大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜及其產(chǎn)ESBLs的研究

1、大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜及其產(chǎn)esbls的研宄作者：陳云波王震查長森鄒立林季敬章彭穎呂建新 【摘要】 目的了解臨床分離的54株大腸埃希菌對氨 基糖類苷類抗生素的耐藥譜及產(chǎn)esbls情況，分析氨基糖苷 類修飾酶aac(3)-ii的檢出率及該酶的一些特征。方法采用 mic法測定臨床分離的5 4株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類 抗生素的耐藥譜，用nccls推薦的酶抑制劑增強紙片擴散法 檢測產(chǎn)esbls菌株，并通過聚合酶鏈反應、克隆測序和測定 重組菌耐藥譜對aac(3)-ii基因進行研究。結(jié)果54株大腸 埃希菌對阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉 素、大觀霉素和奈替米星的耐藥率分別為

2、、; 共檢測出產(chǎn)esbls菌株34株，占; aa c(3)-ii基因在54 株大腸埃希菌中檢出率為;質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)esbls且同時檢 出 aac(3)_ii 基因。重組菌 bl21(de3)/pet26: : aac(3)-11 對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對其余5種氨基糖苷類抗 生素沒有表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)論大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥 率最高，對阿米卡星的耐藥率最低；耐氨基糖苷類抗生素的 大腸埃希菌與其產(chǎn)esbls有相關(guān)性；重組菌 bl21(de3)/pet26： aac(3)-11僅對慶大霉素和卡那霉素產(chǎn) 生耐藥?！娟P(guān)鍵詞】大腸埃希菌；氨基糖苷類抗生素；修飾酶;超廣譜0內(nèi)酰胺酶；耐藥性rese

3、arch onaminoglycosidere sistanceprofilesandproducingesblsab stract objectivet oinvestigatetheaminoglycosideresistanceprofilesandproducingesblsofclinicalescherichiacolistrainsandanalyzethecharacteristicofaac (3)-ii. methodsmictestsof7aminoglycosidesandesblsconfirmationtestswereperformed54strainsofaac

4、(3)-ilgenewasamplifiedbypcrandclonedintopet26b,thenandsequenced. activityofaac (3)-iiwastestedbymicmethod.results theresistantratesof54strainsoftoamikacin, gentamicin,kanamycin,tobramycin,streptomycin,spectinomycin,netilmicinwere%,%,%,%,%,%,%ando/o(34/54)ofstrainswerefoundproducingesbls.thepositiver

5、ateofaac (3)-iigenewas%(45/54).theaac(3)-iigeneresistancetogentamicinandkanamycin,butnotother5aminoglycosides. conclusionsfifty-fourhestresistantratetdthelowestresistanbls-producingstrai oglycoside-resistastrainsofhadthehig ogentamicinwhileha tratetoamikacin. es nsweremostlyinamin ncetheaac (3)-ilge

6、neonlymediatesresis tancetogentamicina ndkanamycin keywords escherichiacoli； aminoglycosides ； modifyingenzymes ； extended- spectru mbeta-lactamases； antibioticresistance大腸埃希菌0是條件致病菌，2 002年全國細菌耐藥性 監(jiān)測網(wǎng)對所屬5 7家三級甲等醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其臨床分離 率列第一位(%) 1。目前國內(nèi)對大腸埃希菌的多重耐藥性 已引起很大的重視，對0-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素 (aminoglycosides)的耐藥機

7、制有較多的研究，但兩者相關(guān) 性的研究還不多。以54株從臨床分離的大腸埃希菌為研究 對象，測定菌株對7種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度 (mic)及檢測其產(chǎn)超廣譜3-內(nèi)酰胺酶(esb ls),為臨床合理 有效地應用抗生素提供依據(jù)；同時克隆aac(3)-ii基因到 pet26b,檢測重組菌 bl21 (de3)/pet26： ： aac(3)_ii 對氨 基糖苷類抗生素的耐藥譜，為進一步研究aac(3)-ii基因奠 定基礎(chǔ)。1材料和方法實驗菌株及質(zhì)粒收集從xx年28月溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床送檢 的血液、腹水、尿液等無菌體液標本分離得到的大腸埃希菌，紙片法測定其對慶大霉素(gent amicin

