第三講-核酸的制備2

1、核酸的的制備核酸的的制備2 2核酸樣品的分析與檢測核酸樣品的分析與檢測一、凝膠電泳一、凝膠電泳-Gel electrophoresis瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳變性瓊脂糖變性瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳脈沖場脈沖場凝膠電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳1，瓊脂糖，瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳一般性檢測采用一般性檢測采用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：SAGESAGE-submerged agarose gel electrophoresissubmerged agarose gel electrophoresis核酸樣品從核酸樣品從負(fù)極向正極移動負(fù)極向正極移動。Nucleic acid sa

2、mples placed in the gel will Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction. negative electrode in horizontal direction. 在在中性中性pHpH條件下，條件下，核酸帶負(fù)電荷核酸帶負(fù)電荷，主要來自磷酸二，主要來自磷酸二酯鍵骨架上的磷

3、酸基團(tuán)。酯鍵骨架上的磷酸基團(tuán)。Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due to the multiple negative charges due to the phosphate groups on the phosphodiester phosphate groups on the phosphodiester backbone.backbone.樣品的樣品的分離效果分離效果與凝膠基質(zhì)的與凝膠基質(zhì)

4、的孔隙度孔隙度有關(guān)。有關(guān)。隨隨DNADNA分子增大分子增大，凝膠濃度應(yīng)降低。，凝膠濃度應(yīng)降低。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠可以分離長度為可以分離長度為100bp至至60kb的的DNA分子。分子。核酸染料核酸染料溴乙錠溴乙錠。紫外線觀察。紫外線觀察。The degree of separation depended on the porosity The degree of separation depended on the porosity of the matrix.of the matrix.影響泳動率的因素：影響泳動率的因素：包括包括分子大小分子大小、電荷多少電荷多少、顆粒形狀顆粒形狀和和空間

5、構(gòu)型空間構(gòu)型。顆粒帶顆粒帶電荷的密度越大電荷的密度越大，泳動速度，泳動速度越快越快。顆粒顆粒物理形狀越大物理形狀越大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動泳動速度越小速度越小。對于對于線性雙鏈線性雙鏈DNADNA分子，在凝膠電泳中，分子，在凝膠電泳中，相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)的常用對數(shù)與與泳動率成反比關(guān)系泳動率成反比關(guān)系。利用利用DNADNA分子長度（分子長度（bpbp）的負(fù)對數(shù)）的負(fù)對數(shù)與與泳動距離泳動距離作圖，可作圖，可以方便準(zhǔn)確地以方便準(zhǔn)確地測定測定DNADNA片段片段的分子量。的分子量。構(gòu)型相同構(gòu)型相同、但相對、但相對分子質(zhì)量不同分子質(zhì)量不同的的DNA片段泳動

6、速度不片段泳動速度不一樣，在電泳過程中可以彼此分開。一樣，在電泳過程中可以彼此分開。相對相對分子質(zhì)量相同的分子質(zhì)量相同的DNADNA分子分子如果它們的如果它們的空間構(gòu)型不同空間構(gòu)型不同，其其遷移率也不同遷移率也不同。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA存在閉環(huán)（存在閉環(huán)（型，型，CCCC）、單鏈開環(huán)（）、單鏈開環(huán)（型，型，OCOC）和線性（和線性（型，型，L L）三種構(gòu)型，三者之間的遷移率一般為）三種構(gòu)型，三者之間的遷移率一般為型型 型型 型型以以pUC19質(zhì)粒為例，有超螺旋的質(zhì)粒為例，有超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA, 簡稱簡稱c

7、ccDNA）、共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒）、共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA一條單一條單鏈斷裂的鏈斷裂的開環(huán)質(zhì)粒開環(huán)質(zhì)粒DNA（open circular DNA, 簡稱簡稱ocDNA）、共價(jià)閉）、共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒合環(huán)狀質(zhì)粒DNA兩條單鏈斷裂的兩條單鏈斷裂的線性質(zhì)粒線性質(zhì)粒DNA（linear DNA, 簡稱簡稱L DNA）三種構(gòu)型三種構(gòu)型。電泳時(shí)電泳時(shí)cccDNA移動最快移動最快，其次為，其次為線性線性DNA，開環(huán)質(zhì)粒開環(huán)質(zhì)粒DNA最慢最慢，所，所以電泳結(jié)果為三條分開的帶。以電泳結(jié)果為三條分開的帶。限制性酶切的質(zhì)粒限制性酶切的質(zhì)粒DNA為線性分子。為線性分子。 M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2

8、3.5 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83 M：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（marker）；）；1：pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA經(jīng)經(jīng)EcoR完全完全酶切酶切；2：pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA經(jīng)經(jīng)EcoR部分部分酶切酶切；3：未酶切未酶切的的pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，提，提取結(jié)果好時(shí)，為一條帶，以超取結(jié)果好時(shí)，為一條帶，以超螺旋質(zhì)粒螺旋質(zhì)粒DNA為主，有時(shí)結(jié)果為主，有時(shí)結(jié)果為三條帶，從下向上分別為超為三條帶，從下向上分別為超螺旋質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)螺旋質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒。粒。通常采用的緩沖體系有通常采用的緩沖體系有3 3種種：Tris.Tris.乙酸（乙酸（TA

9、ETAE）、）、Tris.Tris.硼酸（硼酸（TBETBE）和）和Tris.Tris.磷酸（磷酸（TPETPE）。）。TAETAE緩沖能力很低緩沖能力很低，長時(shí)間電泳會導(dǎo)致電泳槽，長時(shí)間電泳會導(dǎo)致電泳槽陰極變?yōu)殛帢O變?yōu)閴A性堿性，陽極變?yōu)樗嵝躁枠O變?yōu)樗嵝裕瑥亩咕彌_能力降低。，從而使緩沖能力降低。瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳的分辨力較低分辨力較低，但它，但它操作簡便操作簡便、應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍廣、適合于較大分子的分析廣、適合于較大分子的分析。DNADNA分子在電泳后分子在電泳后短時(shí)間內(nèi)位置可以保持不變短時(shí)間內(nèi)位置可以保持不變，該技術(shù)已成，該技術(shù)已成為為DNADNA、RNARNA分離和檢測的重要

