版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、第七章第七章 外源基因在真核細(xì)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控胞中表達(dá)及調(diào)控 第一節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控 第二節(jié)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因 第三節(jié)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類第一節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控 一、真核生物基因表達(dá)的特點及優(yōu)勢 二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件第二節(jié)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因 一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記(定義) 二、二氫葉酸還原酶基因選擇標(biāo)記 三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記 四、氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇標(biāo)記 五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(xgprt)基因第三節(jié)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類 一、載體的類型 二、幾種常用的真核表達(dá)載體一、一、 真核生物基因表達(dá)的特點真核生物基
2、因表達(dá)的特點及優(yōu)勢及優(yōu)勢 1.細(xì)胞的全能性 2.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行 3.有相當(dāng)大的非編碼區(qū)(調(diào)控序列) 4.有三種不同rna聚合酶參與轉(zhuǎn)錄 5.初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能進(jìn)行剪接加工修飾 6.不存在操縱子結(jié)構(gòu) 7.基因多拷貝,功能基因分散在不同區(qū)域,分別轉(zhuǎn)錄二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件 (一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 (二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 (三)翻譯水平的調(diào)控(三)翻譯水平的調(diào)控胸苷激酶 胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶(thymidinekinase,tk)在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶,它
3、可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dtmp,繼續(xù)磷酸化生成dttp,參與dna的生物合成。一、載體的類型 1.質(zhì)粒型載體 2.病毒載體 3.整合型表達(dá)載體 4.游離型表達(dá)載體 5.瞬時表達(dá)載體 6.穩(wěn)定性表達(dá)載體 7.非復(fù)制性hsv-病毒(單純皰疹病毒hsv-型)載體 8.裂解性hsv-病毒載體二、幾種常用的真核表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 1.卸甲載體 2.穿梭載體 痘類病毒載體 hsv-單純皰疹病毒載體 1.重組病毒型載體 2.重組質(zhì)粒型載體 3.裂解型病毒載體(一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平(一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控的調(diào)控1.基因調(diào)控的順式作用元件1)啟動子2)增強子3)rna剪接信號4)負(fù)調(diào)控元件5
4、)終止子和polya信號2.基因調(diào)控的反式作用因子1)概念2)反式作用因子主要作用規(guī)律(二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控1. mrna前體加工:轉(zhuǎn)錄的mrna前體經(jīng)5加帽,3酶切加尾去除內(nèi)含子后,產(chǎn)生成熟mrna,通過核孔進(jìn)入胞質(zhì)中。2. rna編輯(rnaediting)(三)翻譯水平的調(diào)控(三)翻譯水平的調(diào)控1. 翻譯起始序列2. eif-2的磷酸化反應(yīng)3. 由模板來源的遺傳信息,進(jìn)而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質(zhì),這是生物適應(yīng)性的保護(hù)措施。順式作用元件 順式作用元件為一些能與dbp結(jié)合的特定序列dna片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點和rn
