和100µL多頭或多道移液器 100µL微量滴定板旋轉(zhuǎn)器 150 - 200 rpm樣品稀釋液 推薦用Cat # 1028蒸餾水1L洗滌瓶，用來稀釋洗液警告*僅供研究和工業(yè)使用*終止液是0.5N硫磺酸，禁止眼睛、皮膚或衣服與之接觸。試劑盒的其他

9、試劑均無害*該試劑盒只能由有資格的技術(shù)人員操作試劑預(yù)處理*將所有試劑放到室溫下*用蒸餾水將濃縮的洗液稀釋到1L，在試劑盒上貼上標簽，寫上組別和失效日期，儲存在4°C注意事項 1.正確洗板，除去過量的未反應(yīng)試劑對保持實驗的重復性和靈敏度是必不可少的。我們強烈建議不要使用自動化或其他手動操作的真空吸塵裝置清洗板，因為這樣會降低特異性的吸光度，增加非特異的吸光度，使精確度改變。下面介紹的人工清洗程序在一般情況下只造成較低的背景干擾，且特異性的吸光度高，精確度更好。 2.樣品中HCP濃度高時可觀察到高劑量鉤狀效應(yīng)或低水平的線性稀釋。高劑量鉤效應(yīng)是由于在純化上游階段樣品的HCP濃度過高，相對來

10、說抗體較低而引起的。濃度大于1mg/mL 的樣品，其吸光度低于200 ng/mL的標準液。當抗體濃度超過HCP濃度時，也會出現(xiàn)鉤效應(yīng)。在這種情況下，未稀釋的樣品的吸光度可能低于試劑盒最高標準液的吸光度。然而，這些樣本不能顯示隨著稀釋度增加，HCP濃度也增加的線性關(guān)系。鉤狀效應(yīng)最常出現(xiàn)在純化上游階段。如果可能出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，我們需要對已稀釋的樣品進行檢測。如果未稀釋樣品中HCP的濃度低于已稀釋樣品中HCP的濃度，則可能引起鉤狀效應(yīng)。這樣的樣品至少要稀釋到用實驗中間品和終成品驗證了的需要稀釋的最低限度（MRDS）。在保證統(tǒng)計學精確度的情況下，一系列能檢測出相同HCP值的樣品稀釋度中，MRD是第一個符

11、合要求的稀釋度。據(jù)報道，樣品的稀釋度與HCP值的關(guān)聯(lián)是在已建立的MRD的基礎(chǔ)上修正的。所用稀釋劑應(yīng)該準確回收。首選的稀釋劑是我們規(guī)格為100ml、500ml或1l/瓶的 Cat# I028。本試劑盒的標準液也是由這種稀釋液制備的。當樣品用1028稀釋時，其稀釋模型開始接近標準，從而減少用其他稀釋液所造成的任何錯誤。其他要用的稀釋液必須測試非特異性的結(jié)合，并用它們回收 已稀釋的200ng/mL的標準液，方法如下文所述。局限性*在依靠這種檢測來檢測宿主細胞殘留蛋白之前，每一個實驗室都應(yīng)該驗證該試劑盒的抗體和檢測程序的特異性、準確性和精確度是否符合要求?？梢詮奈覀児镜姆?wù)部門或網(wǎng)站獲得驗證試驗的方

12、法。*在本實驗中使用的標準品包括用常規(guī)方法在疫苗產(chǎn)品初次收獲液中溶解的Vero細胞HCPs。在該試劑盒中使用的用來分析抗體的1D Western blot可識別經(jīng)敏感蛋白染色（如銀染和膠體金染色）的大多數(shù)的PAGE分離的條帶。由于Vero 細胞系的大多數(shù)HCPS會表現(xiàn)出足夠的抗原量，該試劑盒應(yīng)該有足夠的抗體活性與你的細胞系充分反應(yīng)。但是，我們不能保證該試劑盒能檢測出你們生產(chǎn)過程中所有的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。如果你希望用比 western blot 更為靈敏的方法來檢測該試劑盒中的抗體與你的HCPs是否充分反應(yīng)，我們將為你提供經(jīng)過ELISA后用2D-HPLC分離HCPs的方法。*某些樣品基質(zhì)可能會