10、手段。分離和檢測的重要手段。TBETBE與與TPETPE均有較強(qiáng)的緩沖能力，但從均有較強(qiáng)的緩沖能力，但從TPETPE凝膠回收的凝膠回收的DNADNA片片段中含有較高的磷酸鹽段中含有較高的磷酸鹽，容易與，容易與DNADNA一起沉淀一起沉淀，進(jìn)而影響一，進(jìn)而影響一些酶反應(yīng)，如限制性酶切反應(yīng)。些酶反應(yīng)，如限制性酶切反應(yīng)。瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 %分離范圍分離范圍 kb0.35600.61200.70.8100.90.571.20.40.12不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離線性不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離線性DNADNA分子的有效范圍分子的有效范圍（指能夠清楚地分開）（指能夠清楚地分開）2

11、 2，變性變性瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳RNARNA分子在分子在變性瓊脂糖凝膠變性瓊脂糖凝膠中可以按中可以按大小不同大小不同而相互分開。而相互分開。變性指利用變性劑變性指利用變性劑破壞破壞RNARNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)，消除二級結(jié)構(gòu)對，消除二級結(jié)構(gòu)對電泳遷移率的影響，使電泳遷移率的影響，使RNARNA分子的泳動由分子的泳動由分子大小來決定分子大小來決定。常用的變性劑有常用的變性劑有甲醛甲醛、乙二醛乙二醛和和二甲基亞砜二甲基亞砜等。等。 變性凝膠也可以檢測變性凝膠也可以檢測DNA分子的堿基變異分子的堿基變異：恒定變性凝膠電泳，恒定變性凝膠電泳，CDGE瞬時(shí)溫度梯度凝膠電泳，瞬時(shí)溫度梯度凝膠電

12、泳，TTGE溫度梯度凝膠電泳，溫度梯度凝膠電泳，TGGE3 3，脈沖場瓊脂糖凝膠電泳，脈沖場瓊脂糖凝膠電泳大分子大分子DNADNA在電場作用下擠過在電場作用下擠過孔徑小于分子大小孔徑小于分子大小的凝的凝膠時(shí)，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，膠時(shí)，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直沿電場方向伸直，與電場平行，這樣與電場平行，這樣才能通過凝膠才能通過凝膠。這時(shí)大分子通過凝膠的方式均相同，這時(shí)大分子通過凝膠的方式均相同，遷移率無差別遷移率無差別，不能達(dá)到分離的目的。不能達(dá)到分離的目的。當(dāng)當(dāng)電場方向改變電場方向改變時(shí)，電場內(nèi)的時(shí)，電場內(nèi)的DNADNA分子構(gòu)象也發(fā)生改分子構(gòu)象也發(fā)生改變，并重新定向，變，并重

13、新定向，沿新的方向伸直沿新的方向伸直. .其其轉(zhuǎn)向時(shí)間轉(zhuǎn)向時(shí)間與其粘彈性弛豫時(shí)間有關(guān)，并與其粘彈性弛豫時(shí)間有關(guān)，并顯著地依顯著地依賴于分子大小賴于分子大小。DNADNA分子分子越大越大，這種，這種構(gòu)象改變構(gòu)象改變需要的需要的時(shí)間越長時(shí)間越長。在脈沖場瓊脂糖凝膠電泳中，在脈沖場瓊脂糖凝膠電泳中，DNA分子在分子在兩個(gè)不兩個(gè)不同方向的均一或不均一電場同方向的均一或不均一電場中不斷隨中不斷隨電場方向改電場方向改變分子本身的構(gòu)象變分子本身的構(gòu)象，并擠過凝膠。，并擠過凝膠。DNADNA分子分子構(gòu)象改變時(shí)間小于脈沖電場周期構(gòu)象改變時(shí)間小于脈沖電場周期，DNADNA分子便分子便可以按其可以按其分子大小分子大

14、小，得到較好的，得到較好的分離分離效果；效果；反之，反之，DNADNA分子變換時(shí)間大于脈沖電場周期分子變換時(shí)間大于脈沖電場周期，則凝膠，則凝膠中中DNADNA分子松弛變形與電場更替時(shí)間不相等，分子松弛變形與電場更替時(shí)間不相等，達(dá)不到達(dá)不到分離目的分離目的。 Pulsed-field gel electrophoresis, PFGEField inversion gel electrophoresis, FIGE, 電場倒轉(zhuǎn)凝電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳膠電泳Contour-clamped homogeneous eletric field gel electrophoresis, CHEF, 鉗位均勻電

15、場電泳鉗位均勻電場電泳 4 4，聚丙烯酰胺凝膠電泳（，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）聚丙烯酰胺凝膠是一種聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成人工合成的凝膠，由的凝膠，由丙烯酰胺丙烯酰胺單體單體和和甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺在催化劑在催化劑過硫酸胺過硫酸胺和加速劑和加速劑TEMEDTEMED的作用下聚合而成。的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠可分離聚丙烯酰胺凝膠可分離5-500bp的小片段的小片段DNA分子分子，所以手工測序一般只能讀出所以手工測序一般只能讀出500個(gè)堿基。個(gè)堿基。聚合時(shí)，由單體丙烯酰胺聚合成鏈狀物，由聚合時(shí)，由單體丙烯酰胺聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰胺將鏈

16、與鏈交聯(lián)成將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀網(wǎng)狀，形成不溶于水的，形成不溶于水的凝膠。凝膠。根據(jù)待分離物質(zhì)的根據(jù)待分離物質(zhì)的分子大小分子大小，應(yīng)選用合適的凝膠濃度。，應(yīng)選用合適的凝膠濃度。 被分離物質(zhì)與凝膠濃度之間的關(guān)系被分離物質(zhì)與凝膠濃度之間的關(guān)系被分離物質(zhì)被分離物質(zhì)被分離物的相對分被分離物的相對分子質(zhì)量子質(zhì)量適用的凝膠濃度適用的凝膠濃度蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)10520%30%15%20%1015%5%10%2%-5%核核 酸酸104104 105105 210815%20%5%10%2%2.6%最常用的最常用的蛋白質(zhì)分離體系為蛋白質(zhì)分離體系為pH8.9pH8.9的堿性緩沖液體的堿性緩沖液體系系. .因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)

