“細胞生物或?qū)W大實驗”實驗指導(dǎo)

1、“細胞生物學(xué)大實驗”實驗指導(dǎo)動物細胞培養(yǎng)及外源基因的導(dǎo)入細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點， 一是研究對象是活的細胞，可長時期地監(jiān)控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和 生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生 物等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究 的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質(zhì)均一的細胞，需要時述可采 用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體 外培養(yǎng)的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外 還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經(jīng)濟等優(yōu)點

2、。然而，細胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細胞脫離了機體復(fù)雜的環(huán)境條 件，其細胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培 養(yǎng)的細胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細胞 視為一種既保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年 來細胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué) 和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細胞生物學(xué) 家而言，應(yīng)用細胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進行定位、運動及功能研究變得越來 越重要。在克隆一個基因后的下一步，往

3、往是將其導(dǎo)入不同類型細胞，以分析其 表達，測定表達對細胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_的基因產(chǎn)物純化。將外源dna 導(dǎo)入哺乳動物細胞有兩種途徑：穩(wěn)定(永久)或暫時性轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的是 將轉(zhuǎn)移基因整合到細胞染色體dna上，形成穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)移基因的細胞系。一般 需要共轉(zhuǎn)染一個選擇標(biāo)記，用于追蹤轉(zhuǎn)染成功的細胞或轉(zhuǎn)染效率。暫時性轉(zhuǎn)染的 目的是為了分析轉(zhuǎn)移基因的暫時轉(zhuǎn)錄或表達，一般在轉(zhuǎn)染后14天內(nèi)進行。針對 培養(yǎng)細胞的外源dna導(dǎo)入已發(fā)展出多種技術(shù),其中常用的有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染, deae葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法等。這4種方法除deae- 葡聚糖法外，均可用于暫時性轉(zhuǎn)染和永久性轉(zhuǎn)染。但它們

4、有各自適用的細胞系。 培養(yǎng)的細胞不同，其在攝取和表達外源dna的能力上可能存在幾個數(shù)量級的差 異。因此針對細胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要。graham和vander eb (1973)首次報告了用ca3(po4)2-dna沉淀將腺病毒 sv40導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法，wigler等(1978)證明這種方法也能用于導(dǎo)入 并在哺乳動物染色體上穩(wěn)定整合外源dna。至今對于磷酸鈣介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)染的 確切機理仍不清楚。一般認為轉(zhuǎn)移dna通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，然后進入細 胞核，而capo4處理被認為是產(chǎn)生了一種能促使dna附著在細胞表而的環(huán)境。細胞凋亡是細胞的一種基本生命現(xiàn)彖，對于機體的組織發(fā)

5、育、器官分化及 多種病理過程均具有重要作用。細胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征。包括細 胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一 個強有力的生化指標(biāo)是“dnaladder”的產(chǎn)牛，由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶在 凋亡過程中的激活，凋亡細胞的總dna可以在核小體間進行切割，提取總dna 進行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶(dna ladder)o 一般認為 出現(xiàn)dna ladder的細胞肯定發(fā)生了凋亡，但并非所有發(fā)生凋亡的細胞都會出現(xiàn) dnaladdero這種檢測方法也受到靈皺性的限制，只有當(dāng)?shù)蛲黾毎嫉郊毎?量的15%以上時，特異降解的dna經(jīng)過

6、電泳才會較好地顯示dna laddero細胞凋亡的信號可能來自于細胞外部或細胞內(nèi)部。其中死亡受體介導(dǎo)的凋 亡途徑(death-receptor pathway)是細胞外部信號(細胞因子)誘導(dǎo)凋亡的主要 方式。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體家族，其共同特征是具有一個同源的死亡 結(jié)構(gòu)域(death domain, dd,)。當(dāng)死亡受體的配體與之結(jié)合以后或死亡受體本身 過量表達均可促使受體的死亡結(jié)構(gòu)域的寡集化，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(disc, death-inducing signaling complex),disc通過其它一些接頭蛋h(adaptor protein), 活化凋亡特異性蛋白酶ca

