北豆根提取物中有效成分分析方法的建立

1、北豆根提取物中有效成分分析方法的建立作者：朱孝芹，韓鐵剛，張歡，劉翠哲 【摘要】目的采用酸性染料比色法測(cè)定北豆根提取物中北豆根總堿的含量，采用高效液相色譜法測(cè)定蝙蝠葛堿的 含量。方法溴甲酚綠在無(wú)水甲醇中，可與tamd直接絡(luò)合 生成綠色化合物，用于比色測(cè)定，最大吸收波長(zhǎng)為6 2 0 nhp l c法，色譜柱：discoveryc18 柱流動(dòng)相：乙腈：水：磷酸=16:84:0. 15;流速： 0. 5 m 1 m i n 1 ；檢測(cè)波長(zhǎng)：2 0 8 n m。結(jié)果酸 性染料比色法：線性范圍為64 0 yg m 1 1 , r = 0 . 9 9 9 8,平均加樣回收率為99.18%, rsd= 0

2、. 7 4 °/o； h p l c法：線性范圍為0. 010. lmg.m 1-1,r= 0.9998,平均加樣回收率為9 8.3 2 %, rsd= 0.94°%。結(jié)論建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好， 可作為北豆根提取物中t am d和蝙蝠葛堿的含量分析方【關(guān)鍵詞】北豆根總堿蝙蝠葛根酸性染料比色法高效液相色譜法abstract： obj ective t oestablishana ciddyecolorimetr icm e t h o d f o rdeterminationoftotalalka 1 o i d inmenispermumda uricum, a

3、nh p l c m e t h oi n g t o t h i i d d y e c o 1 shed. h p li o n w a s c ar y c 1 8 cdfordeterminat ionofdauric i n e . methods tamdp roduc e d g r e e n c o m b i n a t ionwi thbromocresolg reeninthecondi t ionofdehydratedethanol, accordscharacteristic, a c orimetrywasestabli c m e t hod： thesepa

4、rat rriedoutonadi scoveolumn，themobi lephasewasace toni tri lewater phosphori c a c i d，thef lowratewas 0. 5 m 1 m i n 1 , a nddet e c t ion wavelengthwa s 2 0 8 nm. results a ciddyecolorimetr icm e t h o d ： t h e 1 inearrangewas6 40 u g m 1 1，r= 0 .9998， theaveragerecoverywas99. 18%wi ththe rsd o

5、f 0 . 74%.hplcme t hod： the line arrangewaso. 01 0.1 m g m 1 1 ,r= 0 . 9998，theave rage recoveryw a s 9 8 .32%wi ththe rsd o f 0 .94 % conclusion t hi smethodi ssens i tive，accurateandreproduc ibl e，andcanbeused inana lyz ingt hecontentoftamdanddauri c ineinrmextract.k eywords : t o t a 1 a 1 k a 1

6、oid inmenispermumda uricum； dauricine; ac iddyecolorimet r y ； hplc北豆根為防己科植物蝙蝠葛menispermumdauri cum d c.的干燥根莖，其有效部位是生物堿。現(xiàn)已知北豆根中含 有近2 0種生物堿，總堿含量可達(dá)1 %以上，其中含量最高 的生物堿為蝙蝠葛堿，其含量約占總生物堿的5 0 %左右北豆根總堿對(duì)呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其對(duì)肺炎球菌效果更為顯著。其制劑北豆根片可治療急性咽炎、扁 桃體炎，經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用已收入2 0 0 5版中國(guó)藥典。 2 0 0 5版中國(guó)藥典用酸堿滴定法控制含量，終點(diǎn)不易 判斷，誤差大。本

7、實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法測(cè)定提取物中t amd的含量，采用高效液相色譜法測(cè)定提取物中蝙蝠葛堿 的含量，從而用這兩個(gè)指標(biāo)控制提取物的質(zhì)量。1器材hp 8 4 5 3紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)；ag-2 5 4 型電子分析天平；wt 0 2型電熱恒溫干燥箱；z f q- 8 5 a型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；r 2 0 0 2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；j a s c0高效液相色譜儀；北豆根飲片；北豆根堿；9 5°/。乙醇、 氨水、硫酸、三氯甲烷、無(wú)水甲醇、磷酸、酚酞為分析純; 甲醇、乙腈為色譜純。2 方法與結(jié)果2.1 酸性染料比色法測(cè)定提取物中tamd的含量22.1.1 比色原理不吸收可見(jiàn)光的無(wú)色物質(zhì)通過(guò)絡(luò) 合、氧化還原

