第二章基礎(chǔ)知識：核酸2008

1、第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成核酸（nucleic acid） = N 核苷酸 （nucleotide） = N（核苷nucleoside+磷酸） = N（堿基base+戊糖pentose+磷酸） = N（腺嘌呤or鳥嘌呤or胞嘧啶or胸腺嘧啶噢or尿嘧啶 +核糖or脫氧核糖 + 磷酸） = N（A, G, C, T + ribose, deoxyribose + Phosphoric acid ） 核酸大分子水解后得到的基本單位為核苷酸。核苷酸進(jìn)一步水解生成核苷和磷酸。核苷進(jìn)一步分解生成不同的堿基(base)和戊糖（pentose）。核酸的連接a核苷酸之間（跟堿基沒有關(guān)系）： 由核苷上戊糖5 上的羥

2、基與磷酸基團(tuán)以酯鍵形式連接就形成了核苷酸。每個(gè)核苷酸的戊糖3羥基都可以與另一個(gè)核苷酸上的5 磷酸基團(tuán)以酯鍵相連接。 核酸單鏈一端是5 碳原子上帶有磷酸基團(tuán)的核苷酸（稱為5 端），另一端是3 碳原子上仍保留游離羥基的核苷酸殘基（稱為3 端）。每股核酸都有5 和3 兩個(gè)不同的末端，所以核酸分子是有方向性的。 核苷酸還可以環(huán)化形成cAMP和cGMP。核酸的連接堿基與核苷 堿基與戊糖的1 位羥基形成糖苷鍵(glycosidic bond)堿基之間 其中多個(gè)原子都有形成部分雙鍵的特性，使得堿基有很強(qiáng)的共軛性。(波長為260nm的紫外線有最大吸收)。 軸向相鄰的堿基由于具有很強(qiáng)的疏水作用，因此在水相溶液中

3、會自發(fā)的堆積在一起，形成堿基堆積力（ 包括范德華力和疏水作用 ），使得核酸形成更為穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。 堿基的配對模式維持堿基配對的力是：氫鍵和堿基堆積力。戊糖的特點(diǎn)參與組成核酸分子的有兩種核糖，D-核糖和D-脫氧核糖，分別形成RNA和DNA兩種核酸，RNA分子上的核糖比DNA上的脫氧核糖多一個(gè)2羥基，導(dǎo)致其容易發(fā)生自水解作用。第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)DNA的一般結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列順序（堿基的排列順序）。C值：單染色體所含DNA的量。二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)，不同構(gòu)象。三級結(jié)構(gòu)：單鏈和雙鏈、雙鏈和雙鏈相互作用形成的三鏈和四鏈結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)：核酸與蛋白相互作用形成的結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)：DNA不同的構(gòu)象 A

4、，B，C，D，Z等構(gòu)象。 B構(gòu)象是一般狀態(tài)下的構(gòu)象，大小溝深淺一致，大溝寬； A構(gòu)象（矮胖）：濕度變低，大溝變窄變深、小溝變寬變淺；A、B之間在一定條件下可以轉(zhuǎn)換（般繞的松緊，離子，發(fā)生RNA替換等）。 Z構(gòu)象屬于左手螺旋構(gòu)象，嘌呤和嘧啶相間排列，其存在時(shí)，DNA活性明顯降低，天然狀態(tài)下的Z-DNA可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始活性有關(guān)。如猴病毒SV40增強(qiáng)子和纖毛蟲的大小核。DNA的三級結(jié)構(gòu) 三鏈核酸： 單鏈DNA或RNA在雙分子鏈的大溝與堿基形成配對。(同源重組時(shí)單鏈DNA就侵入雙螺旋形成三鏈結(jié)構(gòu)。) 但侵入的單鏈必須與雙螺旋結(jié)構(gòu)中的一條鏈形成配對，形成平行匯接結(jié)構(gòu)（paranemic joint）

