顯微鏡-普通格式

1、顯微鏡【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?) 熟悉顯微鏡的構(gòu)造及原理;2) 學(xué)會顯微鏡的調(diào)整和使用、以及測量微小長度的方法;3) 理解數(shù)值孔徑與顯微鏡分辨本領(lǐng)的含義，驗(yàn)證顯微鏡分辨本領(lǐng)與物鏡數(shù)值孔徑的關(guān)系【儀器用具】1) 生物顯微鏡；2) 測微尺；3) 測微目鏡；4) 被測物(透射光柵及生物切片)；5) 2號鑒別率板；6) 光闌及其支架?！緶y量原理】顯微鏡是用來觀察和研究微小物體的助視儀器。顯微鏡已廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和生產(chǎn)和各個領(lǐng)域，沒有顯微鏡的發(fā)明和發(fā)展，就不可能有現(xiàn)代科學(xué)許多領(lǐng)域的發(fā)展。1) 顯微鏡的基本光路圖 1 顯微鏡的光路圖顯微鏡的最主要部分是物鏡和目鏡。為了簡單起見，可以把構(gòu)造復(fù)雜的物鏡和目鏡都當(dāng)

2、作是一單獨(dú)的薄凸透鏡。其光路見圖1。 物鏡LO的焦距很短，待觀察物體PQ放在它前面距離略大于的地方(設(shè)物距為)使PQ經(jīng)LO 后成一放大實(shí)象P'Q'(設(shè)象距為)。然后再用目鏡LE作為放大鏡來觀察這個中間象。中間象P'Q'應(yīng)放在目鏡LE的第一焦點(diǎn)FE以內(nèi)(設(shè)物距為)，經(jīng)過目鏡后在明視距離(25cm)處成一放大虛象P"Q"。因?yàn)?式中代表目鏡與顯微鏡最后成的象P"Q"的距離，代表物鏡的第二焦點(diǎn)到目鏡的第一焦點(diǎn)FE的距離，即光學(xué)間隔。所以在、給定不變的情況下,是一個確定的數(shù)值，其大小略大于,只有等于這個數(shù)值時我們才能通過目鏡在明視

3、距離處看到清晰的象P"Q"。從顯微鏡中能看到物體的清晰圖象時，物鏡前表面到被觀察物體的距離叫做顯微鏡的工作距離, 它近似等于。為了得到清晰圖像而進(jìn)行的調(diào)節(jié)大小的工作叫調(diào)焦。增長一點(diǎn)或減小一點(diǎn)仍然可以看清物體的圖象.這個允許增大及減小的最大范圍叫做焦深(depth of focus)。2) 顯微鏡的放大本領(lǐng)物鏡的橫向放大率為, 目鏡的橫向放大率為 而顯微鏡的橫向放大率定義為P"Q"的長度與物體PQ 長度之比，即，由此可得放大倍數(shù)的關(guān)系式為 物鏡的橫向放大率近似地等于物鏡和目鏡的光學(xué)間隔(到FE的距離)除以物鏡的第二焦距, 即 由此式可以看出物鏡的放大率并不

4、是物鏡本身固有的一個特征，除了與物鏡自身的焦距有關(guān)，還與物鏡、目鏡之間的光學(xué)間隔有關(guān)。而目鏡的橫向放大率可近似為 故顯微鏡的橫向放大率為。當(dāng)P"Q"成象在明視距離S"時，顯微鏡的視角放大率與橫向放大率數(shù)值相等，此時有 3) 顯微鏡的分辨本領(lǐng)圖 2艾里斑一個點(diǎn)光源經(jīng)透鏡成像后，在普通對比度下，呈現(xiàn)為一個亮點(diǎn)，然而增強(qiáng)對比度后，會發(fā)現(xiàn)物像不是一個點(diǎn)，而是一個衍射花樣，中央是明亮的圓斑，周圍有一組較弱的明暗相間的同心環(huán)狀條紋，把其中以第一暗環(huán)為界限的中央亮斑稱作艾里斑，見圖2。艾里斑是以英國皇家天文學(xué)家喬治·比德爾·艾里的名字命名的。因?yàn)樗?835

5、年的論文中第一次給出了這個現(xiàn)象的理論解釋。兩個點(diǎn)光源所成的像將是兩個愛里斑。如果這兩個點(diǎn)光源（兩個物點(diǎn)）相距很近，而他們形成的衍射圓斑又比較大，以至兩個圓斑絕大部分互相重疊，那就分辨不出是兩個物點(diǎn)了。如果一個點(diǎn)光源的衍射圖樣的中心剛好與另一個點(diǎn)光源的衍射圖樣的第一級暗紋相重合，一般人的眼睛就能剛好分辨出這是兩個光點(diǎn)的像。這時，我們說這兩個點(diǎn)光源恰好為這一光學(xué)儀器所分辨。這一恰能分辨的條件稱為 瑞利（Reyleigh）準(zhǔn)則。圖 Error! Main Document Only.能夠分辨、不能分辨、恰能分辨3種情況比較圖3所示為光學(xué)系統(tǒng)能夠分辨，不能分辨和恰能分辨3種情況的比較。根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，光

