外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控

1、第七章第七章 外源基因在真核細(xì)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控胞中表達(dá)及調(diào)控 第一節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控 第二節(jié)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因 第三節(jié)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類第一節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控 一、真核生物基因表達(dá)的特點及優(yōu)勢 二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件第二節(jié)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因 一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記（定義） 二、二氫葉酸還原酶基因選擇標(biāo)記 三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記 四、氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇標(biāo)記 五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（xgprt）基因第三節(jié)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類 一、載體的類型 二、幾種常用的真核表達(dá)載體一、一、 真核生物基因表達(dá)的特點真核生物基

2、因表達(dá)的特點及優(yōu)勢及優(yōu)勢 1.細(xì)胞的全能性 2.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行 3.有相當(dāng)大的非編碼區(qū)（調(diào)控序列） 4.有三種不同rna聚合酶參與轉(zhuǎn)錄 5.初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能進(jìn)行剪接加工修飾 6.不存在操縱子結(jié)構(gòu) 7.基因多拷貝，功能基因分散在不同區(qū)域，分別轉(zhuǎn)錄二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件 （一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 （二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 （三）翻譯水平的調(diào)控（三）翻譯水平的調(diào)控胸苷激酶 胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidinekinase,tk）在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶,它

3、可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dtmp,繼續(xù)磷酸化生成dttp,參與dna的生物合成。一、載體的類型 1.質(zhì)粒型載體 2.病毒載體 3.整合型表達(dá)載體 4.游離型表達(dá)載體 5.瞬時表達(dá)載體 6.穩(wěn)定性表達(dá)載體 7.非復(fù)制性hsv-病毒（單純皰疹病毒hsv-型）載體 8.裂解性hsv-病毒載體二、幾種常用的真核表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 1.卸甲載體 2.穿梭載體 痘類病毒載體 hsv-單純皰疹病毒載體 1.重組病毒型載體 2.重組質(zhì)粒型載體 3.裂解型病毒載體（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控的調(diào)控1.基因調(diào)控的順式作用元件1)啟動子2)增強子3)rna剪接信號4)負(fù)調(diào)控元件5

4、)終止子和polya信號2.基因調(diào)控的反式作用因子1)概念2)反式作用因子主要作用規(guī)律（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控1. mrna前體加工：轉(zhuǎn)錄的mrna前體經(jīng)5加帽，3酶切加尾去除內(nèi)含子后，產(chǎn)生成熟mrna，通過核孔進(jìn)入胞質(zhì)中。2. rna編輯（rnaediting）（三）翻譯水平的調(diào)控（三）翻譯水平的調(diào)控1. 翻譯起始序列2. eif-2的磷酸化反應(yīng)3. 由模板來源的遺傳信息，進(jìn)而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質(zhì)，這是生物適應(yīng)性的保護(hù)措施。順式作用元件 順式作用元件為一些能與dbp結(jié)合的特定序列dna片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點和rn

5、a聚合酶的轉(zhuǎn)錄按效應(yīng)和功能可分為啟動子、增強子、rna間接信號、負(fù)調(diào)控元件、終止子等調(diào)控元件。反式作用因子主要作用規(guī)律1.同一dna序列可被不同蛋白質(zhì)識別2.同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同dna序列發(fā)生聯(lián)系，多數(shù)是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先相互作用后，再與dna結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。3.反式作用因子的自身生物合成有相當(dāng)大的可變性、可塑性。反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結(jié)構(gòu)域，有兩種類型：1)通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域為識別特異dna的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如：鋅指結(jié)構(gòu)。2)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)域又稱轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，如：酸性-螺旋結(jié)構(gòu)域。不同結(jié)構(gòu)域各自的特征不同結(jié)構(gòu)域各自的特征1. 通用轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合結(jié)

6、構(gòu)域1) 鋅指結(jié)構(gòu)2) 亮氨酸拉鏈3) 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（hth）4) 螺旋-環(huán)-螺旋2. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域rna編輯（rnaediting） rna編輯是在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后，能夠改變rna分子編碼特性，是與剪切形式不同的一種修飾形式，如可使mrna某位點密碼子caa轉(zhuǎn)變?yōu)閡aa，使c變u，編輯的結(jié)果形成了uaa終止密碼子，在編碼酶的作用下，除使c變u，還可在rna上添加多個u或呈單個c的添加，使前體mrna變成成熟mrna時，通過插入或替換方式，可改變和擴大原遺傳信息，編碼多種蛋白,是生物的適應(yīng)性保護(hù)。翻譯起始序列 在atg起始密碼子周圍要有5-ccacca-tgg-3保守序列，以