5、。此時(shí)需要蛋白參與結(jié)構(gòu)才能穩(wěn)定。H-DNA（hinged DNA，鉸鏈） 這種結(jié)構(gòu)存在于高嘌呤或高嘧啶的雙鏈DNA區(qū)域，且有對映重復(fù)序列。 在真核細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組的起始以及調(diào)節(jié)區(qū)域的許多位點(diǎn)上都有存在。 反義DNA技術(shù)：ODN（oligodeoxyribonucleotides） 四螺旋DNA鳥嘌呤（G）可以形成堿基四聚體（base tetrad）。在體內(nèi)主要是端粒端粒DNA有此結(jié)構(gòu)。在復(fù)制過程中保持DNA的穩(wěn)定性。二、DNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)及其拓?fù)鋵W(xué)特性 DNA在體內(nèi)采取緊密的形式存在。所有細(xì)菌、多種病毒以及真核細(xì)胞中的線粒細(xì)菌、多種病毒以及真核細(xì)胞中的線粒體或葉綠體的體或葉綠體的DN

6、A都是環(huán)形分子都是環(huán)形分子，即沒有游離端的封閉結(jié)構(gòu)。一些病毒的DNA在線形和環(huán)形之間變化。 線形DNA分子閉合形成環(huán)形分子后，雙螺旋的縱軸進(jìn)一步扭曲而形成超螺旋（superhelix）。環(huán)狀DNA的拓?fù)鋮?shù) 連環(huán)數(shù)L（linking number）：一條鏈以右手螺旋纏繞另一條鏈的總次數(shù)。一級結(jié)構(gòu)相同而連環(huán)數(shù)不同的DNA的環(huán)形DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。 纏繞數(shù)T（twisting number）：雙螺旋中兩條鏈的纏繞次數(shù)，即Watson-Crick螺旋的數(shù)目。 超螺旋數(shù)W（writhing number） 三者的相互關(guān)系：L=W+T DNA分子都有維持其B構(gòu)象的趨勢，所以一般情況下T值是固定的，

7、改變L值（擰松或擰緊雙螺旋）會導(dǎo)致超螺旋的出現(xiàn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerases ）有兩種，一種是拓?fù)洚悩?gòu)酶I，可以剪斷雙鏈中的一條鏈，使連環(huán)數(shù)改變1，解超螺旋。一種是拓?fù)洚悩?gòu)酶II，也稱解旋酶（ gyrase ），可以剪斷兩條鏈?zhǔn)沁B環(huán)數(shù)改變2，促進(jìn)超螺旋。Topology Topology：不考慮圖形的大小、形狀，僅考慮點(diǎn)和線的個(gè)數(shù)。 俄羅斯加里寧格勒的普萊格爾河的哥尼斯堡七橋問題，歐拉。三、DNA的特殊結(jié)構(gòu)回文序列（palindromic sequence） 正反書寫完全相同的詞或句子。指的是DNA結(jié)構(gòu)沿同一方向（如5-3 ）序列相同的結(jié)構(gòu)。即堿基序列的反向重復(fù)（inv

8、erted repeats，與對映重復(fù)結(jié)構(gòu)mirror repeats不同）。這種二重對稱的結(jié)構(gòu)要求兩條DNA鏈中的每一條都能發(fā)生鏈內(nèi)互不配對，可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）或在雙鏈中形成十字架結(jié)構(gòu)（cruciform structure）。而對映結(jié)構(gòu)則不可以形成這些結(jié)構(gòu)。 回文結(jié)構(gòu)是許多內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。也是DNA結(jié)合蛋白的特定的識別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。第三節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)一、RNA的結(jié)構(gòu)特征 核糖（2 有羥基，易水解）。 尿嘧啶U代替胸腺嘧啶T。 所含的稀有堿基和修飾堿基比DNA多。 一般為單鏈結(jié)構(gòu)，也有局部的雙螺旋結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)中遵循AU，GC配對原則，但不嚴(yán)格，也有GU配對的情況。二、R

