利用熒光顯微技術(shù)研究生物單子

1、利用熒光顯微技術(shù)研究生物單分子利用熒光顯微技術(shù)研究生物單分子陳浩200425023 分析化學專業(yè)光學單分子方法的進展光學單分子方法的進展 近20 年來, 光學探測方法有了長足的進步。在80 年代出現(xiàn)并逐漸成熟起來的近場顯微術(shù)為超衍射極限分辨成像提供了基本手段, 同時也使光學顯微術(shù)進入了納米科學的領域。而共焦顯微術(shù)不僅突破傳統(tǒng)光學的衍射極限, 而且為光學探測引入了第三維空間信息, 使光學探測具有了層析能力, 實現(xiàn)了真正的空間三維成像。 超短脈沖激光技術(shù)直接導致了多光子熒光顯微術(shù)的成功。尤其是飛秒激光激發(fā)的熒光顯微術(shù), 對于提取時間分辨的信息是有力的工具。這種熒光單分子探測及單分子光譜探測與其數(shù)據(jù)

2、處理方法的組合, 形成了熒光共振能量轉(zhuǎn)移的探測方法。通過該方法可以獲得1.5 納米 8 納米的空間分辨率的構(gòu)像信息, 達到光學方法上最高的分辨率。 以上近場、共焦、熒光顯微術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移四種基本技術(shù)構(gòu)成了目前活躍的生物單分子探測的光學平臺。myosin v 的分子結(jié)構(gòu)肌球蛋白是包含18個不同子類的一大類蛋白分子馬達，但構(gòu)型上都屬于二聚體，有兩個明顯伸出的“頭”，用于附著在肌球蛋白絲上，這里我們干脆稱之為“腿”。myosin v 的兩種運動模型(1)在hand-over-hand模型中，后腿向前移動了74nm，而前腿沒有移動。分子本身移動了37nm，染料移動了372xnm，(如果myosi

3、nv的結(jié)構(gòu)是不對稱的，x為染料到軸的平均距離)。(2)在inchworm模型中，myosin 分子的所有部份都向前移動37nm，并且有一個頭始終與肌球蛋白絲結(jié)合在一起。單分子熒光技術(shù)檢測運動模型 把一個熒光分子標記在myosin v 的一條腿上，再用熒光顯微鏡來對標記的熒光分子進行檢測。據(jù)此來研究myosin v的邁步過程。具體檢測技術(shù)：全內(nèi)反射熒光顯微共聚焦熒光顯微遠場和近場光學檢測主動或被動發(fā)光的原因是物體受激發(fā)之后,內(nèi)部電偶極躍遷引起電磁場的輻射,電磁波從物體表面向自由空間傳播。物體表面以外的場分布可以劃分為兩個區(qū)域: 距物體表面僅幾個波長內(nèi)區(qū)域,這一區(qū)域稱為近場區(qū)域; 近場區(qū)域以外到無

4、窮遠是遠場區(qū)。 常規(guī)激發(fā)和收集均處于遠場區(qū)域。在遠場區(qū)域只存在可以向無窮遠傳播的遠場波(也稱為輻射波) 。近場區(qū)域光場包括了限于表面僅幾個波長內(nèi)存在的成分,即近場波(也稱為非輻射波) ;又包括遠場波。近場波也被稱為衰逝波,(隱失波) ,其強度隨離開表面距離指數(shù)衰減,不能在自由空間存在。近場波體現(xiàn)了光在傳播過程中,遇到空間光學性質(zhì)不連續(xù)時,光波的空間瞬態(tài)變化,這種變化很快在空間衰減,它反映了空間光學性質(zhì)的不連續(xù)性。全內(nèi)反射顯微光在光密介質(zhì)中傳輸, 如果它以大于臨界角的角度入射到另一個折射率較小的介質(zhì)上, 光就會發(fā)生全反射。實際上, 即使當角度 hc, 仍然會有一小部分能量以隱失波的形式穿透到液體