8、，抑菌圈直徑 12mm)、 卡那霉素(kanamycin,抑菌圈直徑 13mm)和妥布霉素(tob ramycin,抑菌圈直徑 12mm )任一或以上耐藥菌共54株，其中已剔除重復菌株，細菌標記為wyd加四位流水號(如 wyd1094、wyd110 2)。細菌的分離鑒定及藥敏試驗參照全國 臨床檢驗操作規(guī)程進行，并經(jīng)法國bi o-merieux公司 vitek60細菌鑒定儀鑒定。質(zhì)控的標準菌株為大腸埃希菌 atcc25922和肺炎克雷伯菌atcc700603 ,宿主菌為bl 21(de3), pet26b為表達載體，以上菌株及質(zhì)粒均由本實驗 室保存。體外最低抑菌濃度的測定采用瓊脂稀釋法測定阿米卡

9、星(amikacin a)、慶大霉素、 妥布霉素、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(ne tilmicin)、大觀霉素(spe ctinomycin)、鏈霉素(st reptomycin)對 54 株大腸埃希菌的mic,以大腸埃希菌atcc2 5922為質(zhì)控菌株， 按clsi/nccls(xx)版解釋實驗結(jié)果2。超廣譜0 -內(nèi)酰胺酶(esbls)的檢測esbls的檢測采用nccls推薦的酶抑制劑增強紙片擴散 法。頭孢噻肟(ctx)、頭孢他啶(caz)、頭孢噻肟/克拉維酸(cd3)、頭孢他啶/克拉維酸(cd2)紙片為英國oxo id公司產(chǎn)品。單藥紙片(ctx、ca z)與相應的含酶抑制劑

10、紙片(cd3、cd2) 中任何一對的抑菌環(huán)直徑之差彡5mm為產(chǎn)esbls菌株。以大 腸埃希菌atcc25922為陰性對照株，肺炎克雷伯菌 atcc700603為陽性對照株。質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒提取試劑盒提取臨床分離菌株wyd10 94、wyd1102 的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞bl21(de3),涂布于含慶大霉 素(8ug/ml)的lb固體培養(yǎng)基中，挑取生長的單個菌落，并 分別記作為bl21/wyd1094, bl 21/wyd1102。提取轉(zhuǎn)化菌的 質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳。按“”及“”方法，對上述兩株 轉(zhuǎn)化菌對7種氨基糖苷類抗生素的mic及產(chǎn)esbls的檢測。氨基糖苷類修飾酶基因aac(3)

11、-i i的檢測自行設計aac(3)-ii基因引物，并在引物上添加酶切位 點，上游引物 5 -ggcatatgatfc atacg-cggcaaggcaat -3， (下劃線處為ndei酶切位點)，下游引物5" -ttcccctcgagctaaccgg-aaggctcgcagg-37 (下劃線處為 xhol 酶切位點)， pcr產(chǎn)物長度為877bp。采用堿裂解法提取細菌質(zhì)粒dna。5 opi的pcr反應體系中包括：10x反應緩沖液5yl、5mmo/lmgc 123 u 1、/l 的 4 種 dntpsmi x4 w 1、引物(20 u mol/l) 各2ul、taqdna聚合酶和模板p

12、l。pcr反應條件：94°c預 變性5min； 30個循環(huán)為94°c變性lmin56°c退火lmin->72°c延伸lmi n;最后延伸lomin。瓊脂糖凝膠電泳觀察pcr結(jié) 果。陽性pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后送takara公司雙向測通，序列 在genbank上比對。aac (3)-11基因的克隆及重組菌的耐藥譜 選取一份pcr陽性產(chǎn)物經(jīng)純化回收，ndei和xhol雙酶 切后與經(jīng)相同雙酶切后的表迗載體pet26b連接；連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化到bl21 (de3)感受態(tài)細胞并涂布到含卡那霉素25 u g/ml 的lb固體培養(yǎng)基中；挑取生長的單個菌落，經(jīng)pcr和 nd

13、el-xhol雙酶切證實為重組菌bl21(de3)/p et26 : aac(3)-ii;采用瓊脂稀釋法測定上7種氨基糖苷類抗生素的 mic,同時以 bl21(de3)和bl21(de3)/pet26b 為對照，大腸 埃希菌atcc25922為質(zhì)控菌株，結(jié)果解釋同前。2結(jié)果大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的mi c 紙片法示54株大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素和妥 布霉素其中一種或以上耐藥。54株大腸埃希菌對7種氨基糖 苷類抗生素的mic結(jié)果如表1所示。大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素的耐藥表 型及產(chǎn)esbls的檢測結(jié)果54株大腸埃希菌對三種氨基糖苷類抗生素的耐藥表型如表2所示。用nc