17、的等電點(diǎn)因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏酸性或中性略偏酸性或中性，在，在pH8.9pH8.9的堿性緩沖體系中的堿性緩沖體系中帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷，向正極移動。，向正極移動。在有些情況下，需要在緩沖體系中加入在有些情況下，需要在緩沖體系中加入解離劑解離劑，將分子，將分子內(nèi)的內(nèi)的非共價(jià)鍵破壞非共價(jià)鍵破壞，這種體系稱為，這種體系稱為解離體系解離體系。常用的解離劑有常用的解離劑有SDSSDS、尿素尿素等，它們同時(shí)也是某些蛋白等，它們同時(shí)也是某些蛋白質(zhì)（如質(zhì)（如膜蛋白膜蛋白）的）的促溶劑促溶劑。解離劑可以減弱分子空間構(gòu)象的差別解離劑可以減弱分子空間構(gòu)象的差別，有利于了解分子，有利于了解分子的大小與遷移率之間的關(guān)

18、系。的大小與遷移率之間的關(guān)系。 PAGEPAGE分為分為連續(xù)電泳體系連續(xù)電泳體系和和不連續(xù)電泳體系不連續(xù)電泳體系。連續(xù)連續(xù)電泳體系指整個(gè)電泳體系中的電泳體系指整個(gè)電泳體系中的緩沖液、緩沖液、pHpH值和凝值和凝膠孔徑大小相同膠孔徑大小相同，主要用于，主要用于核酸分析核酸分析。不連續(xù)不連續(xù)電泳體系中，除了電泳槽中的緩沖體系和電泳體系中，除了電泳槽中的緩沖體系和pHpH值值與凝膠中不同外，凝膠本身也由與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩沖體系、緩沖體系、pHpH值和凝值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成，該體系主要用于堆積而成，該體系主要用于蛋蛋白質(zhì)樣品白質(zhì)樣品的分離。的分離。不連續(xù)電

19、泳體系制膠比較麻煩，但它不連續(xù)電泳體系制膠比較麻煩，但它對樣品有高效濃對樣品有高效濃縮效應(yīng)縮效應(yīng)，可以大大提高分辨能力。，可以大大提高分辨能力。蛋白質(zhì)分子的分離鑒定采用不連續(xù)電泳體系進(jìn)行，在蛋白質(zhì)分子的分離鑒定采用不連續(xù)電泳體系進(jìn)行，在電泳時(shí)除具有電泳時(shí)除具有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)和和分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)外，還有外，還有濃縮效濃縮效應(yīng)應(yīng)。濃縮效應(yīng)主要在濃縮膠濃縮效應(yīng)主要在濃縮膠中完成，濃縮膠中完成，濃縮膠pHpH為為6.96.9。在濃縮膠中，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被在濃縮膠中，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被濃縮形成一狹濃縮形成一狹小的中間層小的中間層，并按其蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷量多少依次排列，并按其蛋白質(zhì)所帶

20、負(fù)電荷量多少依次排列成帶。成帶。濃縮的樣品進(jìn)入分離膠后，膠的濃縮的樣品進(jìn)入分離膠后，膠的孔徑變小，孔徑變小，pHpH值升高，值升高，電場強(qiáng)度恒定電場強(qiáng)度恒定，蛋白質(zhì)的分離取決于它們的，蛋白質(zhì)的分離取決于它們的電荷性質(zhì)、電荷性質(zhì)、分子大小和形狀分子大小和形狀。SDS-PAGESDS-PAGE可用于蛋白質(zhì)分子量的測定可用于蛋白質(zhì)分子量的測定SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能與與蛋白質(zhì)分子的疏水部分定量結(jié)合蛋白質(zhì)分子的疏水部分定量結(jié)合，把大多數(shù)蛋白質(zhì)，把大多數(shù)蛋白質(zhì)拆分拆分成亞單位成亞單位，并帶上，并帶上陰離子陰離子。這些陰離

21、子。這些陰離子掩蓋了蛋白質(zhì)分子掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身所帶的電荷差異本身所帶的電荷差異。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了電荷效應(yīng)消除了電荷效應(yīng)，只有，只有分子篩效分子篩效應(yīng)應(yīng)，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子量取決于分子量，遷移率與分，遷移率與分子量對數(shù)呈線性關(guān)系。子量對數(shù)呈線性關(guān)系。用于用于核酸分離核酸分離的聚丙烯酰胺凝膠的緩沖體系是的聚丙烯酰胺凝膠的緩沖體系是連續(xù)體連續(xù)體系系，主要分離較小的核酸（，主要分離較小的核酸（5-500bp5-500bp），遷移率與），遷移率與分子分子大小和構(gòu)型大小和構(gòu)型（如線性、缺口環(huán)化、超螺旋）有關(guān)。（如線性、缺口

22、環(huán)化、超螺旋）有關(guān)。如果樣品中所有的如果樣品中所有的DNADNA分子分子均為線性分子均為線性分子，可用，可用遷移率遷移率比較其大小比較其大小（以標(biāo)準(zhǔn)核酸片段作標(biāo)準(zhǔn)對照）。（以標(biāo)準(zhǔn)核酸片段作標(biāo)準(zhǔn)對照）。核酸序列測定采用以核酸序列測定采用以尿素為解離劑尿素為解離劑的聚丙烯酰胺凝膠。的聚丙烯酰胺凝膠。 二、核酸的序列測定二、核酸的序列測定DNA sequencing基本原理：將基本原理：將DNA的的序列測定序列測定轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為DNA片段的片段的長度分長度分析析。1 1，化學(xué)法測序，化學(xué)法測序-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing-Maxam-Gilbert (che

23、mical) sequencing Allan Maxam and Walter Gilbert Allan Maxam and Walter Gilbert （1977） 用化學(xué)物質(zhì)在用化學(xué)物質(zhì)在特定堿基位置斷裂特定堿基位置斷裂DNADNA分子，產(chǎn)生總體上分子，產(chǎn)生總體上只差只差一個(gè)堿基一個(gè)堿基的一套的一套DNADNA片段。片段。chemicals are used to cleave the DNA at chemicals are used to cleave the DNA at certain certain positionspositions, generating , gene

24、rating a set of fragments that differ a set of fragments that differ by one nucleotideby one nucleotide. .DNADNA片段的片段的一條鏈在一條鏈在5 5 端端用用3232P P標(biāo)記。標(biāo)記。然后進(jìn)行然后進(jìn)行特定的化學(xué)修飾特定的化學(xué)修飾。將將修飾的堿基修飾的堿基從脫氧核糖分子上除去后從脫氧核糖分子上除去后用哌啶斷裂用哌啶斷裂（piperidinepiperidine）。）。 The reaction conditions are chosen so that,on The reaction c