8、等反應(yīng)生成有色物質(zhì)，可用于比色測(cè)定。實(shí)驗(yàn) 證明，溴甲酚綠在無(wú)水甲醇中，可與tamd直接絡(luò)合生成 綠色化合物，用于比色測(cè)定。2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇精密稱取蝙蝠葛堿對(duì) 照品1 0 . 0 m g置5 0 m 1容量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解， 最后用無(wú)水甲醇定容至5 0m 1，作為對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液1 . 0 m 1置1 0 m 1容量瓶中， 加入0 . 1°/。溴甲酚綠溶液0. 2ml，用無(wú)水甲醇定容， 在200700 nm進(jìn)行掃描，選擇最大吸收波長(zhǎng)，確定 最大吸收波長(zhǎng)為6 2 0 nm。2.1.3 顯色劑用量的考察分別精密吸取0 . 1 °/。 溴甲酚綠溶液

9、0. 1，0. 2，0. 3，0. 4，0. 5, 0.6, 0.7, 0.8,0. 9 m 1 置 1 0 m 1 容量瓶中， 再分別加入對(duì)照品溶液1. 0ml，用無(wú)水甲醇定容，在6 2 0 nm處測(cè)定吸收度。結(jié)果見(jiàn)表1。表1蝙蝠葛堿與溴酚綠絡(luò)合后的吸收度結(jié)果表明，顯色劑用量為0. 2m 1時(shí)吸收度最大，故選用顯色劑用量為0 . 2ml。2.1.4 顯色穩(wěn)定性的考察以加入0 . 1%溴甲酚 綠溶液0. 2ml的樣品為考察對(duì)象，在1 2 0 m i n內(nèi)于 6 2 0 nm處測(cè)定吸收度，隨行試劑空白。結(jié)果見(jiàn)表2。表2蝙蝠葛堿的顯色穩(wěn)定性考察平均吸收度為0 . 4 2 3，rsd為0 . 0 3

10、%，表明吸 收度在1 2 0 m i n內(nèi)沒(méi)有明顯變化。2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液 0.3,0.5,0.8,1.0,1.2,1.5,2.0 ml，置1 0 m 1容量瓶中，加入0 . 1 %溴甲酚綠溶液 0 . 2ml,于6 2 0 n m測(cè)定吸收度，隨行試劑空白。以 蝙蝠葛堿濃度c對(duì)吸收度a進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程: c=49. 9 1 a- 0 . 8 8, r= 0 . 9998，線性范 e 為 6 4 0 u g ml 1。2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)取2. 1. 5中的樣品測(cè)定吸 收度，重復(fù)測(cè)定5次，平均吸收度為0 . 4 2 3，rsd為0 . 11 0/“2.

11、1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取北豆根提取物 2. omg，置10ml容量瓶中，加無(wú)水甲醇使溶解，超 聲提取1 5 m i n，用無(wú)水甲醇定容至10ml，總堿濃度以蝙蝠葛堿計(jì)0. 185mg*ml 1。蝙蝠葛堿對(duì)照品 溶液濃度為0 . 2 m g m 1 1。分別精密吸取兩種溶液 各 0. 4，0. 5，0. 6，0. 8，1. 0ml，對(duì) 應(yīng)混合于1 0ml容量瓶中，無(wú)水甲醇定容。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 3。表3 tamd的回收率2.2 高效液相色譜法測(cè)定提取物中蝙蝠葛堿含量 32.2.1 色譜條件色譜柱：di scovery c 1 8 ；流動(dòng)相：乙腈：水：磷酸=16:84:0.15; 流速：0. 5

12、ml*min 1;波長(zhǎng) 2 0 8nm;柱溫: 室溫；進(jìn)樣量2 0 u 1 ；理論塔板數(shù)2 3 0 0。2.2.2 北豆根對(duì)照品、提取物和藥材的h p l c的圖譜見(jiàn)圖1。1北豆根對(duì)照品提取物和藥材的hplc圖譜2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取蝙蝠葛堿對(duì)照品 5. omg置2 5ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，作 為對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照溶液0 . 5，1 . 0，1 . 5， 2.0，3.0，4.0，5. 0ml 置 10ml 容量瓶中， 用流動(dòng)相稀釋至刻度，按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積對(duì)濃 度進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為：y= 1 . 5 3 x 1 0 8 x +1.18x104