9、NA的主要功能參與基因表達(dá)：mRNA：模板 5%tRNA：運(yùn)送氨基酸根據(jù)密碼合成肽鏈。15%rRNA：核糖體的主要成分，催化合成肽鏈。80%mRNA細(xì)菌與人體mRNA的不同之處：1、功能不同：細(xì)菌的一條mRNA能編碼合成多種蛋白，稱為多順反子，而人體一條mRNA只能合成一種蛋白稱為單順反子。細(xì)菌的mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成發(fā)生在細(xì)胞的同一區(qū)域；而人體則分別發(fā)生在細(xì)胞核和胞質(zhì)的核糖體上。細(xì)菌的mRNA壽命只有幾分鐘而人體mRNA壽命可達(dá)幾小時(shí)。2、結(jié)構(gòu)不同 人體mRNA3 端有一個(gè)長約200個(gè)堿基的多聚A尾巴（polyA），這段序列不是DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄結(jié)束后由polyA聚合酶加上去的。上面

10、結(jié)合有polyA結(jié)合蛋白（PABP），防止其降解。此結(jié)構(gòu)對分離mRNA非常有用。細(xì)菌沒有這樣的結(jié)構(gòu)。 人體mRNA有5-m7Gppp帽子結(jié)構(gòu)，而細(xì)菌、葉綠體、線粒體沒有此種結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)的功能在于幫助mRNA穿越核膜；幫助核糖體mRNA結(jié)合；穩(wěn)定mRNA。rRNA細(xì)菌和人體的核糖體區(qū)別細(xì)菌和人體的核糖體區(qū)別： 1、細(xì)菌核糖體RNA與蛋白比例為2/1，人體為1/1。 2、細(xì)菌核糖體沉降系數(shù)為70S，分別由30S（含有16S rRNA ）小亞基和50S（含有23S和5S rRNA ）大亞基組成。人體核糖體為80S，由40S（含有18S rRNA ）小亞基和60S（含有28S和5.8S rRNA ）大

11、亞基組成。 3、線粒體和葉綠體的核糖體與細(xì)菌類似。rRNA在進(jìn)化研究上的作用 5S或5.8S rRNA在進(jìn)化上有很高的保守性。 不同生物的16S和23S以及結(jié)構(gòu)有高度同源性的序列且二級結(jié)構(gòu)類似，說明所有的核糖體可能有共同的祖先。第四節(jié) 核酸的性質(zhì)一、核酸的變性： 雙螺旋的氫鍵斷裂，變成單鏈，但并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。變性在一個(gè)很窄的溫度區(qū)間發(fā)生（6-8度）。 熱變性和化學(xué)試劑變性。 雙螺旋解開一半時(shí)的溫度稱為DNA的熔解溫度Tm。 雙螺旋在260nm下，有最大吸收。當(dāng)濃度為50ug/ml時(shí)，A=1.00；Tm時(shí)， A=1.185；完全變性時(shí)， A=1.37；同濃度等比例單核苷酸混合時(shí)， A=1.

12、60。DNA變性引起的光吸收度增加稱為增色效應(yīng)。1、核酸的提取分離技術(shù)： DNA和核酸的提取、分離、純化。2、核酸的電泳技術(shù)：瓊脂糖電泳，脈沖場凝膠電泳，變性梯度電泳，雙向瓊脂糖電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠滯后實(shí)驗(yàn)和干擾試驗(yàn)。3、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）技術(shù)：基本PCR技術(shù)，RT-PCR技術(shù)，錨式PCR技術(shù)，差異顯示，免疫PCR，ELISA- PCR技術(shù)。4、序列測定。5、基因工程技術(shù)：載體（質(zhì)粒、l噬菌體、粘粒絲和狀噬菌體），酶（限制性內(nèi)切酶、甲基化酶、聚合酶、連接酶和核酸酶等），轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染，文庫的構(gòu)建和篩選，基因的表達(dá)（細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞等）。6、雜交技術(shù)和生物芯片：核酸的檢測和作圖，各種雜交方法，生物芯片。7、分子標(biāo)記：分子標(biāo)記概念的界定，分子標(biāo)記的種類（限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，縮寫RFLP)，一般選擇單拷貝探針，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性D