25、onditions are chosen so that,on average, only one modification will be average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA roduced into each copy of the DNA molecule.化學(xué)法使用化學(xué)法使用特異的化學(xué)試劑修飾特異的化學(xué)試劑修飾DNADNA分子中的分子中的不同堿不同堿基基，然后用哌啶切斷多核苷酸鏈；，然后用哌啶切斷多核苷酸鏈；通過通過四組不同的特異反應(yīng)四組不同的特異

26、反應(yīng)，就可以將末端（，就可以將末端（3-3-或或5-5-端）帶有放射性標(biāo)記的端）帶有放射性標(biāo)記的DNADNA分子分子切成不同長度的切成不同長度的寡核苷酸片段寡核苷酸片段。這些寡核苷酸的這些寡核苷酸的長度長度相當(dāng)于從特異反應(yīng)引起的相當(dāng)于從特異反應(yīng)引起的切點(diǎn)到切點(diǎn)到標(biāo)記末端之間的長度標(biāo)記末端之間的長度。用分辨力極高的用分辨力極高的變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些不電泳將這些不同長度的寡核苷酸片段同長度的寡核苷酸片段分離開來并進(jìn)行自顯影分離開來并進(jìn)行自顯影。在四組反應(yīng)中，在四組反應(yīng)中，整體上相鄰的兩條帶整體上相鄰的兩條帶僅僅相差一個(gè)堿相差一個(gè)堿基基，由此可讀出所測定的，由此可讀出所測定

27、的DNADNA的序列。的序列。G G反應(yīng)反應(yīng) 用用硫酸二甲脂硫酸二甲脂（dimethyl sulfatedimethyl sulfate，簡稱，簡稱DMSDMS）使）使鳥鳥嘌呤上的嘌呤上的N N7 7原子原子甲基化。甲基化。甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的糖苷鍵糖苷鍵在在中性環(huán)境中性環(huán)境中加熱而斷裂中加熱而斷裂，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸骨架在鳥，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸骨架在鳥嘌呤處發(fā)生斷裂。嘌呤處發(fā)生斷裂。G+AG+A反應(yīng)反應(yīng) 用用甲酸使甲酸使A A和和G G嘌呤環(huán)上的嘌呤環(huán)上的N N原子質(zhì)子化原子質(zhì)子化，使糖，使糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使嘌呤脫落。苷鍵變得不穩(wěn)

28、定，再用哌啶使嘌呤脫落。T+CT+C反應(yīng)反應(yīng) 用用肼（肼（hydrazinehydrazine）使）使T T和和C C的嘧啶環(huán)的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌斷裂，再用哌啶除去堿基。啶除去堿基。C C反應(yīng)反應(yīng) 當(dāng)有當(dāng)有NaClNaCl存在存在時(shí)，只有時(shí)，只有C C與肼發(fā)生與肼發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)，T T不發(fā)生反不發(fā)生反應(yīng)。斷裂的應(yīng)。斷裂的C C可用哌啶除去。哌啶也可使脫去堿基可用哌啶除去。哌啶也可使脫去堿基處的磷酸二酯鍵斷裂。處的磷酸二酯鍵斷裂。 上述四組反應(yīng)中，應(yīng)上述四組反應(yīng)中，應(yīng)控制時(shí)間只讓很小一部分堿基控制時(shí)間只讓很小一部分堿基被修被修飾，這樣在一種飾，這樣在一種DNADNA分子形成的群體中，分子形成的群

29、體中，每個(gè)相關(guān)位點(diǎn)每個(gè)相關(guān)位點(diǎn)都都有可能被切斷形成一種末端帶標(biāo)記的寡核苷酸片段。有可能被切斷形成一種末端帶標(biāo)記的寡核苷酸片段。但用但用哌啶切斷鏈的反應(yīng)必須是定量的哌啶切斷鏈的反應(yīng)必須是定量的。反應(yīng)完畢后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳反應(yīng)完畢后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳（7mol/L7mol/L尿素，尿素，8%8%膠膠）進(jìn)行分析。）進(jìn)行分析。電泳時(shí)電壓在電泳時(shí)電壓在4000V4000V左右，凝膠的溫度保持在左右，凝膠的溫度保持在6565，以保證以保證DNADNA在變性狀態(tài)在變性狀態(tài)下進(jìn)行電泳。下進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將膠抽干，進(jìn)行電泳完畢后，將膠抽干，進(jìn)行放射自顯影放射自顯影，從膠片上，從膠

30、片上可讀出可讀出DNADNA序列。序列。 圖圖 化學(xué)法測定化學(xué)法測定DNADNA序列時(shí)的序列時(shí)的G G反應(yīng)（反應(yīng)（A A）和化學(xué)法測定）和化學(xué)法測定DNADNA序列圖解（序列圖解（B B） 2 2，酶法測序，酶法測序Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencingSanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing Fred Sanger and Alan CoulsonFred Sanger and Alan CoulsonKlenow fragment, Klenow fragment, singl

31、e-stranded DNA, single-stranded DNA, a primera primerddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesdNTPs,-dNTPs,-3535SATPSATP用用M13M13噬菌體載體噬菌體載體制備制備單鏈單鏈DNADNA。DNA molecule was cloned into a vector such DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophage M13 t

32、o produce as the bacteriophage M13 to produce single-single-stranded DNAstranded DNA. . 測序膠測序膠-6-20% polyacrylamide6-20% polyacrylamide7M urea7M urea which acts as a which acts as a denaturantdenaturant to to reduce the effects of DNA reduce the effects of DNA secondary secondary structure.structure

33、.英國生物化學(xué)家英國生物化學(xué)家F. SangerF. Sanger（19181918）第一個(gè)完成了）第一個(gè)完成了胰島素的氨基胰島素的氨基酸序列測定酸序列測定。1919世紀(jì)前葉人們就知道蛋白質(zhì)，并了解其水解產(chǎn)物中有一些氨基世紀(jì)前葉人們就知道蛋白質(zhì)，并了解其水解產(chǎn)物中有一些氨基酸。酸。到了到了2020世紀(jì)初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)世紀(jì)初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是氨基酸通過肽鍵連接而成的蛋白質(zhì)是氨基酸通過肽鍵連接而成的長鏈長鏈，19401940時(shí)基本弄清了組成蛋白質(zhì)的時(shí)基本弄清了組成蛋白質(zhì)的2020種不同氨基酸種不同氨基酸，但對于，但對于這些氨基酸在蛋白質(zhì)中這些氨基酸在蛋白質(zhì)中如何排列一無所知如何排列一無所知。San

