《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方方法》GB79181～5——87

1、一、總 則general principle1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。2 儀器和設(shè)備2.1 天平。2.2 高壓滅菌器。2.3 振蕩器。2.4 三角瓶。2.5 玻璃珠。2.6 玻璃棒。2.7 刻度吸管。2.8 研缽。2.9 均質(zhì)器。2.10 恒溫水浴箱。2.11 采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開(kāi)罐器等。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 生理鹽水成分：氯化鈉 8.5g蒸餾水加至1000 ml溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90ml ， 103.43kpa(15 lb)20min 高壓滅菌。3.2 scdlp 液體培養(yǎng)基成分： 酪蛋白胨17

2、g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫 807g蒸餾水1000ml制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào) ph 為7.2 7.3,分裝，103.43kpa(15lb)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25左右使用。注：如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。7.3 滅菌液體石蠟。7.4 滅菌吐溫80。4樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1 所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝 單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10ml。包裝量小于20g的

3、樣品，采樣量應(yīng)適量增加，其總量應(yīng)大于 16g。4.2 供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)，進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝。容器不應(yīng)有破裂， 在檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品被污染。4.3 接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)， 樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。4.4 若只有一份樣品而同時(shí)需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，應(yīng)先做微生物檢驗(yàn)， 再將剩余樣品做其它分析。4.5 在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所 用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按 無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行。5供檢樣品

4、的制備5.1 液體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品，量取 10ml加到90ml滅菌生理鹽水中，混勻后，制成 1:10檢液。5.1.2 油性液體樣品，取樣品 10ml,先加5ml滅菌液體石蠟混勻，再加 10ml滅菌的吐溫80,在40 c44c水浴中振蕩混合 10min,加入滅菌的生理鹽水 75ml（在40c44c水浴中 預(yù)溫），在40c44c水浴中乳化，制成 1:10的懸液。5.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1 親水性的樣品，稱取 10g,加到裝有玻璃珠及 90ml滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振 蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。5.2.2 疏水性樣品，稱取10g,放到

5、滅菌的研缽中，加 10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀， 再加入10ml滅菌吐溫80,研磨待溶解后，加 70ml滅菌生理鹽水，在 40c44c水浴中充 分混合，制成1:10檢液。5.3 固體樣品，稱取10g,加到90ml滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置 后，取上清液作為1:10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱 10g樣品加入90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱 10g樣品，力口 10ml滅菌液體石蠟，10ml滅 菌吐溫80, 70ml滅菌生理鹽水，均質(zhì) 3min5min。二、菌落總數(shù)aerobic bacterial cou

6、nt1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)(aerobic bacterial count)是指化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、ph值、需氧性質(zhì)等)，1g(1ml)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3儀器和設(shè)備3.1 三角瓶。3.2 量筒。3.3 ph計(jì)或精密ph試紙。3.4 wj壓火茵器。3.5 試管。3.6 平皿：直徑9cm。3.7 刻度吸管：1

7、0ml、2ml、1ml。3.8 酒精燈。3.9 恒溫培養(yǎng)箱。3.10 放大鏡。4培養(yǎng)基和試劑4.1 生理鹽水：見(jiàn)總則中 3.1。4.2 卵磷脂、吐溫80一營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.1 成分： 蛋白陳20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸儲(chǔ)水1000ml4.2.2 制法：先將卵磷脂加到少量蒸儲(chǔ)水中，加熱溶解，加入吐溫80,將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸儲(chǔ)水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)ph值為7.17.4,加入瓊脂，103.43kpa(15 lb)20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.3 0.5%氯化三苯四氮口坐(2,3,5-triphenyl ter

8、azolium chloride,ttc)成分：ttc0.5g蒸儲(chǔ)水100ml溶解后過(guò)濾，103.43kpa（15 lb）20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4c冰箱備用。5操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取 1:10稀釋的檢液2ml,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿 1ml。另取 1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面）,更換一支吸管，并充分混勻， 制成1:100檢液。吸取2ml,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿 1ml。如樣品含菌量高，還 可再稀釋成1:1000, 1:10000,等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。5.2 將融化并冷至45 c50 c的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾

9、注到平皿內(nèi)，每皿約15ml,隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約 15ml卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基， 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h,為空白對(duì)照。5.3 為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每 100ml卵磷脂吐溫 80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入 1ml0.5%的ttc溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無(wú)變化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成

10、片狀的菌落或 花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌 落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2,以代表全皿菌落數(shù)。7菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在 30300個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見(jiàn)表1中例1）。7.2 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于 2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于 2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見(jiàn)表1中例2及例3）。7.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則

11、應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例4）。7.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1例5）。7.5 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在 30300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于 300個(gè)，而相 鄰的另一稀釋度小于 30個(gè)時(shí)，則以接近 30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1 中例6）。7.6 若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g或每ml小于10cfu。7.7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于 100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)

