進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中三聚氰胺快速檢測(cè)方法ELISA編制說明

1、WORD格式可編輯進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中三聚氰胺快速檢測(cè)方法ELISA法編制說明一、標(biāo)準(zhǔn)制定的任務(wù)來源及意義本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作是由中華人民共和國國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口，由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局研究起草，計(jì)劃編號(hào)為2008B184本標(biāo)準(zhǔn)制定了進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中三聚氰胺快速檢測(cè)方法ELISA法。三聚氰胺（英文名 Melamine, CAS:108-78-1，分子式 GNH）是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料，禁止在食品和動(dòng)物食品中添加，但因其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè) 氨基氮而被一些不法商販添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源 于2007年3月美國發(fā)生的寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)美國FDA證實(shí)，

2、貓、狗死亡是寵物食品的原料受三聚氰胺污染，并指出其中小麥蛋白原料來自中國， 由此引起了國內(nèi)外對(duì)三聚氰胺的高度關(guān)注。三聚氰胺一方面可能殘留于食用動(dòng) 物組織，進(jìn)而污染畜產(chǎn)品食品；另一方面，三聚氰胺也可以直接污染小麥、大 米等谷物食品。無論何種污染途徑，都可能危害人類健康、甚至造成人類中毒、 死亡的危險(xiǎn)。2008年9月16日，國家質(zhì)檢總局公布了全國嬰幼兒配方奶粉 22 家生產(chǎn)企業(yè)的69批次產(chǎn)品檢出了含量不同的三聚氰胺的檢查結(jié)果，再次將三聚氰胺聚焦為食品安全檢測(cè)中的重要檢測(cè)對(duì)象。三聚氰胺在食品中的限量值，目前僅針對(duì)乳和乳制品。對(duì)于嬰幼兒配方奶 粉限量值我國和香港地區(qū)、澳大利亞、新西蘭、加拿大以及歐盟都

3、制定在1mg/kg， 美國沒有對(duì)嬰幼兒配方奶粉制定一個(gè)控制的限量；我國對(duì)其他乳和含乳15%勺食品限量值為2.5mg/kg。三聚氰胺傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有重量法、升華法，但方法 檢測(cè)限不能滿足要求。近來發(fā)展起了色譜法。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布飼料中三聚氰 胺的測(cè)定公告，確定了飼料中三聚氰胺測(cè)定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1372-2007, 該標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法(HPLC和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/M$, HPLC 法最低定量限為2mg/kg,GC/MSft最低定量限為0.05mg/kg。2008年10月7號(hào)， 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)發(fā)布了原料乳與乳 制品中三聚氰胺檢測(cè)方法(GB/T

4、 22388-2008 )國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了高效液相色 譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法三種方法為三聚氰胺的檢測(cè)方法，檢測(cè)定量限分別為 2 mg/kg、0.05 mg/kg和0.01 mg/kg。2008年10 月15 日，又發(fā)布了原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè) 液相色譜法(GB/T22400-2008)國家標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的定量限為 0.3 mg/kg 。然而，盡管色譜法已經(jīng)很多，但不能完成現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的檢測(cè)，而基于抗 原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)方法是一項(xiàng)大樣本量現(xiàn)場(chǎng)快速的、準(zhǔn)確的、成熟的篩查 檢測(cè)技術(shù)。本項(xiàng)目是參照美國 Abraxis LLC公司建立的動(dòng)物源性食品中三聚氰 胺快速檢測(cè)方法-

5、ELISA法，制定相應(yīng)的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，作為GB/T22388-2008和GB/T22400-2008方法的補(bǔ)充，為實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)針對(duì)動(dòng)物源性食 品中三聚氰胺快速篩查提供檢測(cè)依據(jù)，更為保障我國人民食品安全及對(duì)外出口 貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。二、編制依據(jù)1. 本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T 1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫的規(guī)則、/GN/T 20001.4-2001標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：化學(xué)分析方 法及SN/T 0001-1995出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗(yàn)方法 標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定(簡(jiǎn)稱基本規(guī)定)的要求編寫的。2. 本標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究、評(píng)估和驗(yàn)證后制