34、gerSanger從從19451945年起，選擇當(dāng)時(shí)已知的最小蛋白質(zhì)胰島素作為研究年起，選擇當(dāng)時(shí)已知的最小蛋白質(zhì)胰島素作為研究對象，經(jīng)過十年的艱苦奮斗，終于測出了對象，經(jīng)過十年的艱苦奮斗，終于測出了牛胰島素所含的牛胰島素所含的5151個(gè)氨個(gè)氨基酸的排列順序基酸的排列順序，于，于19581958年獲得第一個(gè)諾貝爾獎。年獲得第一個(gè)諾貝爾獎。雙脫氧法（雙脫氧法（dideoxy methoddideoxy method），也稱），也稱酶法酶法（enzyme enzyme methodmethod）或）或鏈終止法鏈終止法（the chain termination the chain terminati

35、on methodmethod），由），由SangerSanger于于19771977年建立。年建立。以以3535P P、3535S S替代替代3232P P作為標(biāo)記物。作為標(biāo)記物。該方法的原理是利用該方法的原理是利用2,3-2,3-雙脫氧三磷酸核苷酸雙脫氧三磷酸核苷酸（2,3-ddNTP2,3-ddNTP，dideoxynucleotidedideoxynucleotide ）來）來終止終止DNADNA的復(fù)制反應(yīng)的復(fù)制反應(yīng)。DNADNA聚合酶（如聚合酶（如KlenowKlenow片段片段）在）在DNADNA復(fù)制過程中催化多復(fù)制過程中催化多核苷酸鏈的延伸，單核苷酸被連接在核苷酸鏈的延伸，單核苷

36、酸被連接在延伸鏈的延伸鏈的3-OH3-OH上上；如果摻入的一個(gè)如果摻入的一個(gè)2,3-ddNTP2,3-ddNTP，延伸反應(yīng)就會，延伸反應(yīng)就會停止停止。根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)四組反應(yīng)四組反應(yīng)，每組反應(yīng)中都含有，每組反應(yīng)中都含有: :正常的四種脫氧核苷酸正常的四種脫氧核苷酸dNTPdNTP（其中一種帶有（其中一種帶有3232P P標(biāo)記）標(biāo)記）單鏈單鏈DNADNA模板模板（即待測（即待測DNADNA，一般通過，一般通過M13M13絲狀噬菌體制備）絲狀噬菌體制備）DNADNA聚合酶聚合酶I I引物引物（可以根據(jù)載體序列人工合成）（可以根據(jù)載體序列人工合成）另外每一組反應(yīng)還加入另外每一組反應(yīng)還

37、加入一種一種2,3-ddNTP2,3-ddNTP。也可以標(biāo)記也可以標(biāo)記引物引物或或ddNTPddNTP. .以以A A管管為例，凡聚合反應(yīng)進(jìn)行到模板的為例，凡聚合反應(yīng)進(jìn)行到模板的T T堿基堿基時(shí)，時(shí)，2-dATP2-dATP和和2,3-ddATP2,3-ddATP都有可能摻入都有可能摻入. .如果摻入如果摻入2-dATP2-dATP，聚合反應(yīng)可以繼續(xù)進(jìn)行聚合反應(yīng)可以繼續(xù)進(jìn)行。如果如果摻入摻入2,3-ddATP2,3-ddATP，鏈，鏈延伸反應(yīng)即告終止延伸反應(yīng)即告終止，這樣在反應(yīng)產(chǎn)，這樣在反應(yīng)產(chǎn)物中就會產(chǎn)生物中就會產(chǎn)生末端為末端為A A的單鏈的單鏈DNADNA片段群體片段群體。將四組反應(yīng)產(chǎn)物用將

38、四組反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳凝膠電泳進(jìn)行分析，在進(jìn)行分析，在整體上四個(gè)泳整體上四個(gè)泳道道中自顯影產(chǎn)生的中自顯影產(chǎn)生的相鄰條帶只有一個(gè)堿基的差異相鄰條帶只有一個(gè)堿基的差異，由此，由此可讀出可讀出DNADNA的序列。的序列。應(yīng)用應(yīng)用3535S S標(biāo)記的標(biāo)記的dNTPdNTP替代替代3232P P標(biāo)記的標(biāo)記的dNTPdNTP，電泳圖譜更加清，電泳圖譜更加清晰，分辨力更高，每次實(shí)驗(yàn)可以晰，分辨力更高，每次實(shí)驗(yàn)可以讀出更多讀出更多的堿基序列。的堿基序列。目前雙脫氧測序反應(yīng)一般利用目前雙脫氧測序反應(yīng)一般利用雙鏈雙鏈DNADNA模板模板通過通過聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，并采用進(jìn)行，并采用四種不同顏色的熒光

39、素四種不同顏色的熒光素分別標(biāo)分別標(biāo)記記四種雙脫氧核苷酸四種雙脫氧核苷酸。這使得四組測序反應(yīng)可以在這使得四組測序反應(yīng)可以在一個(gè)一個(gè)EppendorfEppendorf管管進(jìn)行，分進(jìn)行，分析時(shí)通過析時(shí)通過毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳在在DNADNA自動測序儀自動測序儀即可讀出相應(yīng)的即可讀出相應(yīng)的DNADNA序列。序列。 基本的原理為基本的原理為DNADNA聚合酶不能區(qū)分聚合酶不能區(qū)分dNTPdNTP和和ddNTPddNTP，一旦，一旦ddNTPddNTP被作為被作為底物連接至新生鏈，底物連接至新生鏈，DNADNA的的延伸合成會終止延伸合成會終止，從而產(chǎn)生，從而產(chǎn)生單鏈的單鏈的DNADNA片片段段；由于存在