5、介質(zhì)中, 在“近場”情況下, 光沿平行界面?zhèn)鞑?。由全?nèi)反射產(chǎn)生近場激發(fā)照明之后, 利用共焦或?qū)拡鋈ト∠? 即構(gòu)成熒光標記全內(nèi)反射熒光顯微鏡。全內(nèi)反射顯微術(shù)典型的垂直照明深度全內(nèi)反射顯微術(shù)典型的垂直照明深度100nm100nm。這么薄的光學層析層切片意。這么薄的光學層析層切片意味著信噪比比共焦系統(tǒng)好得多味著信噪比比共焦系統(tǒng)好得多, , 細胞的光損傷和光漂白也很小。其圖像是通細胞的光損傷和光漂白也很小。其圖像是通過過ccd ccd 相機來捕獲的。這種儀器很靈敏或成像速度很快相機來捕獲的。這種儀器很靈敏或成像速度很快( (但很少有但很少有ccd ccd 相相機兼有以上兩個優(yōu)點機兼有以上兩個優(yōu)點) ,

6、) ,目前可達到的量子產(chǎn)率已到目前可達到的量子產(chǎn)率已到 80% , 80% , 成像速率成像速率200200幀幀/ / 秒。秒。共聚焦顯微 在光學成像系統(tǒng)中利用兩個焦點來生成物體的象。一個焦點為使用顯微鏡物鏡把入射的激光在物體表面或內(nèi)部形成的。這個焦點便是一個象點，也是一個點光源。它可以是反射的光，也可以是物體受激發(fā)發(fā)出的熒光。這一象點再通過另一個物鏡成像在針孔孔徑上，則生成了第二個焦點。這兩個焦點是共軛的（共焦）。 通過沿x或y方向一點點地生成象點，綜合成平面圖像，再調(diào)節(jié)z方向生成象點，通過計算機合成三維圖像。所以共焦顯微鏡具有對細胞和光漂白區(qū)域進行深度三維成像的能力。 hand-over-

7、hand vs inchworm納米精度熒光成像技術(shù)fiona fluorescence imaging with one-nanometer accuracy inchworm模型預測每步的長度應該是37nm，分子本身移動也是37nm；而hand-over-hand模型觀測長度應該是分子本身移動位移的兩倍也就是74nm。為了測試這兩個運動模型，科學家開發(fā)了一種單熒光分子成像技術(shù)來定位，誤差可以小于1.5nm，并具有0.5秒的時間分辨率。同時可以拍攝幾分鐘的影像來觀察。全全內(nèi)內(nèi)反射反射熒熒光光顯顯微微(tirf)用來激發(fā)多個單個的熒光分子，并使用ccd來拍攝幀逐幀連續(xù)圖像（不存在幀間的失效時間

8、）。單納米精確熒光成像(fiona)技術(shù)比使用其它方法在常溫下對單熒光分子定位精確度提高了20倍，在成像能力上提高了10倍。probes: rb or cy3在myosin v的光鏈區(qū)用一個rb或cy3熒光分子來標記。被標記的myosin v分子被加到肌動蛋白絲，并用tirf來觀察。 熒光圖像使用0.5s的時間來收集。大概每40m*40m的區(qū)域內(nèi)有20個點可以被觀察到。每個fwhm 280nm，大約每個光斑在每張照片上有5000到10000個光子被收集到，這使我們能夠?qū)χ行膮^(qū)進行定位，偏差小于3nm，比較亮的點，偏差小于1.5nm。有些染料的閃爍導致的亮度變化可以被觀察到。quicktime

9、影片如何檢測單分子 生物單分子的尺度在1 納米10 納米, 目前熒光標記的單分子團在100 納米左右。傳統(tǒng)光學方法(遠場顯微鏡) 達到的最好分辨率是250 納米, 共焦顯微鏡的分辨率僅提高了1. 4倍 2 倍, 熒光顯微術(shù)可以再提高2 倍 4 倍, 但是仍不能達到單分子級。因此目前利用熒光遠場成像方法所揭示的大部分是熒光團的行為。在分析了大量圖像之后，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)光斑都顯示單個的熄滅，表示這是單個的分子。測出的步距只是單個被標記的myosin分子的。在沒有atp存在時，熒光光斑不移動。加入300nm atp之后可識別到有移動，且atp濃度越大，平均移動率越高。總的說來，我們觀察到49個不同的標記