13、； r= 0 . 9998，線性范圍為 0 . 01 0. lmg*ml lo2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)選用“2. 2. 3”項(xiàng)濃度為 0. 04mg*mol 1的樣品，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰 面積，平均峰面積為6 0 5 8 0 3 0，rsd為0 . 1 5 °/0。2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取1 0 . omg北 豆根提取物置5 0 m 1容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解，超聲提 取1 5 m i n，用流動(dòng)相定容，濃度為0. 0892mg*m 1 一 1。蝙蝠葛堿對(duì)照品溶液濃度為0 . 2 m g 1 1。 精密吸取樣品溶液1. 0，2.0，3.0，4.0，5.0 m 1置1 0ml

14、容量瓶中，分別加入對(duì)照品溶液0.4， 0. 8，1. 2，1. 6，2. 0ml，用流動(dòng)相定容后測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表4。表4蝙蝠葛堿的回收率 2.3 含量測(cè)定2.3.1 北豆根藥材的處理4 飲片粉碎過(guò)4 0 目篩，6 0 °c干燥。稱取1. 0 g置索氏提取器中，加入氯 仿3 0ml,氨水1 . 0ml，浸泡2 4 h。再加入氯仿5 0ml, 80 °(3水浴回流3 h，水浴蒸干氯仿。殘?jiān)脽o(wú)水 甲醇溶解，溶液轉(zhuǎn)移置5 0 m 1容量瓶中，無(wú)水甲醇定容， 作為備試溶液。2.3.2 北豆根提取物的處理精密稱取北豆根提取 物2. 0 m g s 1 0 m 1容量瓶中，加無(wú)水甲醇

15、溶解，過(guò)濾，洗滌容器及濾器3次，合并濾液及洗液，用無(wú)水甲醇定容至 10ml備用。2.3.3 北豆根藥材中t amd的測(cè)定取備試溶液 1. 0ml置1 0ml容量瓶中，加入0. 1%溴甲酚綠溶 液0 . 2 m 1，用無(wú)水甲醇定容，于6 2 0 n m測(cè)定吸收度， 隨行試劑空白。根據(jù)回歸方程計(jì)算t amd含量。經(jīng)測(cè)定， 本實(shí)驗(yàn)所選用的北豆根藥材中tamd含量為1.23%。2.3.4 北豆根藥材中蝙蝠葛堿的測(cè)定取備試溶液 3 . 0 m 1置1 0 m 1容量瓶中，揮干甲醇，加入流動(dòng)相適 量，振搖使溶解后用流動(dòng)相定容。照色譜條件測(cè)定峰面積。 根據(jù)回歸方程計(jì)算蝙蝠葛堿含量。經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)所選用的 北

16、豆根藥材中蝙蝠葛堿的含量占tamd的4 5 . 7 6 %。2.3.5 北豆根提取物中t amd的測(cè)定取備試溶 液0. 5m 1置1 0m 1容量瓶中加入0 . 1 %溴甲酚綠溶 液0 . 2 m 1，用無(wú)水甲醇定容，于6 2 0 n m測(cè)定吸收度， 隨行試劑空白。根據(jù)回歸方程計(jì)算t amd含量。經(jīng)測(cè)定， 本實(shí)驗(yàn)所得到的北豆根提取物中tamd含量為92. 72.3.6 北豆根提取物中蝙蝠葛堿的測(cè)定取備試溶液2. 0 m 1置1 0 m 1容量瓶中，揮干甲醇，加入流動(dòng)相 適量，振搖使溶解后用流動(dòng)相定容。照色譜條件測(cè)定峰面積。 根據(jù)回歸方程計(jì)算蝙蝠葛堿含量。經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)所得到的北豆根提取物中蝙蝠葛堿的含量占tamd的4 8. 0 6 0/oo3討論中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究一直是中藥現(xiàn)代化研究中的重要 組成部分。由于中藥成分復(fù)雜或有效成分不明確，有些直接 以原藥材或粗提物入藥，使得很多中藥的含量測(cè)定成為難點(diǎn)。 近年來(lái)，一些現(xiàn)代化技術(shù)的應(yīng)用推動(dòng)了中藥有效成分的提取、 分離和含量測(cè)定的研究。中國(guó)藥典2 0 0 5版收錄的北 豆根片中只規(guī)定了 t amd的含量測(cè)定，方法為酸堿滴定法。由于各地北豆根藥材中，t amd的組成有差別4只控制t a m d的含量尚不能全面反映制劑所需的原料和 成品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了單體蝙蝠葛堿在總堿中的含量， 進(jìn)一步完善了提取物和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。酸堿滴定法操作復(fù) 雜，