40、由于存在很多模板很多模板分子，以及分子，以及dNTPdNTP和和ddNTPddNTP連接的連接的隨機(jī)性隨機(jī)性，DNADNA合成合成反應(yīng)可以在反應(yīng)可以在任一堿基位置終止任一堿基位置終止。經(jīng)過一段時(shí)間后可得到經(jīng)過一段時(shí)間后可得到一個(gè)不同長度的單鏈一個(gè)不同長度的單鏈DNADNA群體群體，電泳時(shí)它們，電泳時(shí)它們可以可以按大小分開按大小分開，并且相鄰條帶之間，并且相鄰條帶之間僅差一個(gè)堿基僅差一個(gè)堿基。從膠的下面開始向上可以讀出從膠的下面開始向上可以讀出DNADNA分子的核苷酸序列。分子的核苷酸序列。越靠近引物越靠近引物端的位置產(chǎn)生的片段越小端的位置產(chǎn)生的片段越小。鏈終止法中用于測序的鏈終止法中用于測序的

41、DNADNA聚合酶聚合酶必須滿足必須滿足3 3個(gè)條件個(gè)條件：高酶活性高酶活性，即與模板結(jié)合能力強(qiáng)，可合成足夠長的，即與模板結(jié)合能力強(qiáng)，可合成足夠長的DNADNA單鏈；單鏈；無無5 5 33 外切核酸酶活性外切核酸酶活性，5 5 33 核酸酶活性可將新合成的核酸酶活性可將新合成的DNADNA鏈的鏈的5 5 端除去，端除去，改變合成產(chǎn)物的長度改變合成產(chǎn)物的長度，給順序的閱讀造，給順序的閱讀造成誤差；成誤差；無無3 3 55 外切酶活性外切酶活性，原因與，原因與相同。相同。所以用于測序的所以用于測序的DNADNA聚合酶都經(jīng)過了人工的修飾。聚合酶都經(jīng)過了人工的修飾。第一個(gè)用于測序的第一個(gè)用于測序的DN

42、ADNA聚合酶為聚合酶為KlenowKlenow片段片段，不具有不具有5 5 33 外外切酶活性切酶活性，但僅能合成長約，但僅能合成長約250250個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的DNADNA分子，經(jīng)聚丙分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，會形成一些烯酰胺凝膠電泳后，會形成一些陰影條帶陰影條帶，說明有許多終止，說明有許多終止反應(yīng)由酶活性造成。反應(yīng)由酶活性造成。現(xiàn)在廣泛采用的現(xiàn)在廣泛采用的DNADNA聚合酶由聚合酶由T7T7噬菌體噬菌體編碼，又稱編碼，又稱sequenasesequenase，即即測序酶測序酶。SequenaseSequenase工作效率高，工作效率高，無外切酶活性無外切酶活性。鏈終止法測序鏈終止

43、法測序時(shí)可通過以下時(shí)可通過以下幾種方法制備模板幾種方法制備模板：插入質(zhì)粒載體的插入質(zhì)粒載體的雙鏈雙鏈DNADNA，可以采用可以采用堿變性或熱變性堿變性或熱變性使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA變?yōu)閱捂?，能夠進(jìn)行雙向測序；變?yōu)閱捂湥軌蜻M(jìn)行雙向測序；用用M13M13載體制備單鏈載體制備單鏈DNADNAM13M13載體是根據(jù)載體是根據(jù)復(fù)制型復(fù)制型M13M13基因組基因組改進(jìn)的雙鏈改進(jìn)的雙鏈DNADNA，可以和質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，用它感染宿主菌，可以和質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，用它感染宿主菌可產(chǎn)生單鏈模板，但只能制備可產(chǎn)生單鏈模板，但只能制備小片段小片段DNADNA；用用噬菌粒噬菌粒（phagemidphagemid）

44、制備單鏈）制備單鏈DNADNA噬菌粒含有兩個(gè)復(fù)制噬菌粒含有兩個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)為大腸桿菌質(zhì)粒起始位點(diǎn)，一個(gè)是來自起始位點(diǎn)，一個(gè)為大腸桿菌質(zhì)粒起始位點(diǎn)，一個(gè)是來自M13M13、fdfd等單鏈等單鏈DNADNA噬菌體基因組的復(fù)制起始點(diǎn)。當(dāng)大腸桿菌中噬菌體基因組的復(fù)制起始點(diǎn)。當(dāng)大腸桿菌中同同時(shí)含有噬菌粒和輔助噬菌體時(shí)含有噬菌粒和輔助噬菌體時(shí)，因后者攜帶編碼噬菌體復(fù)制時(shí)，因后者攜帶編碼噬菌體復(fù)制酶及外殼蛋白的基因，因此可酶及外殼蛋白的基因，因此可激活噬菌粒激活噬菌粒DNADNA復(fù)制復(fù)制，產(chǎn)生單鏈產(chǎn)生單鏈模板模板。PCRPCR產(chǎn)生單鏈模板產(chǎn)生單鏈模板兩個(gè)兩個(gè)引物中一個(gè)連接有很小的磁珠引物中一個(gè)連接有很

45、小的磁珠，可，可用吸磁的辦法從擴(kuò)增產(chǎn)物中得到單鏈模板。用吸磁的辦法從擴(kuò)增產(chǎn)物中得到單鏈模板。不對稱不對稱PCRPCR。DNADNA聚合酶在延伸多聚核苷酸時(shí)聚合酶在延伸多聚核苷酸時(shí)只有只有3 3 核苷酸配對核苷酸配對正確正確才能進(jìn)行，這可能是為何完全才能進(jìn)行，這可能是為何完全單鏈模板在無引單鏈模板在無引物時(shí)不能起始復(fù)制物時(shí)不能起始復(fù)制的原因。的原因。因?yàn)樵谝驗(yàn)樵谌鄙僖锶鄙僖锏那闆r下，聚合酶的情況下，聚合酶不能確定不能確定3 3 核苷核苷酸配對正確與否酸配對正確與否，無法確定下一步反應(yīng)。，無法確定下一步反應(yīng)。大腸桿菌基因組復(fù)制時(shí)，每個(gè)岡崎片段長大腸桿菌基因組復(fù)制時(shí)，每個(gè)岡崎片段長1000-10