13、干擾試驗。本試劑盒使用的標準品試圖模擬典型的樣品與基質(zhì)矩陣。然而，潛在的產(chǎn)品本身或樣品基質(zhì)中的其他成分可能對本實驗產(chǎn)生一些正向或負向干擾。高或低的PH值，去垢劑，尿素，高濃度的鹽和有機溶劑是已知的干擾因素。建議對所有樣品基質(zhì)進行測試以排除干擾，用經(jīng)稀釋的200ng/ml標準液，1/4的基質(zhì)不含或含非常低的HCP。如果要用標準品檢測未知樣品，則需添加30到50 ng/mL標準品的HCP值。至于如何定量樣品基質(zhì)的值，請咨詢公司服務(wù)部門。*避免對含有疊氮化鈉（NaN3）的樣品進行測定，因為它會破壞辣根過氧化酶的連接活性，測得的HCP值偏低。實驗方案* 該測定是非常強大的，可通過改變孵育時間、樣本大小

14、及它后續(xù)反應(yīng)等實驗中的可變因素可提高敏感性，增加分析范圍或減少樣本基質(zhì)干擾。在修改我公司推薦的方法之前請聯(lián)系我們，我們將以最佳方式輸入數(shù)據(jù)以確保達到您期望的目的。*實驗指定使用經(jīng)認證的微量滴定板振動器或旋轉(zhuǎn)器進行免疫學操作。這些設(shè)備可以從大多數(shù)實驗室購買，不需要在公司買?；蛘吣阋部梢灾苯釉谖覀児举徺I經(jīng)驗證的，預(yù)校準的微量滴定板振動器。如果你沒有這樣的裝置，可以直接在板中孵育，不需要震蕩，但要將免疫孵育時間延長到一個小時左右來達到使用振蕩器所達到的效果。孵育時的前30min不要振蕩，否則會造成背景污染或降低精確度。*將所有試劑放到室溫下。設(shè)置板的分光光度計的測試波長為450nm，650nm處的

15、讀數(shù)為作為參考。*徹底清洗是保證本實驗性能的必不可少的步驟。我們強烈建議不要使用自動化或其他真空吸塵裝置清洗板。本實驗推薦的手工清洗方法是保證精確性、敏感性和正確性的首選。關(guān)于此方法更詳細的信息可以從公司的服務(wù)部門或網(wǎng)站獲得。*所有標準品、對照品和樣品至少應(yīng)做一次重復實驗。*實驗板孔加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)孔的孵育時間一致。*作一個工作記錄，以確定檢測時標準品、對照品和樣品各自的位置。*建議您的實驗室對每一個過程的對照品進行測試，以確保所有試劑和程序是正確的。強烈要求你用來自所用的細胞系的樣品基質(zhì)和HCP做一個典型樣品矩陣作為對照。這些對照品可分裝到單次使用的小瓶中，并保存在0度使

16、其長時間保持穩(wěn)定。*如果該底物具有明顯的藍顏色，可能是在檢測之前已被污染。如果100µL底物的吸光度加上以100µL水為空白對照時的吸光度超過0.1，我們就需要更換新的底物，否則實驗的敏感性會受影響。*應(yīng)在加入終止液后的30min內(nèi)讀板，因為蛋白質(zhì)著色會隨著時間的推移而褪色。質(zhì)量控制*重復樣品的精確度用兩者的平均百分比計算。在8-200ngmL的樣品范圍內(nèi)，變異系數(shù)小于10%，而樣品8 ng/ml時，變異系數(shù)可大于10%。*當以水為底物進行空白對照時，最佳吸光度應(yīng) < 0.1.*建議各實驗室檢測每個過程中的的質(zhì)量控制樣品，以確保所有試劑和程序是正確的。結(jié)果計算標準液可

17、用于制作標準曲線，標準液濃度相當于免疫反應(yīng)HCP總濃度。根據(jù)測定的小孔中標準液吸光值繪制標準曲線。數(shù)據(jù)分析可以使用計算機選配曲線，例如點到點、三次樣本函數(shù)或四參數(shù)邏輯曲線。不要使用線性回歸分析修改樣品吸光值，這樣會出現(xiàn)顯著誤差。也可以手工繪圖，Y軸標注吸光度，X軸標注濃度。然后根據(jù)樣品吸光值計算出樣品中HCP濃度。 實驗步驟1. 分別移取50µL標準液、對照物和樣品至待測孔2. 移取100µl anti-Vero Cell:HRP(#F501)至每孔3. 密封滴定板，搖床室溫(24°C + 4°)溫育2小時，180rmp4.直接傾到或用移液管輕輕吸走孔內(nèi)