7、利mrna翻譯起始，若發(fā)生突變，其翻譯水平可下降10倍。在起始aug上游若有比較多的二級結(jié)構(gòu)序列，也會影響翻譯，建議外源基因的5端aug上游序列不宜過長。eif-2的磷酸化反應(yīng) eif-2為轉(zhuǎn)譯起始因子-2是蛋白質(zhì)合成起始階段13種起始因子中最為關(guān)注的因子。若轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中的質(zhì)粒dna的兩條鏈一旦都發(fā)生轉(zhuǎn)錄，就會形成雙鏈互補mrna，而激活胞內(nèi)的雙鏈rna激活的蛋白激酶（daipk）該激酶可使eif-2的-亞基磷酸化，轉(zhuǎn)譯受抑，為防止該激酶活化，常在載體上加上腺病毒的varna基因，varna是由rna聚合酶合成的小分子rna，能阻止雙鏈rna對dai激酶的激活作用，使轉(zhuǎn)譯得以正常進(jìn)行。一、胸

8、苷激酶基因選擇標(biāo)記 外源基因+載體(tk+)的重組體導(dǎo)入tk-細(xì)胞中，在hat（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基中篩選，tk-細(xì)胞因氨基喋呤抑制了dttp的合成而死亡，tk+細(xì)胞可存活，以此進(jìn)行篩選。（hsv-1的tk基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞加gcv后被殺死，如小鼠lmtk-細(xì)胞。） 注：tk+brudr因摻入后對紫外線敏感而死亡， tk-+brudr因不摻入，對紫外線不敏感而存活。二、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇標(biāo)記 dhfr是合成datp和dgtp的關(guān)鍵酶。常用dhfr的cho細(xì)胞因不能合成四氫葉酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長。在不含該培養(yǎng)基中導(dǎo)入該標(biāo)記基因重組

9、子，則可篩選出陽性克隆，也可將dhfr基因置在強啟動子下高表達(dá)或通過dhfr基因突變以提高抵抗高濃度氨甲喋呤（抗mtx的抗性）的能力，從而篩選陽性克隆。三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記 新霉素類似物g418抗生素，可影響80s核糖體rna功能，對細(xì)胞有毒性。新霉素抗性基因neo的載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶能使g418失活，可在含g418培養(yǎng)基中篩選重組體轉(zhuǎn)化的陽性克隆細(xì)胞。陽性克隆存活，陰性者死亡。五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（xgprt）基因 哺乳動物細(xì)胞無xgprt酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（xmp），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hgprt），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（imp

10、）。哺乳動物細(xì)胞可通過imp生成gmp。當(dāng)用imp脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了gmp的合成，使細(xì)胞失去合成dna能力而死亡。 將含xgprt基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)xgprt酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過xmp中間體補救合成gmp，使dna合成正常進(jìn)行，加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉(zhuǎn)化的陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細(xì)胞。1.質(zhì)粒型載體 質(zhì)粒型載體（穿梭載體）：實際上是病毒質(zhì)粒型載體，共有兩套復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，在原核中復(fù)制，真核中表達(dá)。2.病毒載體 病毒載體種類多，sv40、adv、rv、hsv-1、痘苗v?？稍诿舾屑?xì)胞中復(fù)

11、制，表達(dá)外源基因，有的還可通過整合后表達(dá)。3.整合型表達(dá)載體 rv、sv40可攜帶外源基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)。4.游離型表達(dá)載體 該病毒載體是以完整的或缺陷病毒形式攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后不發(fā)生整合，可在胞漿中游離復(fù)制，表達(dá)外源基因，如痘苗v、adv。5.瞬時表達(dá)載體 瞬時表達(dá)載體（轉(zhuǎn)染后70-90h左右）：含病毒復(fù)制子的病毒載體，可攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，不整合到染色體上，只在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行暫時性表達(dá)，不能隨細(xì)胞傳代，隨后逐漸降低或消失。常用sv40復(fù)制子載體，在cos細(xì)胞中表達(dá)，由于載體復(fù)制，若超過104個/細(xì)胞，細(xì)胞不能承受而死亡。6.穩(wěn)定性表達(dá)載體 將外源基因與具標(biāo)記基因

12、（dhfr）病毒載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞（cho），可將基因整合到細(xì)胞染色體上，可隨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)和傳代。（cho、dukx-b11因加入氨甲喋呤而死亡，依此篩選陽性克隆。）7.非復(fù)制性hsv-病毒（單純皰疹病毒hsv-型）載體 hsv-1病毒去除極早期基因，失去復(fù)制能力，但攜帶外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后高效表達(dá)，毒性小，轉(zhuǎn)染和表達(dá)能力強。8.裂解性hsv-病毒載體 hsv-1病毒去除了早期基因，而不能產(chǎn)生dna合成所需的酶，該病毒在靜止細(xì)胞中不能復(fù)制和裂解細(xì)胞，但在高度分裂活躍的細(xì)胞中（如腫瘤）可復(fù)制并裂解感染的細(xì)胞，因分裂活躍細(xì)胞可提供病毒復(fù)制所需的dna合成酶，復(fù)制時只殺死腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞無損害。逆轉(zhuǎn)