46、00-20002000核苷酸，約需核苷酸，約需40004000個(gè)引物。個(gè)引物。3 3，光點(diǎn)測序光點(diǎn)測序（pyrosequencingpyrosequencing）焦磷酸測序焦磷酸測序涉及四種酶：涉及四種酶：DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase)熒光素酶熒光素酶(luciferase)雙磷酸酶雙磷酸酶(apyrase). 反應(yīng)體系反應(yīng)體系:DNA單鏈單鏈測序引物測序引物。dNTP反應(yīng)底物反應(yīng)底物:APS (adenosine 5 phosphosulfate)熒光素?zé)晒馑?luciferin)在在每一輪每一輪測序反應(yīng)中，只能加入四種測

47、序反應(yīng)中，只能加入四種dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一之一;如該如該dNTP與模板配對與模板配對，聚合酶就可以催化該，聚合酶就可以催化該dNTP摻摻入入到引物鏈中并釋放到引物鏈中并釋放焦磷酸基團(tuán)焦磷酸基團(tuán)（PPi）。）。摻入的摻入的dNTP和釋放的和釋放的焦磷酸焦磷酸是等摩爾數(shù)目的是等摩爾數(shù)目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是是dATP的替代物的替代物;因?yàn)橐驗(yàn)镈NA聚合酶聚合酶對對dATP S的催化的催化效率效率比對比對dATP的催的催化效率化效率高高，且，且dATP S不是熒光素酶的底物不是熒光素

48、酶的底物。硫酸化酶硫酸化酶 催化催化APS和和PPi形成形成ATP，ATP和焦磷酸和焦磷酸的的摩爾數(shù)目摩爾數(shù)目是一致的。是一致的。ATP驅(qū)動驅(qū)動熒光素酶熒光素酶介導(dǎo)的介導(dǎo)的熒光素?zé)晒馑叵蛳蜓趸療晒馑匮趸療晒馑?oxyluciferin) 的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化;氧化熒光素氧化熒光素發(fā)出與發(fā)出與ATP量成正比量成正比的的可見光信號可見光信號。 光信號光信號由由CCD攝像機(jī)攝像機(jī)檢測。檢測。每個(gè)每個(gè)峰的高度峰的高度(光信號光信號)與反應(yīng)中與反應(yīng)中摻摻入的核苷酸數(shù)目入的核苷酸數(shù)目成正比。成正比。 ATP和和未摻入的未摻入的dNTP由由雙磷酸酶雙磷酸酶降解，淬滅光信號，降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。并再生反

49、應(yīng)體系。然后就可以然后就可以加入下一種加入下一種dNTP。 每次只加入一種每次只加入一種dNTP。當(dāng)反應(yīng)液中發(fā)出。當(dāng)反應(yīng)液中發(fā)出亮點(diǎn)亮點(diǎn)時(shí)，可時(shí)，可知核苷酸已摻入，儀器可以記下反應(yīng)。知核苷酸已摻入，儀器可以記下反應(yīng)。如無亮點(diǎn)出現(xiàn)，表明該核苷酸不與模板鏈配對，則不如無亮點(diǎn)出現(xiàn)，表明該核苷酸不與模板鏈配對，則不會出現(xiàn)記錄會出現(xiàn)記錄。連續(xù)快速地依次加入，連續(xù)快速地依次加入，周而復(fù)始，周而復(fù)始，隨著鏈的不斷延伸，隨著鏈的不斷延伸，相應(yīng)的順序也被閱讀。相應(yīng)的順序也被閱讀。4 4，DNADNA芯片測序芯片測序?qū)⒏鞣N排列順序的寡聚核苷酸各種排列順序的寡聚核苷酸點(diǎn)播在面積很小的點(diǎn)播在面積很小的芯片芯片上，每

50、個(gè)點(diǎn)的上，每個(gè)點(diǎn)的寡核苷酸在排列的方陣中都有寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置指定的位置。將待測的將待測的DNADNA分子與芯片溫浴，凡是分子與芯片溫浴，凡是能雜交的寡聚核苷酸都會在確能雜交的寡聚核苷酸都會在確定的位置發(fā)出信號定的位置發(fā)出信號，然后根據(jù)獲取的信息將寡聚核苷酸的順序，然后根據(jù)獲取的信息將寡聚核苷酸的順序進(jìn)行進(jìn)行對比組裝對比組裝，拼接成完整，拼接成完整DNADNA順序。順序。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，可測可測DNADNA片段的長度是芯片上排列的寡聚核苷片段的長度是芯片上排列的寡聚核苷酸數(shù)目的平方根酸數(shù)目的平方根。假如寡聚核苷酸的長度為。假如寡聚核苷酸的長度為8 8個(gè)堿基，則個(gè)堿基，則其

51、可能的排列順序?yàn)槠淇赡艿呐帕许樞驗(yàn)? 48 8=65536=65536，而可讀的片段長度僅為，而可讀的片段長度僅為6553665536的平方根，等于的平方根，等于256bp256bp。即使一個(gè)芯片可容納即使一個(gè)芯片可容納10485761048576個(gè)不同的個(gè)不同的1010堿基堿基寡聚核苷酸寡聚核苷酸，可讀片段長也僅為，可讀片段長也僅為1kb1kb。如果要完成如果要完成1Mb1Mb的測序，以的測序，以2020個(gè)寡聚核苷酸的數(shù)目計(jì)算，個(gè)寡聚核苷酸的數(shù)目計(jì)算，芯片需攜帶的組合數(shù)目將達(dá)芯片需攜帶的組合數(shù)目將達(dá)10101212，只有采用極微量的電子，只有采用極微量的電子操作才能完成。操作才能完成。 5

52、5，自動化測序，自動化測序熒光標(biāo)記物熒光標(biāo)記物：用不同熒光色彩的化合物標(biāo)記：用不同熒光色彩的化合物標(biāo)記ddNTPddNTP，ddATPddATP標(biāo)記紅標(biāo)記紅色熒光、色熒光、ddCTPddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光、標(biāo)記藍(lán)色熒光、ddTTPddTTP標(biāo)記綠色熒光、標(biāo)記綠色熒光、ddGTPddGTP標(biāo)記標(biāo)記黃色熒光。黃色熒光。這這4 4種標(biāo)記的種標(biāo)記的ddNTPddNTP混合加入到混合加入到一個(gè)反應(yīng)一個(gè)反應(yīng)中，聚合反應(yīng)完成后，可以中，聚合反應(yīng)完成后，可以獲得末端分別帶有獲得末端分別帶有A A、C C、T T、G G標(biāo)記的標(biāo)記的DNADNA單鏈。電泳分離的單鏈單鏈。電泳分離的單鏈DNADNA條帶通過監(jiān)測儀時(shí)