5、a聚合酶的轉(zhuǎn)錄按效應(yīng)和功能可分為啟動子、增強子、rna間接信號、負(fù)調(diào)控元件、終止子等調(diào)控元件。反式作用因子主要作用規(guī)律1.同一dna序列可被不同蛋白質(zhì)識別2.同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同dna序列發(fā)生聯(lián)系,多數(shù)是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先相互作用后,再與dna結(jié)合,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。3.反式作用因子的自身生物合成有相當(dāng)大的可變性、可塑性。反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結(jié)構(gòu)域,有兩種類型:1)通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域為識別特異dna的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域,如:鋅指結(jié)構(gòu)。2)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)域又稱轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域,如:酸性-螺旋結(jié)構(gòu)域。不同結(jié)構(gòu)域各自的特征不同結(jié)構(gòu)域各自的特征1. 通用轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合結(jié)
6、構(gòu)域1) 鋅指結(jié)構(gòu)2) 亮氨酸拉鏈3) 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(hth)4) 螺旋-環(huán)-螺旋2. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域rna編輯(rnaediting) rna編輯是在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后,能夠改變rna分子編碼特性,是與剪切形式不同的一種修飾形式,如可使mrna某位點密碼子caa轉(zhuǎn)變?yōu)閡aa,使c變u,編輯的結(jié)果形成了uaa終止密碼子,在編碼酶的作用下,除使c變u,還可在rna上添加多個u或呈單個c的添加,使前體mrna變成成熟mrna時,通過插入或替換方式,可改變和擴大原遺傳信息,編碼多種蛋白,是生物的適應(yīng)性保護(hù)。翻譯起始序列 在atg起始密碼子周圍要有5-ccacca-tgg-3保守序列,以
7、利mrna翻譯起始,若發(fā)生突變,其翻譯水平可下降10倍。在起始aug上游若有比較多的二級結(jié)構(gòu)序列,也會影響翻譯,建議外源基因的5端aug上游序列不宜過長。eif-2的磷酸化反應(yīng) eif-2為轉(zhuǎn)譯起始因子-2是蛋白質(zhì)合成起始階段13種起始因子中最為關(guān)注的因子。若轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中的質(zhì)粒dna的兩條鏈一旦都發(fā)生轉(zhuǎn)錄,就會形成雙鏈互補mrna,而激活胞內(nèi)的雙鏈rna激活的蛋白激酶(daipk)該激酶可使eif-2的-亞基磷酸化,轉(zhuǎn)譯受抑,為防止該激酶活化,常在載體上加上腺病毒的varna基因,varna是由rna聚合酶合成的小分子rna,能阻止雙鏈rna對dai激酶的激活作用,使轉(zhuǎn)譯得以正常進(jìn)行。一、胸
8、苷激酶基因選擇標(biāo)記 外源基因+載體(tk+)的重組體導(dǎo)入tk-細(xì)胞中,在hat(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)選擇培養(yǎng)基中篩選,tk-細(xì)胞因氨基喋呤抑制了dttp的合成而死亡,tk+細(xì)胞可存活,以此進(jìn)行篩選。(hsv-1的tk基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞加gcv后被殺死,如小鼠lmtk-細(xì)胞。) 注:tk+brudr因摻入后對紫外線敏感而死亡, tk-+brudr因不摻入,對紫外線不敏感而存活。二、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)選擇標(biāo)記 dhfr是合成datp和dgtp的關(guān)鍵酶。常用dhfr的cho細(xì)胞因不能合成四氫葉酸,只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長。在不含該培養(yǎng)基中導(dǎo)入該標(biāo)記基因重組
9、子,則可篩選出陽性克隆,也可將dhfr基因置在強啟動子下高表達(dá)或通過dhfr基因突變以提高抵抗高濃度氨甲喋呤(抗mtx的抗性)的能力,從而篩選陽性克隆。三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記 新霉素類似物g418抗生素,可影響80s核糖體rna功能,對細(xì)胞有毒性。新霉素抗性基因neo的載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶能使g418失活,可在含g418培養(yǎng)基中篩選重組體轉(zhuǎn)化的陽性克隆細(xì)胞。陽性克隆存活,陰性者死亡。五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(xgprt)基因 哺乳動物細(xì)胞無xgprt酶,不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸(xmp),但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt),可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸(imp
