大鼠胚胎背部皮膚發(fā)育過(guò)程中毛囊干細(xì)胞的發(fā)育初探

1、大鼠胚胎背部皮膚發(fā)育過(guò)程中毛囊干細(xì)胞的發(fā)育初探作者：林森謝擁軍李新枝寧加亮 【摘要】目的探討大鼠胚胎背部皮膚毛囊干細(xì)胞的發(fā) 育規(guī)律。方法使用冰凍超薄切片后固定，結(jié)合免疫組織化學(xué) 染色方法，顯示出毛囊干細(xì)胞的位置和發(fā)育程度，然后對(duì)醫(yī) 學(xué)陽(yáng)性程度表達(dá)區(qū)域使用軟件分析和統(tǒng)計(jì)方法處理。結(jié)果大 鼠胚胎背部皮膚呈現(xiàn)逐漸增厚的趨勢(shì)，其中毛囊隆突區(qū)并不 明顯，但可明顯觀察到三種干細(xì)胞標(biāo)記物在皮膚全層，尤其 是基底層的表迗變化。結(jié)論形態(tài)學(xué)觀察說(shuō)明毛囊發(fā)生初期毛囊干細(xì)胞(hai rfolliclestemcell，hfsc)不僅僅定位于毛囊上段，三種hfsc標(biāo)志物的表達(dá)有差異。背部皮膚基底層細(xì)胞 具有干細(xì)胞特性，

2、未分化為表皮細(xì)胞或者毛囊中的各種細(xì)胞。 3 1 i ntegrin, cd34和k15的表達(dá)變化可能與毛囊干細(xì) 胞以及毛囊的生物學(xué)特性有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】大鼠胚胎；背部皮膚；毛囊干細(xì)胞【abstract】 objective tode tectthedevelopmentofhairfolliclestem lratembryodorsalskectionandimmunohisdtoinvestigatethee grin,cd34andk15. a1cellindevelopmentain. methods frozenstochemi strywereuse xpressionof 31in

3、teltheexpressiondatawasdetectedbysoftw lus,andthenthedata s embryodorsalskin allywithoutbulgere ttheexpressionofst ntegrin,cd34andk15 eachstageofdevelop n.conclusion there uggestthathairfoll s)donotlocalizeinuarecalledlmageprop wasanalyzed. result becamethickergradu gionsignificant,buemcellmarkers,

4、31ichangedobviouslyinmentalratdorsalskisultsofmorphologys iclestemcells(hfscnearlystageofhairf is. theexpressionsoersweredifferent. eercelisindorsalskicharacteristicswitgintoepithelialcel llinhairfollicle. t cellmarkersmaybecoolliclemorphogenes fthreestemcellmarkspecially,basallaynexhibitedstemcellh

5、outdifferential inlsorothertypesofceheexpressionofstemrrelatedwithcharacpperhairfollicleiteristicsofhairfol licleandhairfolliclestemcells.【keyw ords】rat embryo； do rsalskin； ha.irfollicle； hairf oil iciest emcell皮膚上皮層及其相關(guān)結(jié)構(gòu)來(lái)源于毛囊內(nèi)部和毛嚢間的兩個(gè)干細(xì)胞群落，即皮膚基底層干細(xì)胞通常形成皮膚各層， 而位于毛囊隆突區(qū)的干細(xì)胞則負(fù)責(zé)毛發(fā)和皮脂腺的再生1。 進(jìn)入生長(zhǎng)周期的毛囊可分

6、為四個(gè)階段，即生長(zhǎng)期(an agen)、退化期(catagen)、靜止期(telogen)和活躍脫毛期(exogen) 2,3。而進(jìn)入周期之前，毛囊經(jīng)歷發(fā)育階段。促使毛囊發(fā) 生的第一個(gè)信號(hào)來(lái)源于間充質(zhì)4,5，隨后表皮增厚形成基 板，真皮細(xì)胞在基板下形成結(jié)構(gòu)緊密的微環(huán)境，基板向下生 長(zhǎng)形成毛胚芽，上皮組織包圍真皮緊密微環(huán)境從而形成真皮乳頭。大鼠毛囊的形成經(jīng)歷胚胎第d()初生階段(e 22)， 本文據(jù)此選擇胚胎發(fā)育第15d (e15)、e16、和e19四個(gè)階段 以觀察大鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中背皮中干細(xì)胞標(biāo)志物31 integrin，cd34和k15的表達(dá)規(guī)律，以此解釋毛囊干細(xì)胞 (hairfollicl