6、定的。三、方法概述基于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的原理。先用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液將三聚氰 胺從樣品中萃取出來，再將所獲得的樣品萃取液與三聚氰胺辣根過氧化物酶（HRP耦合物和標(biāo)準(zhǔn)品一起加入包備有三聚氰胺抗體的多孔試劑板的微孔中發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過30分鐘的培養(yǎng)，樣品中的三聚氰胺和三聚氰胺 HRF酶耦合物與三 聚氰胺抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。經(jīng)過這30分鐘的培養(yǎng)，任何沒有結(jié)合的三聚氰胺和三 聚氰胺HRF酶耦合物將被沖洗掉，顯色酶底物加入微孔中，任何結(jié)合的酶耦合 物都會(huì)使液體呈現(xiàn)藍(lán)色。經(jīng)過 10-20分鐘的培養(yǎng)，反應(yīng)結(jié)束，用酶標(biāo)儀讀數(shù)。 將未知樣品的讀數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)比較就能得出樣品中的三聚氰胺濃度。四、主要實(shí)

7、驗(yàn)技術(shù)論證酶聯(lián)免疫法之所以能夠方便快捷地應(yīng)用在食品分析中主要是由于其不需要經(jīng)過繁瑣的凈化步驟，從而大大縮短了時(shí)間。實(shí)驗(yàn)比較了超純水、PBS PBST等幾種常用的掩蔽劑對(duì)于消除基質(zhì)影響的作用情況。結(jié)果顯示采用PBS作為基質(zhì)掩蔽劑可較好地消除基質(zhì)影響。五、方法的主要技術(shù)指標(biāo)1、方法檢測(cè)限研究建立的三聚氰胺直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)方法，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍為 20500卩g/L。經(jīng)加標(biāo)回收試驗(yàn)，針對(duì)嬰兒奶粉和嬰兒豆奶粉的檢測(cè)限<1.0mg/kg，液態(tài)奶及含乳巧克力、乳清粉、酸奶等含乳食品樣品經(jīng)前處理及掩 蔽劑稀釋后的檢測(cè)限< 2.5mg/kg，均滿足目前三聚氰胺的安全限量標(biāo)準(zhǔn) （MRLS

8、 的要求，即針對(duì)嬰幼兒為 1.0mg/kg和其他乳品和含乳制品為 2.5mg/kg。同 時(shí)本方法還使用于肉類（雞、魚肉）、雞蛋和醬油。2、方法精密度嚴(yán)格按本標(biāo)準(zhǔn)所確定的操作程序，對(duì)三聚氰胺檢測(cè)進(jìn)行了精密度的測(cè)試，分別以板內(nèi)變異和板間變異表示。取六個(gè)含不同三聚氰胺濃度的實(shí)驗(yàn)樣品，進(jìn) 行ELISA分析，每個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)樣品作10個(gè)復(fù)孔，對(duì)測(cè)得抑制率（IC）進(jìn)行分析, 變異系數(shù)均V 10 %。取六個(gè)不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行ELISA分析，每個(gè)濃度每天作兩次分析，綜合 5天測(cè)得的抑制率（IC）吸光度值進(jìn)行分析， 變異系數(shù)均V 10 %。3、方法準(zhǔn)確度選擇10種不含三聚氰胺的樣品，分別添加三聚氰胺至

9、樣品中3個(gè)不同含 量水平，提取后采用直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA方法檢測(cè)，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，以加標(biāo) 回收率表示檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，回收率均在81-128%之間（見表1） c表1不同樣品中三聚氰胺的加標(biāo)回收率（n6）樣品加標(biāo)水平（mg/kg）平均回收率（%雞蛋1.81005841088冰激淋2.410451021098巧克力2.5965941088液態(tài)奶0.061170.251200.5102酸奶0.161060.251120.5105肉類（雞肉）1.25812.592590乳糖0.021200.051120.1122嬰兒豆奶粉0.81242.51255128嬰兒奶粉0.11100.25961