10、)。哺乳動物細(xì)胞可通過imp生成gmp。當(dāng)用imp脫氫酶抑制劑霉酚酸,抑制了gmp的合成,使細(xì)胞失去合成dna能力而死亡。 將含xgprt基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后,在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)xgprt酶,可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過xmp中間體補救合成gmp,使dna合成正常進(jìn)行,加入霉酚酸后,陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活,而未轉(zhuǎn)化的陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡,以此可用來篩選陽性細(xì)胞。1.質(zhì)粒型載體 質(zhì)粒型載體(穿梭載體):實際上是病毒質(zhì)粒型載體,共有兩套復(fù)制元件和選擇標(biāo)記,在原核中復(fù)制,真核中表達(dá)。2.病毒載體 病毒載體種類多,sv40、adv、rv、hsv-1、痘苗v??稍诿舾屑?xì)胞中復(fù)
11、制,表達(dá)外源基因,有的還可通過整合后表達(dá)。3.整合型表達(dá)載體 rv、sv40可攜帶外源基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)。4.游離型表達(dá)載體 該病毒載體是以完整的或缺陷病毒形式攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后不發(fā)生整合,可在胞漿中游離復(fù)制,表達(dá)外源基因,如痘苗v、adv。5.瞬時表達(dá)載體 瞬時表達(dá)載體(轉(zhuǎn)染后70-90h左右):含病毒復(fù)制子的病毒載體,可攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞,不整合到染色體上,只在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行暫時性表達(dá),不能隨細(xì)胞傳代,隨后逐漸降低或消失。常用sv40復(fù)制子載體,在cos細(xì)胞中表達(dá),由于載體復(fù)制,若超過104個/細(xì)胞,細(xì)胞不能承受而死亡。6.穩(wěn)定性表達(dá)載體 將外源基因與具標(biāo)記基因
12、(dhfr)病毒載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞(cho),可將基因整合到細(xì)胞染色體上,可隨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)和傳代。(cho、dukx-b11因加入氨甲喋呤而死亡,依此篩選陽性克隆。)7.非復(fù)制性hsv-病毒(單純皰疹病毒hsv-型)載體 hsv-1病毒去除極早期基因,失去復(fù)制能力,但攜帶外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后高效表達(dá),毒性小,轉(zhuǎn)染和表達(dá)能力強。8.裂解性hsv-病毒載體 hsv-1病毒去除了早期基因,而不能產(chǎn)生dna合成所需的酶,該病毒在靜止細(xì)胞中不能復(fù)制和裂解細(xì)胞,但在高度分裂活躍的細(xì)胞中(如腫瘤)可復(fù)制并裂解感染的細(xì)胞,因分裂活躍細(xì)胞可提供病毒復(fù)制所需的dna合成酶,復(fù)制時只殺死腫瘤細(xì)胞,對正常細(xì)胞無損害。逆轉(zhuǎn)
13、錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是rna單鏈,pol基因產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶,使單鏈生成雙鏈。有5、3的u3ru5的長末端重復(fù)序列,有tata強啟動子和加尾功能,經(jīng)體外包裝,可整合表達(dá)。穿梭質(zhì)粒載體組裝基因后,可由輔助病毒協(xié)助或經(jīng)體外細(xì)胞包裝,形成具感染性假病毒顆粒,再感染宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。痘類病毒載體 已用于構(gòu)建多價活疫苗載體(hbsag、ha、狂犬、hav、麻疹v、hsv-、ebv等。該載體的雙鏈dna的大病毒載體,組裝量大,安全,可在細(xì)胞獨立復(fù)制,表達(dá)。1.重組病毒型載體 在hsv-1非必需區(qū)插入外源基因的重組體dna與野毒株共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可發(fā)生同源重組,通過lacz篩選,轉(zhuǎn)染效率高,無需輔助病毒,但有
14、毒性作用。啟動子 大多位于基因5端上游區(qū),是一種與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5端dna序列,在-30bp區(qū)有tatabox,可引導(dǎo)rna聚合酶轉(zhuǎn)錄起始,在-70-80bp區(qū)還有g(shù)cbox,可協(xié)同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率。 常用的啟動子有rsv啟動子、cmv啟動子、sv40早期啟動子。增強子 增強子是一類可使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的順式作用元件,本身無啟動子活性,可獨立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部,可進(jìn)行遠(yuǎn)距離增強啟動作用,而且無方向性。它有特征性序列,常由812bp組成,以單拷貝或多拷貝的形式存在。 增強子可使轉(zhuǎn)錄效率增強10-100倍,通常來源于sv40、rsv或cmv病毒。一旦增強子