7、este mcell，hfsc)在大鼠胚胎背皮中的發(fā)育規(guī)律。1材料和方法 材料近交系wistar大鼠胚胎(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供)。cd 34兔抗、pl integrin兔抗(武漢博士德)，k15 兔抗(novo castra)，免疫組化試刻盒(北京中山)。實(shí)驗(yàn)方法第15d(e15)、e16、和e19四個(gè)階段的背部皮膚。隨機(jī)抽取每階段大鼠胚胎6個(gè)，剪下每個(gè)階段大鼠胚胎的背部皮 膚，分置于液氮中待用。樣品放入4%pfa中固定24h后放入 30%蔗糖溶液中脫水40 h左右，于冰凍切片機(jī)中oct包埋劑 包埋，切成5nm厚組織片。采用免疫組化染色abc法檢測(cè) 大鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中h fsc組織

8、定位以及p ngf和p75 ntr 的表達(dá)。冰凍切片，37°c下3%h202封閉15min；滴加二抗的 正常血清封閉，室溫孵育25min；吸去封閉血清，勿洗，滴 加 k15(l : 70)、0 1 integrin(l : 10 0)和 cd34(1 : 100) 一抗(設(shè)pbs空白對(duì)照)；4°c濕盒內(nèi)過(guò)夜；加生物素化二抗和 鏈酶卵白素；dab同時(shí)程顯色，鏡下觀察顯色結(jié)果；干燥脫 水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。象分析使用nikon4500全自動(dòng)數(shù)碼ccd采集圖像，用imageprop lus專業(yè)軟件分析染色區(qū)域陽(yáng)性程度累積光密度(i0d)，采用 spss中anova方法分析

9、所有樣品i0d染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)值。2結(jié)果在胚胎期大鼠背皮研究過(guò)程中，可見(jiàn)皮膚的發(fā)育呈逐漸 增厚的趨勢(shì)。在e15時(shí)期，大鼠的背皮非常單薄，未觀察到 背毛毛囊，各層分層不明顯。隨著胎齡增加至e19時(shí)期，可 清楚觀察到表皮各層的組織結(jié)構(gòu)。p 1 integrin主要表迗 在表皮及其以下的真皮層小細(xì)胞群落中。cd34和k1 5主要 表達(dá)在表皮層。e15時(shí)期，表皮與真皮不易區(qū)分，主要由最外層的34層細(xì)胞組成。此時(shí)0 1 integri n不僅在表皮 表達(dá)，而且還在真皮細(xì)胞群落中表達(dá)。cd34為陰性。k15在 表皮表迗很少，圖像軟件并未識(shí)別其iod強(qiáng)度。e16時(shí)期， 表皮明顯增厚，0 1 integrin和c

10、d34都在表皮中表達(dá)， 而k15則未見(jiàn)表迗。時(shí)期，cd34和0 1 integrin主要表迗 在表皮以及表皮以下的真皮層小細(xì)胞群落中，k15無(wú)表迗。 到e19時(shí)期，皮膚結(jié)構(gòu)相對(duì)緊湊，層次也較分明，開(kāi)始出現(xiàn) 皺褶，pl integrin和cd 34在棘層中和基底層中表迗， 而k15僅在基底層中表達(dá)。陽(yáng)性表達(dá)iod差異見(jiàn)表1，表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖1.表1胚胎期大鼠背部表皮pl integrin、 cd34和k15在胚胎四個(gè)時(shí)期的平均灰度值(iod)3討論大鼠皮膚和毛囊的發(fā)育從胚胎階段就已經(jīng)開(kāi)始。首先表 皮增厚形成基板，緊接著真皮細(xì)胞圍繞基板下方形成一個(gè)組 織結(jié)構(gòu)緊密的微環(huán)境。表皮基板向下生長(zhǎng)到真皮形成毛

11、胚芽 上皮組織包繞組織緊密的真皮環(huán)境生長(zhǎng)形成真皮乳頭，圍繞 真皮乳頭的細(xì)胞則成為毛母質(zhì)細(xì)胞6。真皮乳頭緊靠毛囊 上皮組織的永久區(qū)域隆突區(qū)7。關(guān)于表皮干細(xì)胞與毛囊干細(xì)胞的定位和區(qū)分的問(wèn)題一 直存在爭(zhēng)論。20世紀(jì)90年代，cotsarealis等7發(fā)現(xiàn)并 揭示標(biāo)記滯留細(xì)胞(lrc)位于毛囊隆突部和表皮基底層。taylor等12利用標(biāo)記追蹤方法發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞可雙向分化為表皮干細(xì)胞和hfsc，該標(biāo)記主要定位于表皮基底層和 毛囊外根鞘隆突部。hfsc傾向于在表皮受到損傷和毛嚢創(chuàng)傷 時(shí)發(fā)揮其增殖分化潛能8。目前一般認(rèn)為，0 1 integrin, cd200, cd34, k15是hfsc的主要標(biāo)記物91

