代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

1、代謝組學(xué)技術(shù)流程:卑f 荷擔(dān)代審網(wǎng)1一、GC-MS代謝組學(xué)【實(shí)驗(yàn)方案】檢測平臺：Agilent7890/5975?氣-質(zhì)聯(lián)用儀操作步驟（以血清為例）：取100此 血清于1.5mL EP管，加入75丄內(nèi)標(biāo)（氯苯丙氨酸，0.1mg/mL）, 再加入800丄甲醇和100 pL去離子水。將溶液充分混旋使血清中蛋白析出，在室溫下超聲5min。在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，分離蛋白。取800 pL上清液于4mL氣相進(jìn)樣瓶中，在氮?dú)庀聦⑷芤和耆蹈?。再?入100 pL硅烷化衍生試劑（BSTFA與乙酸乙酯體積比為1:1的混合溶液），90° C下反應(yīng)1h。冷卻至室溫后， 取1 pL進(jìn)入G

2、C/MS分析。【數(shù)據(jù)分析方案】1. 數(shù)據(jù)預(yù)處理以內(nèi)標(biāo)做參照，通過使用自主研發(fā)的專利軟件，對質(zhì)譜峰進(jìn)行對齊，得岀校正后的數(shù)據(jù);2. 差異分析p閾值，判斷p值小于閾值的化用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算每種化合物在不同樣品組中差異的顯著性，設(shè)置 合物為檢測含量有顯著差異的化合物；3. 聚類分析用聚類方法對差異結(jié)果進(jìn)行同源聚類，通過聚類圖展示各樣本間的關(guān)系:#4. PCA 分析(principal component analysis )通過對有顯著性差異的化合物數(shù)據(jù)做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低維度空間反映樣品之間的關(guān)系。用score plot 展示PCA分析結(jié)果。5. ROC診斷分析ROC曲線(rec

3、eiver operating characteristic curve)又稱受試者工作特征曲線該方法廣泛用于醫(yī)學(xué)診斷性能的評價(jià)， 將靈敏度設(shè)為縱軸，特異性設(shè)在橫軸，該曲線下的積分面積大 小與診斷試驗(yàn)的優(yōu)劣密切相關(guān)：二、LC-MS代謝組學(xué)【實(shí)驗(yàn)方案】檢測平臺： Waters ACQUITY? UPLC 系統(tǒng)操作步驟(以尿液為例)：在室溫下對凍存的尿液樣 本進(jìn)行解凍，然后添加 2倍4'C去離子水稀釋，蝸旋混合后過0.22微米濾膜，對所得濾液進(jìn)行液質(zhì)分析。進(jìn)樣量為5微升，樣本運(yùn)行按照隨機(jī)順序進(jìn)行。【數(shù)據(jù)分析方案】1.數(shù)據(jù)預(yù)處理對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，對齊，歸一化分析, 通過原始基峰離子(BPI

4、)色譜圖，初步觀察儀器 的保留時(shí)間重現(xiàn)性，所測得的物質(zhì)數(shù)量，以及 不同組之間的色譜圖是否具有較明顯的差異。2.聚類分析用聚類方法對差異結(jié)果進(jìn)行同源聚類，通過 聚類圖展示各樣本間的關(guān)系，并觀察組間的分離 關(guān)系。3. PCA 分析(principal component analysis )iHiiaaaaaiiiiHaaa”一上田通過對有顯著性差異的化合物數(shù)據(jù)做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低維度空間反映樣品之間的關(guān)系。在正式多維統(tǒng)計(jì) 前,先對所有歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均中心化和Pareto-scaling預(yù)處E -QD -M -3D -20 -HD 町 141 2D 30 4D 5D SD&g