14、cls推薦的esbls表型確證法檢測到34株 陽性菌株，占。表154株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素表254株大腸埃希菌對三氨基糖苷類抗生素的臨床分離菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌結(jié)果2株轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒經(jīng)提取、電泳后均示一條條帶；對氨 基糖苷類抗生素的mic如表3所示；同時均產(chǎn)esbls。aac(3)-ii基因的pcr及測序結(jié)果在54株大腸埃希菌中共檢測出pcr陽性45株(占); 陽性產(chǎn)物均經(jīng)測序并在gen bank與已登錄的序列作比對，結(jié) 果一致。aac(3)-ii基因的克隆及重組菌的耐藥譜結(jié)果重組菌經(jīng)pcr和雙酶切后證實，aac(3)-ii基因成功克 隆并轉(zhuǎn)化，重組菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥結(jié)果如表3所

15、示。表3 2株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌及重組菌對7種氨基糖苷類抗生 素的 mic(gg/ml)3討論(1)氨基糖苷類抗生素是一類由氨基環(huán)醇、氨基糖與糖 組成的抗生素的總稱，包括慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、 鏈霉素等。氨基糖苷類抗生素依賴電子轉(zhuǎn)運，通過細菌內(nèi)膜 到達胞質(zhì)中，與核糖體3 os亞基結(jié)合。雖然這種結(jié)合并不阻 止起始復合物的形成，但能通過破壞控制翻譯準確性的校讀 過程來干擾新生鏈的延長，導致細菌的死亡3。由于氨基 糖苷類抗生素在臨床上和動物細菌性疾病的預防與治療中長期和不合理的應用，使細菌對其耐藥性顯得日益突出。在 本研究中，從臨床分離的大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥率最 高，達到，其次為妥布霉素(%)

16、和卡那霉素(%)，對阿米卡 星的耐藥率最低(%)，這可能與阿米卡星是經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造、 能抵抗氨基糖苷修飾酶的半合成氨基糖苷類抗生素有關(guān)3。 本研究結(jié)果與姚蕾等4報道的xx年北京地區(qū)大腸埃希菌 耐氨基糖苷類抗生素的結(jié)果基本相似，但卡那霉素的耐藥率 比姚蕾等報道的高(北京地區(qū)為)，這可能與不同地區(qū)有不 同的用藥習慣有關(guān)。大腸埃希菌對奈替米星的耐藥只有， 但對其中度敏感的比率卻達，這可能是因為奈替米星作為 第三代氨基糖苷類抗生素在結(jié)構(gòu)上作了改進，使得 aac(3)-ii對奈替米星的修飾作用受到部分限制但不能完全 排除影響3。54株大腸埃希菌中有8株細菌對阿米卡星耐 藥，其中有7株為高水平耐藥(mic彡

17、512 ug/ml )且對其他6 種氨基糖苷類抗生素也有較高水平的mic值(均mic128u g/ml),顯然，這種對幾乎所有氨基糖苷類抗生素高水平的 耐藥現(xiàn)象可能存在有多種耐藥機制或高水平耐藥機制，如1 6srrna甲基化酶5。(2)超廣譜p -內(nèi)酰胺酶(esbls)是指由質(zhì)粒介導的能賦 予細菌對頭孢菌素類、氨曲南以及青霉素類廣泛耐藥的一類 酶。有學者認為6，以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗生 素對細菌所產(chǎn)的大部分內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，氨基糖苷類抗生素對這一類細菌亦然，特別是對阿米卡星耐藥率在20%。在治療由產(chǎn)esbls大腸埃希菌感染時可以采用氨基糖苷類抗生 素加頭霉烯類抗生素，或氨基糖苷類抗生素加內(nèi)

18、酰胺酶 抑制劑類抗生素聯(lián)合用藥方案。段建春等報道7，在產(chǎn)esbls的大腸埃希菌中aac(3)-11基因的檢出率高迗80%。在本 研究中，共有34株細菌產(chǎn)esbls,其中有30株為aac(3)-11 基因陽性，占;在45株aac(3)-ii基因陽性的細菌中，有 30株產(chǎn)esbls(占)，這個比例比一般的大腸埃希菌中產(chǎn)e sbls檢出率高8。將臨床分離菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21中， 提取質(zhì)粒并電泳后示僅單一條帶；同時檢測到aac(3)-ii基 和產(chǎn)esbls,說明這兩種基因在同一個質(zhì)粒上。patter son 等9認為氨基糖苷類修飾酶基因與esbls基因可在同整 合子上，表現(xiàn)出多重耐藥。由于在本實驗中