12、數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表1報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度 菌數(shù)之比菌落總數(shù)cfu/ml或cfu/g報(bào)告方式cfu/ml 或 cfu/g10-110-210-311365164201640016000 或 1.6x 10422760295461.63800038000 或 3.8 x 10432890271602.22710027000 或 2.7x 1044不口計(jì)4650513513000510000 或 5.1 x 105527115270270 或 2.7 x1026不口計(jì)30512305003

13、1000 或 3.1 x 1047000<1x10v 10*cfu:菌落形成單位。三、糞大腸菌群fecal coliforms1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2 定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(fecal coliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，在44.5c培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌來(lái)自人和溫血?jiǎng)游锛S便，是重要的衛(wèi)生指示菌。3儀器3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44c ± 0.5co3.2 溫度計(jì)。3.3 顯微鏡。3.4 載玻片。3.5 接種環(huán)。3.6 電爐。3.7 三角瓶。3.8

14、試管。3.9 小倒管。3.10 ph計(jì)或ph試紙。3.11 wj壓火茵器。3.12 刻度吸管：10ml、2ml、1ml。3.13 平皿。4培養(yǎng)基和試劑4.1 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分：蛋白月東40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%澳甲酚紫水溶液5ml蒸儲(chǔ)水1000ml制法：將蛋白月東、膽鹽及乳糖溶解于蒸儲(chǔ)水中，調(diào) ph到7.4,加入0.4%澳甲酚紫水溶液5ml ,混勻，分裝試管(每支試管中加一個(gè)小倒管 )。68.95kpa (10 lb)20min滅菌。4.2 伊紅美蘭(emb)瓊脂成分：蛋白月東10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20ml0.5%美藍(lán)水溶液13ml蒸儲(chǔ)水1000

15、ml制法：先將瓊脂加到 900ml蒸儲(chǔ)水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白月東，混勻， 使之溶解。再以蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足至 1000ml o校正ph值為7.27.4,分裝于三角瓶?jī)?nèi)，103.43kpa(15 lb)15min高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60c左右無(wú)菌操作加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3 蛋白月東水(作靛基質(zhì)試驗(yàn)用)成分：蛋白月東(或胰蛋白月東)20g氯化鈉5g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：將上述成分加熱融化，調(diào)ph值為7.07.2,分裝小試管，103.43kpa(15 lb)15min高壓滅菌。4.4 靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解

16、于75ml戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25ml o試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白陳水中，于44±0.5c培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑 0.30.5ml ,輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白月東應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白月東買來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.5 革蘭氏染色液：4.5.1 染液制備4.5.1.1 結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95% 乙醇20ml1%草酸俊水溶液80ml將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸俊溶液混合。4.5.1.2 革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸儲(chǔ)水加至300ml將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸儲(chǔ)水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸儲(chǔ)水至300ml。4

17、.5.1.3 脫色液：95%乙醇。4.5.1.4 復(fù)染液：a.沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g95% 乙醇10ml蒸儲(chǔ)水90ml將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸儲(chǔ)水稀釋。b.稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g,研細(xì)，加95%乙醇100ml,放置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾。取該液10ml,加5%石碳酸水溶液 90ml混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10ml加水90ml ,即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1min,水洗。4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液，作用 1min,水洗。4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色，約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙

18、醇滴滿整個(gè) 涂片，脫色10s,水洗。4.5.2.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染1min,水洗，待干，鏡檢。4.5.3 染色結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需10s。5操作步驟5.1 取10ml1:10稀釋的檢液，加到 10ml雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置 44c±0.5c培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37c培養(yǎng)18 h24 h。同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白月東水中，置 44 c ± 0.5 c培養(yǎng)24ho經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板

19、上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上 的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑 色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4 在蛋白月東水培養(yǎng)液中，力口入靛基質(zhì)試劑約0.5ml,觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試 驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。四、綠膿桿菌pseudomonas aeruginosa1范圍本規(guī)范規(guī)定了化

20、妝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)。2定義本規(guī)范采用下列定義。綠膿卞f菌(pseudomonas aeruginosa屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能 產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42c條件下能生長(zhǎng)。該菌對(duì)人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器3.1 恒溫培養(yǎng)箱：37 c、42 c。3.2 三角瓶。3.3 試管。3.4 平皿。3.5 刻度吸管：10ml、2ml、1ml。3.6 顯微鏡。3.7 載玻片。3.8 接種針、接種環(huán)。3.9 電爐。3.10 高壓滅茵器。4培養(yǎng)基和試劑4.1 scdlp液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。

21、4.2 十六烷基三甲基澳化俊培養(yǎng)基成分： 牛肉膏3g蛋白月東10g氯化鈉5g十六烷基三甲基澳化錢0.3g瓊脂20g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào) ph為7.47.6,加入瓊脂，68.95kpa (10 lb)20min滅菌后，制成平板備用。4.3 乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10g氯化鈉5g無(wú)水磷酸氫二鉀1.39g無(wú)水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂(mgso 4 7h2o)0.5g酚紅0.012g (1.2%溶液 1ml)瓊脂20g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸儲(chǔ)水中，加熱溶解，調(diào) ph為7.2,加入瓊脂、 酚紅，103.43kpa(15 lb)