10、1164、方法特異性抗三聚氰胺抗體與三嗪類似物的交叉反應(yīng)可用最低檢測(cè)劑量（LLD,約為90%B/B0或用抑制50%勺吸光值所需的劑量（50%B/B0表示。表2抗三聚氰胺抗體交叉反應(yīng)化合物L(fēng)LD (ng/mL)50%B/Bo (n g/mL)三聚氰胺10400三聚氰酸400> 10,000三嗪> 10,000> 10,000三嗪二銨0.12由表2可以看出所制備的抗三聚氰胺抗體與三嗪二銨有交叉反應(yīng)，與三聚氰酸和三嗪的交叉反應(yīng)性則很低。5、三聚氰胺檢測(cè)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證及實(shí)際應(yīng)用依據(jù)GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UP

11、LC-MS/MS驗(yàn)證本研究建立的ELISA方法，結(jié)果見表3。結(jié)果 表明，三聚氰胺直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)與儀器分析結(jié)果一致，但儀器方法回收率偏低。表3三聚氰胺直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)與儀器分析結(jié)果對(duì)照（n=3）加標(biāo)水平ELISAUPLC-MS/MS樣品(mg/kg)回收率（）回收率（%）冰激淋2.410479.3液態(tài)奶0.0611789.4酸奶0.1610674.7嬰兒奶粉0.111079.4應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)約40個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行了三聚氰胺的定量分析，并隨機(jī) 抽取了陰性檢出結(jié)果樣品（n=20），再以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，均未檢出 三聚氰胺殘留，表明陰性檢出準(zhǔn)確率為100%即假陰性為0%進(jìn)一步對(duì)

12、陰性樣品（n=20）進(jìn)行三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，添加水平為0.1 mg/kg 2.4 mg/kg<以本標(biāo)準(zhǔn)所建立的ELISA方法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行比對(duì)分析，添加樣品 的測(cè)定結(jié)果均為陽性，且回收率分布在70%110%之間。6、實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證試驗(yàn)分別對(duì)液態(tài)奶和雞肉樣品添加三聚氰胺，針對(duì)液態(tài)奶添加水平分別為0.5mg/kg、1.0 mg/kg、2.0mg/kg，針對(duì)雞肉樣品添加水平分別為 1.8、5.0 mg/kg、 10.0 mg/kg。上述樣品經(jīng)北京化工大學(xué)分析測(cè)試中心、中國疾控中心、河北局、 天津局、北京生命科學(xué)研究所等五個(gè)實(shí)驗(yàn)室的有關(guān)技術(shù)人員運(yùn)用該測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如表4表

13、4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)室間精密度樣品名稱液態(tài)奶雞肉添加水平mg/kg0.51.02.01.85.010.0參加 單 位北京化工大學(xué)分析測(cè)試中心0.4571.011.831.454.529.250.4120.921.791.574.388.15中國疾控中心0.4470.891.781.694.817.970.4340.931.881.594.278.13河北出入境檢驗(yàn)檢疫局0.4010.871.661.474.118.280.3950.971.611.784.368.69天津出入境檢驗(yàn)檢疫局0.4110.831.731.834.339.010.3980.891.851.514.098.73北京生命科學(xué)研究所0.3881.051.881.884.028.110.4490.941.831.624.168.51平均回收率（）0.420.931.781.644.318.48RSD (%)5.76.65.39.05.15.8六、結(jié)論本標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)便易行，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)食品及農(nóng)產(chǎn)品中的三聚氰胺殘留進(jìn)行篩選檢驗(yàn)。方法的準(zhǔn)確度、精確度、檢測(cè)限均符合殘留物檢測(cè)的定量要求。參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)1、劉梅