5、t; TO31H NMR圖理，用score plot 展示PCA分析結(jié)果4. PLS-DA 分析一種用偏最小二乘法回歸作為核心算法的分類計(jì)算方法，其 最終結(jié)果返回的是回歸因子，根據(jù)其返回結(jié)果進(jìn)行類別判斷。我 們能根據(jù)PLS-DA對所建模型的對外預(yù)測能力進(jìn)行評價(jià)。5. 差異化合物篩選根據(jù)PLS-DA模型的VIP值大于1，且的p值小于0.05的原則獲得差異性物質(zhì)，如下表所示:均值對數(shù)比中值對數(shù)比保留時(shí)間(min)質(zhì)荷比p value (ttest)(B/A)(B/A)0.67203.05223.69ET01.6161.7514.24447.09230.0026771.3451.9347.51373

6、.27360.0019790.5670.7440.71114.06550.000230.5820.648幾個(gè)代表性物質(zhì)的Box plot如下所示：#1H NMR圖#1H NMR圖6. 差異化合物鑒定我們搜索Metlin數(shù)據(jù)庫(Mass tolerance < 0.1 Da )，獲得一些可能的物質(zhì)信息。目前對液質(zhì)分析獲得的化合物的定性方法還主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品的比對來判定，因此定性工作將面臨巨 大的挑戰(zhàn)。我公司可對化合物進(jìn)行進(jìn)一步定性，如有需要可聯(lián)系公司相關(guān)區(qū)域銷售代表。三、NMR代謝組學(xué)【實(shí)驗(yàn)方案】檢測平臺：NMR Varian lnova600MHz?(配置超低溫探頭) / NMR Bru

7、ker A VANCE II 600MHz?。操作步驟(以血清為例)：樣品預(yù)處理所有血清解凍后在4 °C、12000g離心10min。取0.4 mL上層血清加至5mm NMR測試管中，再加入0.1mL重水振蕩混勻。進(jìn)行 NMR測試，記錄血清樣本1H NMR譜，實(shí)驗(yàn)溫度 為25C，預(yù)飽和法壓制水峰，飽和時(shí)間為2 s。采用Carr-Purcell Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列抑制血清中較寬的蛋白質(zhì)信號。采用 2.1 s的弛豫延遲時(shí)間、8000.0 Hz的譜寬和1.000 s的采集時(shí)間?？偦夭〞r(shí)間100 ms， 累加次數(shù)128次。【數(shù)據(jù)分析方案】1. 1H NMR 圖對譜圖

8、進(jìn)行傅立葉變換，相位調(diào)整，基線 校正、去偏置等處理，結(jié)合化合物歸屬表及相 關(guān)數(shù)據(jù)庫，鑒定實(shí)驗(yàn)所檢測到的代謝產(chǎn)物。3. PCA分析為了分析各個(gè)樣品之間的關(guān)系，將校正后的數(shù)據(jù)做PCA分析（。PCA是可以將分散在n維變量上的代謝指紋圖譜信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)（主成分）上的統(tǒng)計(jì)分析方法。51H NMR圖#1H NMR圖PCAscores plot4. 組間差異代謝物統(tǒng)計(jì)對組間變化顯著的代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。實(shí)例如下表所示:Metabolitesa rPBS-LCbPBS-C LC-CGlucose: 3.19(ddc), 3.34(t), 3.40(m), 3.43(t), 3.84(

9、dd),4.48(d)0.867 0.852-0.919Valine: 0.91(d), 0.98(d)-0.844-0.770NAG: N-acetyl glycoprotein signals: 1.98(s)-0.712 0.867組間差異代謝物列表PBS-LCt15. PLS-DA 析在分析得到差異代謝物的基礎(chǔ)上，用偏最小二乘法 -判別分 析（PLS-DA識別的算法尋找一組代謝物作為生物標(biāo)志物，建立 最優(yōu)的判別模型，使達(dá)到最好的區(qū)分疾病和正常樣品的效果。PLS-DA分析圖6. OPLS-DA 分析對PLS-DA模型進(jìn)行正交矯正處理（OPLS-DA，使用SIMCA軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA，最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異。OPLS-DA使用自適換算（unit variance scaling）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。#PBSLC4020-20-40-40-2002040