10、上br的myosin v分子并檢測到總共552步。我們觀察了三個不同群體的myosin v分子群，顯示出幾種不同的步長，有74nm的，也是52/23之間變動的，或者42/33之間變動的，但沒有發(fā)現(xiàn)37nm長的。myosin v步距的統(tǒng)計檢測了38個myosin v分子的365步，每一步都是邁出74nm。其中32個分子足夠亮，可以產(chǎn)生一個大于10的信噪比snr，在總共231步中。 這些步的柱狀圖顯示平均步距為73.85.3nm(5.3nm為平均標準偏差)，這與正態(tài)分布有非常好地擬合(r 2=0.994, x2 r=1.67)。同時也檢測到了6個按52/23nm交替前進的分子，和6個按42/33交

11、替前進的分子。如果是inchworm模型，每一步的長度應該都是37nm左右。結(jié)論myosin v 的運動是遵循h(huán)and-over-hand模型的，兩個頭部交替附著在肌球蛋白絲上向前運動。 以上是一個完整的利用單分子熒光技術(shù)來檢測生物大分子的例子。animation:animation: myosin vmyosin v walkingwalking along an actin filament電子掃描成像顯微術(shù)及各類非光學的探針掃描成像顯微術(shù)均具有比光學顯微鏡更高的空間分辨能力。但它們在不同程度上存在著系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜、成像檢測環(huán)境要求苛刻及樣品處理繁瑣等困難。而且它們均不能獲得樣品重要的光學信

12、息(例如: 光的反射率、折射率、偏振態(tài)及光譜等信息) , 特別是不能進行無損傷性生物活體探測, 因而無法完全取代光學顯微成像的地位。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移該技術(shù)可以從探測到的熒光強度隨時間的變化來獲得分子之間的距離和方位的信息。它的原理如下: 兩個被不同熒光染料標記的分子或細胞的兩部分, 當它們相距在10- 100 埃時, 能量開始從給體熒光團傳遞到受體熒光團, 即產(chǎn)生能量共振現(xiàn)象, 使該受主輻射光子。探測此能量轉(zhuǎn)換的方法可以利用共焦顯微術(shù)結(jié)合全內(nèi)反射顯微術(shù)的方法。展望展望1.1. 雖然光學方法對于探測單發(fā)光團分子是足夠靈敏的雖然光學方法對于探測單發(fā)光團分子是足夠靈敏的, , 但它

13、不可能但它不可能局部化這個探測點小到可以與一個分子尺度相比的程度。為了局部化這個探測點小到可以與一個分子尺度相比的程度。為了改進分辨率縮小光孔尺寸改進分辨率縮小光孔尺寸, , 需使本來很弱的光衰減得更弱。最終需使本來很弱的光衰減得更弱。最終要求在探測中不僅是探測到單分子熒光團的存在要求在探測中不僅是探測到單分子熒光團的存在, , 而且要探測到而且要探測到單分子的結(jié)構(gòu)形狀和行為。解決該問題的途徑之一是使光學顯單分子的結(jié)構(gòu)形狀和行為。解決該問題的途徑之一是使光學顯微鏡的熒光高靈敏探測與原子力顯微術(shù)相結(jié)合。還可以借助于微鏡的熒光高靈敏探測與原子力顯微術(shù)相結(jié)合。還可以借助于光鉗進行單分子操作技術(shù)光鉗進行單分子操作技術(shù), , 并且合并光譜信息的探測。并且合并光譜信息的探測。2.2. 在增進我們對生物大分子行為及其功能關(guān)系的理解方面在增進我們對生物大分子行為及其功能關(guān)系的理解方面, ,單分子單分子熒光探測和光譜給人們以很大的希望。其最大的挑戰(zhàn)是掌握研熒光探測和光譜給人