13、錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是rna單鏈，pol基因產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶，使單鏈生成雙鏈。有5、3的u3ru5的長末端重復(fù)序列，有tata強啟動子和加尾功能，經(jīng)體外包裝，可整合表達(dá)。穿梭質(zhì)粒載體組裝基因后，可由輔助病毒協(xié)助或經(jīng)體外細(xì)胞包裝，形成具感染性假病毒顆粒，再感染宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。痘類病毒載體 已用于構(gòu)建多價活疫苗載體（hbsag、ha、狂犬、hav、麻疹v、hsv-、ebv等。該載體的雙鏈dna的大病毒載體，組裝量大，安全，可在細(xì)胞獨立復(fù)制，表達(dá)。1.重組病毒型載體 在hsv-1非必需區(qū)插入外源基因的重組體dna與野毒株共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可發(fā)生同源重組，通過lacz篩選，轉(zhuǎn)染效率高，無需輔助病毒，但有

14、毒性作用。啟動子 大多位于基因5端上游區(qū)，是一種與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5端dna序列，在-30bp區(qū)有tatabox，可引導(dǎo)rna聚合酶轉(zhuǎn)錄起始，在-70-80bp區(qū)還有g(shù)cbox，可協(xié)同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率。 常用的啟動子有rsv啟動子、cmv啟動子、sv40早期啟動子。增強子 增強子是一類可使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的順式作用元件，本身無啟動子活性，可獨立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離增強啟動作用，而且無方向性。它有特征性序列，常由812bp組成，以單拷貝或多拷貝的形式存在。 增強子可使轉(zhuǎn)錄效率增強10-100倍，通常來源于sv40、rsv或cmv病毒。一旦增強子

15、的作用使表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性時，最好改用誘導(dǎo)型啟動子來表達(dá)外源基因，如熱休克啟動子、金屬硫蛋白啟動子。rna剪接信號 雖然cdna來源的基因轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞后，其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響，但在該細(xì)胞中表達(dá)最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號，以提供對cdna基因表達(dá)的需要，常用sv40的小t抗原的內(nèi)含子序列來作為cdna中的內(nèi)含子剪接序列。負(fù)調(diào)控元件 沉默子和衰減子為轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件，它們與反式作用因子相互作用而起作用，不受距離、方向、基因來源的限制。終止子和polya信號 真核基因轉(zhuǎn)錄的確切終止信號和終止機制目前尚不清楚，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在模板dna分子3端有一終止序列，稱終止子，產(chǎn)生具有polya尾的轉(zhuǎn)錄

16、序列，在dna區(qū)域內(nèi)g/t簇。如sv40中的終止子序列為aggtttttt的dna序列，并有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。 polya可使mrna穩(wěn)定其多聚腺苷酸化需要兩種序列：位于polya位點下游的gu或u豐富區(qū)，位于polya上游11-30bp處的6bp高度保守序列（5-aauaaa）與轉(zhuǎn)錄后的rna切割和加尾有關(guān)。反式作用因子的概念 反式作用因子是一組能直接或間接地與dna的順式作用元件特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白，即dna結(jié)合蛋白（dbp），dbp又稱轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,tf）分通用轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類?；虮磉_(dá)的組織特異性及細(xì)胞周期特異性

17、受上述元件和因子的相互作用所決定，通用轉(zhuǎn)錄因子中識別tatabox的為tfd，可與rna聚合酶結(jié)合使轉(zhuǎn)錄起始，識別gcbox的dbp為sp1，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。鋅指結(jié)構(gòu) 鋅指（zinefinger）結(jié)構(gòu)：由兩個半胱氨酸（cys）和兩個組氨酸（his）殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與dna結(jié)合有關(guān)。一個蛋白分子有2-9個鋅指重復(fù)單位，由指部堿基或極性氨基酸（賴氨酸lys、精氨酸arg）結(jié)合于dna雙螺旋的深溝內(nèi)。結(jié)構(gòu)域為以鋅輔基螯和形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈 亮氨酸拉鏈（leucinezipper，lz）：為兩組走向平行帶亮氨酸的-螺旋形成的對稱二聚體，每個亞基含4個亮氨酸，每2個leu之間相隔6個氨基酸。于-螺旋的某一側(cè)面，每2圈（3.6堿基/圈）就出現(xiàn)一個leu，排成一排，使2個-螺旋蛋白分子間形成一條拉鏈，只有在形成二聚體拉鏈后，鏈上富含的堿性氨基酸區(qū)可與dna結(jié)合。 結(jié)構(gòu)域為鏈上堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（hth） 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，hth）：此-螺旋中含堿性氨基酸較多，其所帶的正電