19、沒有作整合子的 檢測，所以不能認為它們在同一整合子上，但可以認為這兩 個基因很可能會同時隨著質(zhì)粒而傳播耐藥性。因此在治療產(chǎn) esbls的大腸埃希菌時，應考慮其可能同時攜帶有aac (3)-11 基因或其他氨基糖苷修飾酶基因，避免使用此類抗生素。(3)到目前為止，細菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥的 分子機制主要有以下五種：細菌產(chǎn)生一種或多種修飾酶， 使進入細菌胞內(nèi)的抗生素失去生物活性；抗生素作用靶位 的改變、核糖體堿基發(fā)生變化或與核糖體結(jié)合的核蛋白氨基 酸發(fā)生突變，使抗菌藥物無法發(fā)揮作用；細菌細胞膜通透 性改變，使進入胞內(nèi)的抗菌藥物減少；細菌通過主動外排(activeefflux)機制將已進入胞內(nèi)

20、的藥物泵至胞外；細菌產(chǎn)生16 srrna甲基化酶。細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥主要 是由于產(chǎn)生了一種或多種氨基糖苷類修飾酶(ames)。ame s 分為三大類，即乙酰轉(zhuǎn)移酶(aac)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ant)和磷酸 轉(zhuǎn)移酶(aph)。此類酶作用于氨基糖苷類抗生素特定的氨基 或羥基，使抗生素發(fā)生鋪化，使其降低或喪失對靶位核糖體 的親和力10。產(chǎn)aac(3)-ii是大腸埃希菌對氨基糖苷類 抗生素耐藥中最常見的耐藥機制之一 4。在本研究的54株 對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，aac(3)-ii基因 的檢出率為(45/54)。根據(jù)氨基糖苷類抗生素的耐藥性分為 三種耐藥表型(表2): g-t型、g型和

21、g-t-a型，其中g(shù) -t 型占多數(shù)且全部檢出aac(3)-ii基因，這與孔海深等11 報道的結(jié)果相類似。這種耐藥表型與基因型并不完全一致的 原因可能是由于氨基糖苷類修飾酶基因多數(shù)由整合子介導， 且一個整合子可攜帶多個修飾酶基因12;耐藥基因盒的 表達不僅依賴于啟動子的強弱，而且與啟動子的距離遠近有 關(guān)：上游基因表達強，下游基因表達弱甚至不表達13。6 株對慶大霉素敏感且檢出aac (3)-11基因的大腸埃希菌的藥 敏結(jié)果顯示，這6株對奈替米星、卡那霉素、鏈霉素、大觀 霉素、阿米卡星和妥布霉素中的一種或多種耐藥。有學者3 認為aac(3)_n基因可以以沉默狀態(tài)存在，表現(xiàn)為不耐藥；同時修飾酶在細

22、胞內(nèi)的定位也可能使有該酶基因的檢出但不表現(xiàn)為耐藥；而對奈替米星和妥布霉素等aac(3)-n底物 的耐藥可能是由于這些菌株中存在的其他耐藥機制所致，如 產(chǎn) aac(6' )-1。(4)在本研究中，成功地克隆了一株aac(3)-ii基因的 重組菌bl21/pe26b: aac(3)-ii。重組菌的藥敏試驗發(fā)現(xiàn)， 重組菌對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對奈替米星和妥布 霉素以及其他氨基糖苷類抗生素沒有產(chǎn)生耐藥性。這可能是 aac(3)-11基因在重組狀態(tài)下所產(chǎn)生的重組蛋白在蛋白的正 確折疊、二硫鍵形成與天然蛋白質(zhì)有一定的差別，使酶的活 性發(fā)生了改變。由于慶大霉素的結(jié)構(gòu)較妥布霉素等簡單，其 i環(huán)

23、3位氨基處于沒有其他空間阻隔的狀態(tài)，易被修飾酶所 攻擊3;同時現(xiàn)在也有學者認為妥布霉素與核糖體結(jié)合的 部位不止一個，妥布霉素可以以對稱或不對稱的方式二聚體 化后以擴大范圍，這樣減少修飾酶對妥布霉素的修飾作用而 發(fā)揮抗菌能力14。綜上，大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜中，對 慶大霉素的耐藥率最高(%)，對阿米卡星最低(%)。在對氨基 糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，esbls的檢出率較高(%) 為臨床上合理選擇和使用抗生素提供實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1馬越，李景云，張新妹，等.2002年臨床常見細耐藥性監(jiān)測j.中華檢驗醫(yī)學雜志，xx，27(1)： 3845.performancestandar

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