12、1。因此可以看出本研究應(yīng)用的k15, pl integrin和cd34在鼠類 的hfsc中有特異性表迗，能夠作為hf sc的特異性標(biāo)志 物。在研究中發(fā)現(xiàn)大鼠胚胎背部皮膚基底層的三個(gè)干細(xì)胞 標(biāo)志物cd34、k15和0 1 integ rin變化呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。 這提示皮膚中的干細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的性質(zhì)發(fā)生變化，并有 可能衍生出不同亞群。morri s 13認(rèn)為k15在鼠類毛囊的 所有時(shí)期都表迗，是毛囊干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，作者發(fā)現(xiàn)胚 胎大鼠e19時(shí)期，k15在基底層的強(qiáng)烈表達(dá)，而其他時(shí)期無(wú) 表達(dá)，whitbread等同樣發(fā)現(xiàn)分裂活躍的皮膚基底層表達(dá)k1514，因此k15在基底層的強(qiáng)烈表達(dá)與基底層的干

13、細(xì)胞特 性關(guān)系密切，推測(cè)hfsc由其他干細(xì)胞衍生而來(lái)，在e19時(shí) 期的大鼠胚胎背皮基底層中分裂活躍。p 1 i ntegrin和cd34表達(dá)在皮膚全層中，在臨近基 底層以及基底層以上表達(dá)比較強(qiáng)烈。這與k15的表迗部位明 顯不同。0 1 integrin高表迗細(xì)胞具有更高的克隆形成能 力，但p 1 in tegrin高表迗的細(xì)胞中除了表皮干細(xì)胞(esc) 外還包含短暫性增殖細(xì)胞(tac)。0 1 integrin具有粘附 功能，因此高水平表達(dá)的pl i ntegrin有利于保持干細(xì)胞的成簇分布15。同時(shí)，0 1 integ rin和cd34也是 表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，這提示在e15e19時(shí)期表

14、皮干細(xì)胞一直存在，只是數(shù)量和位置上有所變化，而k15在e19 的突然出現(xiàn)說(shuō)明hfsc是esc的子代細(xì)胞。這與p oter等認(rèn) 為k15為成熟基底層kc表型16相符。只有在體外操作利用間充質(zhì)信號(hào)刺激的情況下，hfsc才 會(huì)形成新的毛囊11，17。因此，徹底闡明hfsc的發(fā)育機(jī) 制有助于揭示毛囊的形成過(guò)程，期望為臨床研究新的毛發(fā)生 長(zhǎng)方法提供一些理論基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 alonsol, fuc hse. stemcellsofthe skinepithelium j . procnatlacadsciusa ,xx,100(suppll)：11 830 11835.2 m u 11 b,vand

15、erveenc,etaldefortheaccurateclerrvers,handj i ski.acomprehensiveguiassificationofvurinehairfolliclesindistinthaircyclestagesj . jinvestderm atol. 2001,117:315 .3 pausr. princip lesofhaircyclecont rolj . jdermatol, 1 998,25： 793802.rove rs,vandv,etal. acom therecognitionandcprehensiveguidefor4 pausr,

16、m u herlassificat i onofdistinctstagesofhairfol1iclemorphogenes is l j jinvestderma tol， 1999,113:5235 32.5 botchkarevva,botchkarevanv,rothw,etal. nogginlsamesenchymallyderivedstimulatorofhairfolliclelnductionj .naturecellbiol , 1999,1:157163.6 pausr,m u ller mprehensiveguidefoclassificationofdifoll

17、iclemorphogene sis 1999,113:523532.7 cotsarelisrov ers,vandv,etal. aco rtherecognitionand stinctstagesofhairj . jlnvestderm atol，suntt,lavkerrm. l abelretainingcell sresideinthebulgea reaofpilosebaceous unit：implicationforfollicularstemcel1,haircyc1e,andski ncarcinogenesis j .cell ，1990,61 (7):1 329

18、1337.8 broua rdm, barrandony. con trol 1 ingskinmorpho genesis：hopeanddes pair j . curropinbiotechnol,xx,14：520525.9 liuy,lyle s, yangx,etal. keratinl5promotertargetsputativeepithelialstemcellsinthehai rfolliclebulgej. jinvestdermatol, xx ,121:963968.10 tumbart, guaschg, gr ecov, etal. defining thee

19、pithelialstemc ellnicheinskin j .science,xx,303：359363.11 cotsarel isg. geneexpressionprofi1inggetstothe rootofhumanhairfol liclestemcellsj . jclinlinvest,xx,ll 6:1922.12 taylo rg, lehrerms, jensen pj, etal. involvemen toffollicularstemcellsinformingnotonlythefolliclebutal sotheepidermis j . cell, 2000, 102:541561.13 morrisrj. aperspectiveonkeratinocytestemcellsa stargetsforskincar cinoge