22、20min高壓滅菌后，制成平板備用。 4.4綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分：蛋白月東20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油(化學(xué)純)10g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：將蛋白月東、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸儲(chǔ)水中，加溫使其溶解，調(diào) ph至7.4,加入瓊 脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68.95kpa(10 lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5 明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白月東5g明膠120g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：取各成分加到蒸儲(chǔ)水中浸泡20min,隨時(shí)攪拌加溫使之溶解，調(diào) ph至7.4,分裝于試管內(nèi)，經(jīng) 68.95kpa(10 lb)20min滅菌后，直立制成高層備用。 4.6 硝酸

23、鹽蛋白月東水培養(yǎng)基成分：蛋白月東10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：將蛋白月東和酵母浸膏加到蒸儲(chǔ)水中，加熱使之溶解，調(diào) ph為7.2,煮沸過(guò)濾后補(bǔ) 足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉， 溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95kpa(10 lb)20min 火菌后備用。4.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白月東10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸儲(chǔ)水1000ml制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，調(diào) ph為7.27.4,加入瓊脂，加熱溶解， 分裝試管，103.43kpa(15 lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?操作步驟5.1 增菌培養(yǎng)：取1:10

24、樣品稀釋液10ml加到90ml scdlp液體培養(yǎng)基中，置37c培養(yǎng)18h 24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。5.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷基三甲基澳化俊瓊脂平板上，置37c培養(yǎng)18h24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略 有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性 強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差。在缺乏十六烷基三甲基澳化俊培養(yǎng)基時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種 于平板上，放 37c培養(yǎng)24h,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落

25、扁平，邊緣不整，菌落 周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌不生長(zhǎng)。5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試 驗(yàn)。5.4 氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，在 15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗(yàn)陰性。5.5 綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落23個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上，置37c培養(yǎng)24h,加入氯仿3ml5ml,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液 呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另

26、一試管中并加入1mol/l的鹽酸1ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)： 挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白陳水培養(yǎng)基中，置37 c培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白月東水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽(yáng)性， 表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.7 明膠液化試驗(yàn)，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37c培養(yǎng)24h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；如凝固不溶者 為陰性。5.8 42c生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接

27、種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在4142c培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h48h,綠膿桿菌能生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生 長(zhǎng)。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長(zhǎng)，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰 性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌 素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42c生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。五、金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2 定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌(

28、staphylococcus aureus)為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀排列，無(wú)芽胞，無(wú)莢 膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽(yáng)性。該菌是葡萄球菌中對(duì)人類致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥。3儀器和設(shè)備3.1 顯微鏡。3.2 恒溫培養(yǎng)箱。3.3 離心機(jī)。3.4 刻度吸管：1ml、5ml、10ml。3.5 試管。3.6 載玻片。3.7 酒精燈。4培養(yǎng)基和試劑4.1 scdlp液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。4.2 baird parker 氏培養(yǎng)基成分： 胰蛋白月東10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(licl6h2o)5g瓊脂20g蒸儲(chǔ)水950mlph 7

29、.0 ±0.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50ml與除菌過(guò)濾的1%亞硫酸鉀溶液10ml混合，保存于 冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸儲(chǔ)水中， 加熱煮沸完全溶解，校正ph。分裝每瓶95ml , 103.43kpa 高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，每95ml加入預(yù)熱至50c的卵黃亞硫酸鉀增菌48h。劑5ml,搖勻后制成平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過(guò)4.3 血瓊脂培養(yǎng)基成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂100ml脫纖維羊血（或兔血）10ml制法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50 c左右無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.4 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白月東1

30、0g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12ml蒸儲(chǔ)水1000ml制法：將蛋白月東、氯化鈉、牛肉膏加到蒸儲(chǔ)水中，加熱溶解，調(diào) ph7.4,加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kpa（10 lb） 20min滅菌備用。4.5 兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，103.43kpa（15 lb） 30min高壓滅菌，1份加兔（人）全血4份，混勻 靜置；2000rpm3000 rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。4.6 無(wú)菌液體石蠟。5操作步驟5.1 增菌：取1:10稀釋的樣品10ml接種到90ml scdlp液體培養(yǎng)基中，置 37c培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24h

31、。5.2 分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在 baird parker平板，如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37 c培養(yǎng)24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在 baird parker平板上為圓形，光滑，凸 起，濕潤(rùn)，直徑為 2mm3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外 層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的軟度。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落， 但無(wú)混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?，?7 c培養(yǎng)24h。5.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性 菌，排列成葡萄狀，無(wú)芽胞，無(wú)夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5wm1pm。5.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入 2mm3mm的滅菌液體石蠟，置 37c培養(yǎng)24h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5 血漿凝固酶試驗(yàn)： 吸取1:4新鮮血漿0.5ml,放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml?；靹?，放37c恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時(shí)觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5ml,分別加入滅菌1:4血漿0.5ml,混勻，作為對(duì)