UPLC在藥物代謝動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用

1、uplc在藥物代謝動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用呂志祥（江蘇省丹陽(yáng)市人民醫(yī)院藥劑科212300）【摘要】超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography, uplc?s近年 來(lái)發(fā)展十分快速的以更小顆粒（粒徑一般小于2μm）為填料的液相色譜技術(shù)， 是hplc近年來(lái)技術(shù)革新的產(chǎn)物。木文對(duì)超高效液相色譜近年來(lái)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng) 用以及其成果進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】超高效液相色譜藥物代謝動(dòng)力學(xué)應(yīng)用2004年，waters公司推出了全球第一臺(tái)商業(yè)化的acquity uplctm超高效液相色譜系統(tǒng)。uplc普遍采用超高壓系統(tǒng)，壓力大于100 kpa, uplc和hplc

2、 相比有三大“超特點(diǎn)”，即超高靈敏度，超高分離度和超高速度1。首先是顆粒 度小，柱效顯著增加，分離度增加，能夠分離出更多的峰；其次是uplc色譜柱 的柱長(zhǎng)是hplc色譜柱的1/3,但兩者柱效相似，而且uplc可以在比hplc至少 高3倍的流速下進(jìn)行，導(dǎo)致結(jié)果是分離分析至少快9倍，而且uplc分離度更為 優(yōu)越。因此在柱效不損失的情況下uplc可以進(jìn)行高線性流速運(yùn)行，極大地提高 了樣品通量，適用于高通量研究；最后是高靈敏度，uplc次所需進(jìn)樣量更少， 最多僅需hplc進(jìn)樣量的30%,因而適用于微量復(fù)雜混合物的分離2。總體而言， uplc是hplc的突破與創(chuàng)新，雖彌補(bǔ)傳統(tǒng)hplc系統(tǒng)的不足，但木質(zhì)上

3、uplc和 hplc是一致的。1、在藥物代謝動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用 1.1在化學(xué)藥物代謝中的應(yīng)用a. johnso3等下利用uplc-tof-ms和hplc-tof-ms研究人尿中“對(duì)乙 酚氨基酚”代謝產(chǎn)物的效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，uplc和hplc均能檢測(cè)到對(duì) 乙酞氨基酚的硫酸化代謝產(chǎn)物，但upi尤能提供更多的色譜峰信息，且分離度、 峰寬均明顯優(yōu)于hplc； uplc能檢測(cè)到3個(gè)對(duì)乙酞氨基酚葡萄糖昔酸代謝物并根 據(jù)ms提供的碎片離子信息對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，對(duì)可能的代謝機(jī)理進(jìn)行了確證, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示uplc是分離復(fù)雜化合物的理想工具，其快速、靈敏、分離度好的 特點(diǎn)特別適合與ms聯(lián)用用于藥物代謝方面的研

4、究。單晨嘯4等建立測(cè)定人賦血漿中吔1川01(2,5-二羥甲基-3,6-二甲基 毗嗪)濃度的uplc測(cè)定方法，探討其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。用uplc法測(cè)定 給藥后大鼠血漿中l(wèi)iguzinediol的濃度，利用das軟件擬合并計(jì)算蘇藥代動(dòng)力學(xué) 參數(shù)。結(jié)果liguzinediol的血藥濃度在0.41-52.4mg/l范圍內(nèi)呈線性，提取冋收率 均80%，符合生物樣品分析要求。大鼠靜脈注射10mg/kg的liguzinediol，k血 藥濃度(c)-吋間曲線呈二室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tl/2β、auc(0-∞)、 cl分別為1.62h、18.36 (mg h)/l

5、, 0.71l/(h kg)該方法操作簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)， 可用于liguzinediol的藥代動(dòng)力學(xué)及成藥性研究。hermes licea-perez5】等利用uplc-ms/ms結(jié)合帶液液萃取及衍生化的半 自動(dòng)樣品處理技術(shù)同吋檢測(cè)人血漿中口服避孕藥中乙炔基雌二醇(ee)與左炔諾孕 酮(ln)，其濃度范圍分別為0.01-2 ng/ml與0.1-20ng/ml。該方法將6min的檢測(cè) 吋間縮短到2.7min，樣品處理量從100提高到300個(gè)，大大縮短了檢測(cè)吋間，能成功用于藥物代謝學(xué)研究。湯瑤6】等建立了大鼠血漿中磷酸西他列汀含量檢測(cè)的超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-ms/ms)分析方法