53、，發(fā)出不同的顏色信號，由計(jì)算機(jī)讀出堿條帶通過監(jiān)測儀時(shí)，發(fā)出不同的顏色信號，由計(jì)算機(jī)讀出堿基順序?；樞?。自動測序的原理仍然為鏈終止法，但將自動測序的原理仍然為鏈終止法，但將4 4個(gè)反應(yīng)合并為一個(gè)個(gè)反應(yīng)合并為一個(gè)，在一在一個(gè)泳道中進(jìn)行電泳。個(gè)泳道中進(jìn)行電泳。毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳：用：用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯酰胺凝膠平板電泳毛細(xì)管電泳取代聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，可大大提高測序的速度?？纱蟠筇岣邷y序的速度。人類基因組測序中使用的電泳裝置有人類基因組測序中使用的電泳裝置有9696個(gè)泳道個(gè)泳道（一束并列的充（一束并列的充滿凝膠的毛細(xì)管），每次可同時(shí)滿凝膠的毛細(xì)管），每次可同時(shí)進(jìn)行進(jìn)行9696次測序次測序，

54、每輪實(shí)驗(yàn)不每輪實(shí)驗(yàn)不到到2 2小時(shí)，一天可完成近千次反應(yīng)小時(shí)，一天可完成近千次反應(yīng)。序列讀取采用序列讀取采用共聚焦熒光掃描顯微鏡共聚焦熒光掃描顯微鏡，可將核苷酸的熒光標(biāo)記，可將核苷酸的熒光標(biāo)記信號放大并由計(jì)算機(jī)讀取堿基順序。信號放大并由計(jì)算機(jī)讀取堿基順序。Fluorographic detection-Fluorographic detection-熒光檢測熒光檢測6 6，RNARNA序列測定序列測定盡管盡管DNADNA序列分析技術(shù)已相當(dāng)成熟，但有的時(shí)候也需序列分析技術(shù)已相當(dāng)成熟，但有的時(shí)候也需要直接測定要直接測定RNARNA的序列，尤其是對的序列，尤其是對tRNAtRNA和和rRNArRNA

55、分子中分子中存在的被修飾的核苷酸位置的確定存在的被修飾的核苷酸位置的確定。RNARNA序列分析的困難是序列分析的困難是RNARNA分子極易被分子極易被RNARNA酶降解酶降解，有，有關(guān)關(guān)RNARNA的實(shí)驗(yàn)都需要在十分嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。的實(shí)驗(yàn)都需要在十分嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。首先將首先將RNARNA分子的分子的5 5 末端進(jìn)行標(biāo)記末端進(jìn)行標(biāo)記，然后用，然后用專一性專一性RNaseRNase斷開特殊斷開特殊核苷酸的核苷酸的3 3 端端。用適當(dāng)?shù)挠眠m當(dāng)?shù)拿噶亢拖瘯r(shí)間酶量和消化時(shí)間，可產(chǎn)生一個(gè)，可產(chǎn)生一個(gè)RNARNA片段梯度，相鄰片段之片段梯度，相鄰片段之間間只有一個(gè)堿基的差別只有一個(gè)堿基的差別，PAG

56、EPAGE電泳后即可讀出電泳后即可讀出RNARNA的序列。的序列。RNase T1可在可在G堿基堿基后斷裂后斷裂RNA分子；分子；RNase U2可在可在A堿基堿基后斷裂后斷裂RNA分子；分子；RNase Phy M可在可在A和和U堿基堿基后斷裂后斷裂RNA分子；分子；芽孢桿菌芽孢桿菌Bacillus cereus RNase可可在在U和和C堿基堿基后斷開后斷開RNA分子。分子。 三、核酸的保存和定量三、核酸的保存和定量microgram-microgram-微克微克nanogram-nanogram-納克納克picogram-picogram-匹克匹克核酸定量一般采用核酸定量一般采用260n

57、m260nm的吸收值（的吸收值（absorbanceabsorbance）進(jìn)行。進(jìn)行。Spectrophotometer-Spectrophotometer-分光光度計(jì)分光光度計(jì) A A260260=1.0-50g/ml =1.0-50g/ml 雙鏈雙鏈DNADNA。A A260260=1.0-40g/ml =1.0-40g/ml 單鏈單鏈DNADNA或或RNARNA。equivalent to a concentration of equivalent to a concentration of 50g/ml 50g/ml for double-stranded DNAfor double-

58、stranded DNA, or , or 40g/ml for 40g/ml for single-stranded DNA or RNA.single-stranded DNA or RNA. A A260260/ A/ A280280 ratio should be around ratio should be around 1.8 for 1.8 for pure DNApure DNA and and 2.0 for pure RNA preparations2.0 for pure RNA preparations. . 小于以上數(shù)值說明有小于以上數(shù)值說明有蛋白質(zhì)污染蛋白質(zhì)污染，D

59、NADNA樣品該值如樣品該值如果大于果大于1.81.8說明有說明有RNARNA污染污染。溴化乙錠溴化乙錠（ethidium bromideethidium bromide）可以嵌入堿基之）可以嵌入堿基之間，使間，使DNADNA在紫外光下發(fā)出在紫外光下發(fā)出橙色熒光橙色熒光。binds between the DNA bases (intercalates) binds between the DNA bases (intercalates) and fluoresces orange under ultraviolet and fluoresces orange under ultraviole

60、t light. light. 通過比較樣品通過比較樣品DNADNA與與分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)中相當(dāng)條帶的中相當(dāng)條帶的亮度亮度可以估計(jì)可以估計(jì)DNADNA濃度。濃度。 在在0.2M0.2M鹽濃度下，加入鹽濃度下，加入2 2倍體積倍體積乙醇（乙醇（ethanolethanol）或）或異丙醇（異丙醇（isopropanolisopropanol）可以引起）可以引起核酸沉淀核酸沉淀。一般在一般在-20-20進(jìn)行，但這一過程與進(jìn)行，但這一過程與溫度關(guān)系不大溫度關(guān)系不大。沉淀用沉淀用TETE（tris-EDTAtris-EDTA）bufferbuffer溶解。溶解。TrisTris（三羥（三羥甲基氨基甲烷