7、spase-8,從而啟動凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生包括“dna ladder”在內(nèi)的一系列生理特征。死亡受體中較為典型的是cd95 (fas)和 tnf-rlo在木實驗中，我們在293細胞中過量表達tnf-r1,誘導(dǎo)293細胞凋亡， 觀察凋亡細胞的形態(tài)并檢測其“dnaladder”。一、目的與要求通過本實驗掌握傳代細胞培養(yǎng)的基本方法，了解無菌操作的基本原則。掌握磷酸鈣介導(dǎo)的貼壁細胞的通用轉(zhuǎn)染方法了解細胞凋亡的形態(tài)特征，掌握細胞凋亡dna橄 (“dna ladder”)電 泳檢測法二、實驗內(nèi)容293細胞的傳代培養(yǎng)。將tnf-r1哺乳動物細胞表達質(zhì)粒用磷酸鈣介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染入293細胞， 使其過量，誘導(dǎo)2

8、93細胞凋亡。觀察凋亡的293細胞與對照組細胞的形態(tài)差異。抽提細胞的總dna進行凝膠電泳，檢測udna ladder三、實驗步驟(%1) 293細胞的傳代培養(yǎng)(第一天)1. 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài)，確定傳代比例。為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因 此應(yīng)根據(jù)母細胞的生長密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細胞密度 為50%70%,本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1： 6 傳代即可。2. 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液，加入2mlhank，s 液，輕輕搖動，將溶液倒出。3. 消化與分裝。在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mmedta,0.05

9、%胰蛋白猶液）， 37弋靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓口彼此分離表明消化 完全，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細 胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適 當(dāng)體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，置于37°c二氧化碳培養(yǎng)箱屮培 養(yǎng)。（二）用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細胞屮過量表達tnf-r1c第 二天）1. 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細胞的生長狀態(tài)a. 觀察細胞是否污染b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化c. 觀察細胞的生長密度2. 轉(zhuǎn)染a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10gg （l|

10、ig /pl, 10|il） 質(zhì)粒dna （實驗組為tnf-r1的哺乳動物細胞表達載體，對照組 為空載體），350|il超純水,40mcac12（2.5m）溶液，混勻。b. 在另一 1.5ml離心管中加入400（112xhbs,將a液分三次緩慢加 入，每次加入a液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。c. 將a, b混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)液屮，輕輕 晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37弋二氧化碳培養(yǎng)箱中。（三）凋亡細胞的形態(tài)觀察，“dnaladde的提取及瓊脂糖電泳分析（第三 天）1. 顯微鏡觀察過量表達tnf-r1 （實驗組）和空載體（對照組）的293 細胞形態(tài)上的差異。2. 用1

11、0ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來， 收集到15ml離心管屮，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1 mlpbs重懸, 轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入 200glpbs（0.2mg/ml 蛋白酶 k）,重懸細胞，再加入 200glpbs （2% np40）,顛倒混勻，qc作用30分釗期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離 心2分鐘，吸出上清，加入lml乙醇，顛倒混勻，一2（tc靜置10分 鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50卩1水中，加入 rnasea（10mg/ml）, 37°c 靜置 20 分鐘。3在dna溶液中加入

12、lopldna上樣緩沖液，取出50卩1進行2%瓊脂 糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。四、實驗用品（一）材料：人胚腎細胞系293, tnf-r1哺乳動物細胞表達質(zhì)粒（cscl超 速離心純），哺乳動物細胞表達載體（cscl超速離心純）。（-）儀器，試劑及耗材1細胞培養(yǎng)10cm細胞培養(yǎng)皿，50mk 15ml 次性離心管，10ml玻璃吸管（滅 菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管，二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡。細胞營養(yǎng)液（dmem液體培養(yǎng)基，10%胎牛血清，雙抗100單 位/ml）,消化液（0.05%胰酶，0.53mmedtana）, hank's液。2. 轉(zhuǎn)染20pil, 200）11微量移液器，1.5ml離心管（滅菌），200（11微量移液 器頭。2xhbs液（280mmnacl, lommkcl, 1.5mmnahpo4-2h2o, 12mm 葡萄糖,50mmhepes, ph7.05, 0.2卩