6、。以大鼠空白血漿為基質(zhì)，通過(guò)添加標(biāo)準(zhǔn)品的方 法配制含磷酸西他列汀和內(nèi)標(biāo)物氟西汀的樣品，選用甲醇為沉淀劑，經(jīng)離心除去 血漿中的蛋白質(zhì)，上清液用于b標(biāo)物的檢測(cè)。結(jié)果表明，大鼠血漿中磷酸西他列 汀的質(zhì)量濃度在l-1000μg/l范圍內(nèi)吋線性關(guān)系良好(r=0.9991),檢出限(信噪 比為3為0.2μg/l;其平均冋收率為85%-115%,滿足生物樣品檢測(cè)的要求。 將該方法初步用于大鼠靜脈注射后的血漿樣品中磷酸西他列汀的檢測(cè)。該方法快 速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，能夠用于磷酸西他列汀藥代動(dòng)力學(xué)等方面 的研究。1.2在生化藥物代謝中的應(yīng)用samuele 7等運(yùn)用uplc

7、-ms/ms測(cè)定猴血漿中的sch503034非對(duì)映異構(gòu) 體。在apci選擇性反應(yīng)檢測(cè)正離子模式下，檢測(cè)sch 503034非對(duì)映異構(gòu)體。線性范圍均在1-2500 ng/ml，異構(gòu)體回收率在2.5，50，1000 ng/ml水平吋分別為 87.2%-90.0%, 89.1%-90.4%, 92.3%-94.3%。定量限為 1 ng/ml。該方法具有更高的分析通量、靈敏度及分離度。該方法不僅能用于猴血漿，還能檢測(cè)小鼠、狗及 人血漿樣本。muhammad saeed8等利用uplc-ms/ms分析經(jīng)i, 2-萘醌或酶活化i, 2-二羥基萘與dna反應(yīng)后生成腺嘌呤n3位與鳥(niǎo)嘌呤n7位的脫嘌呤內(nèi)收體，探

8、討 了萘誘發(fā)腫瘤的機(jī)制。經(jīng)uplc-ms/ms檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鄰醌通過(guò)與dna發(fā)生i, 4-michael addition反應(yīng)是萘與一蜂芳香族化合物弱致癌作用的普遍機(jī)理。13在天然藥物代謝中的應(yīng)用shumao ni9等基于uplc–qtof/ms,對(duì)于連錢(qián)草提取物口服給藥后大鼠血漿和尿中的成分和它們的代謝物進(jìn)行篩選和鑒定。采用超高效液相色 譜(uplc)四極桿飛行吋間(qtof)和metabolynxtm軟件，并結(jié)合質(zhì)量虧損濾波器， 為藥物代謝研究提供了獨(dú)特的高通量性能，具奮優(yōu)良的質(zhì)譜準(zhǔn)確性和增強(qiáng)的mse 數(shù)據(jù)采集能力。這種快速的自動(dòng)化分析方法己成功應(yīng)用于篩選和鑒定連錢(qián)草中奮

9、效成分的吸收和代謝的研究中。連錢(qián)草提取物給大鼠口服后，結(jié)果顯示，連錢(qián)草 提取物中有21種母體化合物，提取物被吸收到大鼠的血液循環(huán)，9種母體化合 物的總共80種代謝產(chǎn)物通過(guò)質(zhì)譜圖在高或低碰撞能量掃描下并與正宗的標(biāo)準(zhǔn)和 文獻(xiàn)資料的比較，成分在體內(nèi)被初步檢測(cè)出，方法簡(jiǎn)單，可靠，可以用于快速篩 選，并確定連錢(qián)草提取物藥理作用活性成分的結(jié)構(gòu)，更好地闡明其作用機(jī)理。表 明，綜合代謝的方法，使藥物代謝研究中醫(yī)的一個(gè)有用的模板。黃勇10等建立beagle犬血漿中同吋測(cè)定原兒茶酸、異葒草素和野黃芩 苻的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。beagle犬單次股靜脈注射88mg/kg的 注射用復(fù)方葒草(凍干粉針)，分

10、吋取血處理。質(zhì)譜采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(mriv0方 式進(jìn)行檢測(cè)，用于定量分析的離子對(duì)分別為原兒茶酸m/zl09.0→m/zl52.8, 異茲草素 m/z449.2→m/z299.1、野黃咚宵 m/z463.1→m/z287.1。結(jié)果原兒 茶酸、異葒草素和野黃芩苷的線性范圍分別為0.002-0.569、0.022-5.450和0.024-5.860mg/l,方法的準(zhǔn)確度，日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性均符合要求。該方 法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，可用于原兒茶酸、異葒草素和野黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué) 研究。薛璟11等考察雷公藤甲素在大鼠腸道的吸收情況，為其安全合

11、理應(yīng)用 提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。采用大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)，利用uplc法測(cè)定雷公藤甲素 的量，分別研究吸收部位和藥物濃度對(duì)雷公藤甲素吸收的影響。4、8.3、 20μmol/l雷公藤甲素灌流液在各腸段的奮效滲透系數(shù)(peff)和10 cm腸段吸 收百分比(10cm% abs)依次為十二指腸>結(jié)腸>空腸>冋腸，各腸段之間無(wú) 顯著性差異(p>0.05)。不同質(zhì)量濃度(4-20μmol/l的雷公藤甲素在腸道內(nèi)的 吸收無(wú)顯著性差異(p>0.05)。雷公藤甲素在大鼠腸道內(nèi)有較好的腸吸收，對(duì)腸 段無(wú)明顯的吸收部位選擇