18、溶液，并用吸水紙吸干殘留液。350 µL的清洗緩沖液沖洗四次。擦干微量滴定板外的液體，因為任何殘留物都會影響讀數(shù)。清洗緩沖液不能長時間停留在孔內(nèi)。加TMB前不能讓孔內(nèi)干燥。5. 加100µl TMB 作用物(#F005)6. 室溫靜置30min,不需搖床7. 加100µl反應(yīng)終止液(#F006)8. 分光光度計450/650nm讀數(shù)，以空白對照調(diào)零。范例孔含量抗體 450nm抗體量1A0標準品0.1121B0標準品0.1090.1111C2ng/mL0.1421D2ng/ml0.1410.1421E8ng/ml0.2051F8ng/ml0.2080.2071G25

19、ng/ml0.4001H25ng/ml0.4210.4112A75ng/ml0.9572B75ng/ml1.0130.9852C200ng/ml2.2992D200ng/ml2.3162.3082E樣品A0.2132F樣品A0.2090.2118.42G樣品B0.9392H樣品B0.9820.96172.9性質(zhì) Cygnus Technologies用傳統(tǒng)方法對試劑盒性能進行了如下驗證。如果需要的話，認證報告可從公司網(wǎng)站獲得。此驗證在本質(zhì)上是通用的，并且是為了補充而不是替換某些用戶和產(chǎn)品應(yīng)該具有的由每個實驗室進行的資格驗證。但這些實驗室必須對他們自己的樣本做一次實驗矯正。另外，本試驗范圍內(nèi)產(chǎn)生

20、的來源于HCPs的任何樣品類型均應(yīng)進行稀釋線性以確保檢測的準確性，并確定具有足夠的抗體與你的HCPs充分反應(yīng)。每個實驗室和技術(shù)人員在要求精確性的檢測過程中應(yīng)該具有如下描述的能力。更多的建議做的驗證程序可在公司服務(wù)部門或網(wǎng)站獲得。敏感度最低檢測限（LOD）定義為比空白對照的平均值高兩倍的樣品濃度。LOD是 0.7 ng/mL.最低定量限（LOQ）被定義為濃度變化系數(shù)（CVS）是小于20%時可測到的最低濃度。 LOQ is <2 ng/mL。精確度組內(nèi)（20個重復）和組間（10個實驗）的精確度有3個水平（ 8ngml）、中（ 25ng/ml）、高濃度（ 75ngml）的檢測結(jié)果決定。CV百分

21、比為三個水平所測的平均值除以標準偏差再乘以100。水平組內(nèi)CV組間CV低6.9% 4.4%中5.5% 3.7%高3.5% 3.6%特異性/交叉反應(yīng)對4中商用的商業(yè)Vero細胞株進行1D Western blot and ELISA分析 表明，在所有細胞系中大多數(shù)的蛋白質(zhì)是保守的。因此此方法也可用來檢測其他Vero細胞株的HCP。1D/2D Western blot與ELISA無關(guān)，且不能用銀染或膠體金染色技術(shù)對非特異的蛋白進行染色。即使如此，銀染結(jié)果和western blot結(jié)果不一致并不一定意味著沒有抗那種蛋白的抗體或用 ELISA 不能檢測到那種蛋白質(zhì)。如果你想在檢測試劑盒中抗體與 HCPs的反應(yīng)時用比western blot更為敏感和特異的方法， Cygnus很高興能夠提供的服務(wù)和/或基于2D高效液相色譜法的 ELISA分析 HCPs的咨詢。這種方法已被證明在檢測HCP時具有更高的靈敏度和精確度。同樣的用于捕獲的抗體和HRP標簽可以單獨購買 如# VC 807-AF。 沒有用這個試劑盒對非HCP成分的交叉反應(yīng)進行廣泛的研究。因為存在正向干擾，如交叉反應(yīng)