15、的作用使表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性時,最好改用誘導(dǎo)型啟動子來表達(dá)外源基因,如熱休克啟動子、金屬硫蛋白啟動子。rna剪接信號 雖然cdna來源的基因轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞后,其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響,但在該細(xì)胞中表達(dá)最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號,以提供對cdna基因表達(dá)的需要,常用sv40的小t抗原的內(nèi)含子序列來作為cdna中的內(nèi)含子剪接序列。負(fù)調(diào)控元件 沉默子和衰減子為轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件,它們與反式作用因子相互作用而起作用,不受距離、方向、基因來源的限制。終止子和polya信號 真核基因轉(zhuǎn)錄的確切終止信號和終止機制目前尚不清楚,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在模板dna分子3端有一終止序列,稱終止子,產(chǎn)生具有polya尾的轉(zhuǎn)錄
16、序列,在dna區(qū)域內(nèi)g/t簇。如sv40中的終止子序列為aggtttttt的dna序列,并有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。 polya可使mrna穩(wěn)定其多聚腺苷酸化需要兩種序列:位于polya位點下游的gu或u豐富區(qū),位于polya上游11-30bp處的6bp高度保守序列(5-aauaaa)與轉(zhuǎn)錄后的rna切割和加尾有關(guān)。反式作用因子的概念 反式作用因子是一組能直接或間接地與dna的順式作用元件特定序列結(jié)合,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白,即dna結(jié)合蛋白(dbp),dbp又稱轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,tf)分通用轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類?;虮磉_(dá)的組織特異性及細(xì)胞周期特異性
17、受上述元件和因子的相互作用所決定,通用轉(zhuǎn)錄因子中識別tatabox的為tfd,可與rna聚合酶結(jié)合使轉(zhuǎn)錄起始,識別gcbox的dbp為sp1,可調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。鋅指結(jié)構(gòu) 鋅指(zinefinger)結(jié)構(gòu):由兩個半胱氨酸(cys)和兩個組氨酸(his)殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu),表面暴露的堿基及其極性氨基酸與dna結(jié)合有關(guān)。一個蛋白分子有2-9個鋅指重復(fù)單位,由指部堿基或極性氨基酸(賴氨酸lys、精氨酸arg)結(jié)合于dna雙螺旋的深溝內(nèi)。結(jié)構(gòu)域為以鋅輔基螯和形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈 亮氨酸拉鏈(leucinezipper,lz):為兩組走向平行帶亮氨酸的-螺旋形成的對稱二聚體,每個亞基含4個亮氨酸,每2個leu之間相隔6個氨基酸。于-螺旋的某一側(cè)面,每2圈(3.6堿基/圈)就出現(xiàn)一個leu,排成一排,使2個-螺旋蛋白分子間形成一條拉鏈,只有在形成二聚體拉鏈后,鏈上富含的堿性氨基酸區(qū)可與dna結(jié)合。 結(jié)構(gòu)域為鏈上堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(hth) 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix,hth):此-螺旋中含堿性氨基酸較多,其所帶的正電
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 醫(yī)療機構(gòu)疫情防控應(yīng)急預(yù)案
- Unit 1單元話題拓展閱讀“學(xué)校課程”(含答案)譯林版三起
- 英語視聽說(1)學(xué)習(xí)通超星期末考試答案章節(jié)答案2024年
- 藥物應(yīng)用學(xué)習(xí)通超星期末考試答案章節(jié)答案2024年
- 農(nóng)村電子商務(wù)發(fā)展模式摸索
- 公共場所緊急疏散預(yù)案
- 玩電子游戲用手持裝置項目可行性實施報告
- 熱身服相關(guān)項目建議書
- 電視機項目可行性實施報告
- 企業(yè)知識產(chǎn)權(quán)管理手冊
- 英語面試介紹我的家鄉(xiāng)-浙江省諸暨市
- 小學(xué)道德與法治-行行出狀元教學(xué)課件設(shè)計
- 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D圖標(biāo)庫課件
- 二氧化碳安全技術(shù)說明書MSDS
- 定稿過敏性紫癜等6種疾病診療指南
- 2023年四川高考真題及答案理科數(shù)學(xué)
- 六年級上冊數(shù)學(xué)課件西師大版 按比例分配的方法解決實際問題
- 2023年全國初中數(shù)學(xué)聯(lián)合競賽試題及參考答案
- WS/T 89-2015尿中氟化物測定離子選擇電極法
- (新平臺)國家開放大學(xué)《農(nóng)村社會學(xué)》形考任務(wù)1-4參考答案
- GB/T 41013-2021電機系統(tǒng)能效評價
評論
0/150
提交評論