12、性，一定范圍內(nèi)的藥物濃度對(duì)雷公藤甲素的peff和 10cm%abs無(wú)影響，初步判斷其吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。2、展望12-14】自2004年超高效液相色譜技術(shù)(uplc)出現(xiàn)以來(lái)，其迅速的普及應(yīng)用冋 時(shí)帶動(dòng)了相關(guān)法規(guī)的修改。隨著uplc技術(shù)的不斷普及，適用于uplc平臺(tái)的小 顆粒填料色譜柱種類將越來(lái)越多樣化，以滿足不同分析領(lǐng)域的需要。同吋， <2μm色譜柱的普及應(yīng)用促進(jìn)了液相色譜一系列配套化學(xué)試劑的進(jìn)步。包 括溶劑在內(nèi)的各類試劑將提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以適用于uplc。而uplc所使用的0.22 μm濾膜種類將越來(lái)越多。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)己成為代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)、痕量分析

13、、中藥學(xué)、天然藥 物化學(xué)中極為重要的分離分析手段。uplc是質(zhì)譜的良好入口，速度快且無(wú)須分 流，0前越來(lái)越多的分析工作者采用uplc與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析樣品。uplc的高 分離度能額外得到更多的信息，提高質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度，對(duì)于信息量大的分析如 指紋圖譜、膚譜、有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)等來(lái)說(shuō)，uplc技術(shù)的應(yīng)用將提高其分析效率。 在天然產(chǎn)物化學(xué)中，uplc的高靈敏度及高分離度能更好地指導(dǎo)制備型液相色譜 分離單體化合物。uplc技術(shù)的發(fā)展，為復(fù)雜體系中藥的分離分析提供了良好的平臺(tái)。中藥是一個(gè)復(fù)雜的未知體系，不僅化合物種類繁多、數(shù)s不明。而且含量差異大、 己知化合物少在中藥分析這個(gè)領(lǐng)域中，用于復(fù)雜未知體系樣本的分

14、離分析研究報(bào) 道很多。然而，將uplc作為藥品生產(chǎn)中的質(zhì)量控制手段并比對(duì)常規(guī)hplc的研 宄還很少。將丹參藥材中丹酚酸b的hplc分析方法轉(zhuǎn)換為uplc方法，并比對(duì) 含量測(cè)定結(jié)果，表明uplc能成功替代hplc方法測(cè)定該有效成分。超高效液相色譜(uplc)作為一種新型液相色譜技術(shù)，延伸了液相色譜的 應(yīng)用范圍。超高效液相色譜以超強(qiáng)分離能力和速度、超高靈敏度、與hplc簡(jiǎn)單 方便的方法轉(zhuǎn)換、良好的質(zhì)譜人u等特點(diǎn)為現(xiàn)代色譜分析開(kāi)創(chuàng)了廣闊的前景。參考文獻(xiàn)1 mark dawson 有效 uplc 的實(shí)現(xiàn)j.生命科學(xué)儀器,2011, 9(6):27-30.2】章斌，委子洋.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥代謝物及代謝

15、組學(xué)研究中的砬用分析j. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 32(6):658-661.3 kelly a. johnson, robert plumb. investigating the human metabolism of acetaminophen using uplc and exact mass oa-tof/ms. j. pharm. biomed anal,2005, 39:805.4】單晨嘯，李偉，文紅梅，等.uplc法測(cè)定大鼠血漿中l(wèi)iguzinediol濃度以及動(dòng) 力學(xué)研宄.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011, 27709-712.5 hermes licea-perez, sher

16、ry wang, chester l. bowen, et al. a semi- automated96-well plate method for the simultaneous determination of oral contraceptivesconcertrations in human plasma using ultra performance liquid chromatographycoupled with tandem mass spectrometry j. chromatogr. b, 2007, 852(1-2):69.6】湯瑤，李響，聞鎳，等.超高效液相色譜-

17、串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中的磷酸西他列汀j.色譜，2011, 29(6):475-480.7 samuele pedaglio, marco giulio rozio, paola misiano. et al. new perspectives inbio-analytical techniques for preclinical characterization of a drug candidate;uplc-ms/ms in invitro metabolism and pharmacokinetic studies; j. pharm. biomed anal, 2007, 44(3)

18、:665.8 muhammad saeed, sheila higginbotham, eleanor rogan, et al. formation of depurinating n3 adenine and n7 guanine adducts after reaction of i, 2-naphthoquinone or enzyme-activated i, 2-di-hydroxy naphthalene with dnaimplications for the mechanism of tumor intiation by naphthalene j. chem. biol.interact, 2007, 165(3):175.9 shumao ni, dawei qian, jin-ao duan, jianming guo, et al. uplc-qtof/