6、學(xué)系統(tǒng)的最小分辨角就是艾里斑的角半徑。對于直徑為D的物鏡，這一角半徑可以表示為： 根據(jù)顯微鏡的性能，它的分辨本領(lǐng)不用最小分辨角而用最小分辨距離來衡量。從（9）式出發(fā)，再結(jié)合阿貝正弦條件可以導(dǎo)出顯微鏡的最小分辨距離： 其中 為物方的折射率， 為孔徑對物點(diǎn)的半張角。稱為顯微鏡的數(shù)值孔徑，用NA表示。并將其具體數(shù)值標(biāo)在顯微鏡的物鏡上。在波長一定的情況下，數(shù)值孔徑越大，顯微鏡的分辨率也就越高。圖4所示為低、中、高三種數(shù)值孔徑的情況。圖 4低、中、高三種數(shù)值孔徑圖 5不同數(shù)值孔徑的物鏡的成像效果對于高數(shù)值孔徑的情況，可以清晰分辨出各個小球，而對于中數(shù)值孔徑物鏡成的像，分辨起來就比較困難，在低數(shù)值孔徑的情

7、況下，所有小球的像重疊在一起，根本無法分辨出單個小球。圖 5不同數(shù)值孔徑的物鏡的成像效果【儀器介紹】1) 顯微鏡的構(gòu)造圖 6顯微鏡的構(gòu)造實(shí)際使用中的顯微鏡種類很多，構(gòu)造也比較復(fù)雜。我們實(shí)驗(yàn)中將要使用的生物顯微鏡的構(gòu)造如圖5. 老式顯微鏡多采用直筒鏡臺，其鏡筒是直的，但為了以比較舒適的姿勢進(jìn)行觀察, 可以借助于鏡座附近的傾斜關(guān)節(jié)向前傾斜鏡筒。這種類型的顯微鏡的光源就安裝在鏡座內(nèi)，鏡筒通過棱鏡系統(tǒng)向觀察者傾斜一定的角度，而載物臺呈水平位置 ，它的聚焦可以通過移動載物臺進(jìn)行，因此鏡筒是完全固定的，這就使得在鏡筒上可以裝置照相機(jī)、投影屏、光度計(jì)等各種較重得附件，大大開拓了了顯微鏡的用途。實(shí)驗(yàn)中用的生物

8、顯微鏡配有10×，40×，100×的物鏡和5×，10×，16×的目鏡各一套，將它們相互組合可以得到不同的放大倍數(shù)。不同放大倍數(shù)的物鏡和目鏡,，其焦距和孔徑是不同的。放大倍數(shù)越大，焦距就越短，孔徑就越小。在使用高倍鏡頭時因有焦深小、視場小、工作距離短及視場暗等特點(diǎn)，給調(diào)節(jié)帶來一定困難，使用中要格外小心。這種顯微鏡在使用人工光源時, 可以先開啟電源開關(guān)，調(diào)節(jié)亮度鈕可以改變燈泡發(fā)光亮度以獲得最佳照明；使用自然光源時，將集光鏡逆時針旋轉(zhuǎn)到位后拿下，換上反射鏡，調(diào)節(jié)反射可獲行明亮的視場。物鏡是顯微鏡的最重要元件，是裝在一個鏡頭內(nèi)部的一組透鏡，其

9、中最前面的一塊稱為“前透鏡”,是唯一起放大作用的透鏡，其余透鏡因只用來消除前透鏡的象差, 故稱為修正透鏡。轉(zhuǎn)動粗動手輪可使工作臺較快地升高或降低，調(diào)節(jié)微調(diào)手輪可看到清晰的象。轉(zhuǎn)動工作臺上縱向移動手輪使工作臺同標(biāo)本作前后方向移動，轉(zhuǎn)動橫向移動手輪可使標(biāo)本作左右方向移動。2) 測微目鏡圖 7測微目鏡及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)測微目鏡是帶測微裝置的目鏡，由目鏡、 可動分劃板、讀數(shù)鼓輪與連接裝置等組成，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。目鏡把叉絲和被觀測的像同時放大，其放大倍數(shù)不影響測量數(shù)據(jù)的大小。旋轉(zhuǎn)鼓輪，刻有十字叉絲的可動分劃板就可以左右移動，它的位置可以在外面直接讀出。測量時，應(yīng)先調(diào)節(jié)目鏡，看清楚叉絲，然后轉(zhuǎn)動鼓輪，使基準(zhǔn)線

10、與被測物的像一端重合，便可得到一個讀數(shù)。再轉(zhuǎn)動鼓輪使基準(zhǔn)線與被測物像的另一端重合，又可得到一個讀數(shù)。兩讀數(shù)之差，即被測物的尺寸。 其讀數(shù)方法和螺旋測微器差不多，測量時，雙基準(zhǔn)線夾住待測刻線時讀數(shù)，整數(shù)位在視野中讀取，小數(shù)位在鼓輪上讀取。讀數(shù)鼓輪每旋轉(zhuǎn)一周，叉絲移動1mm，鼓輪上有100個分格，故每一格對應(yīng)的讀數(shù)為0.01mm，再估讀一位。注意事項(xiàng)：4) 測量時，鼓輪應(yīng)沿同一方向旋轉(zhuǎn)，不得中途反向，以避免空程誤差。5) 被測量物的線度方向必須與基準(zhǔn)線方向平行，否則會引入系統(tǒng)誤差。 6) 被測量物的像與基準(zhǔn)線重合，不能存在視差 7) 雖然測微目鏡測量范圍為010mm，但一般測量應(yīng)盡量控制在19mm

11、范圍內(nèi)進(jìn)行，以保護(hù)測微裝置的準(zhǔn)確度，切忌讀出負(fù)值。 8) 零點(diǎn)修正值的存在，注意整數(shù)位的讀法。3) 測微尺圖 8測微尺物鏡測微尺為一特制的玻片，中央圓圈內(nèi)有一個1毫米（mm）長分為100個等距離小格的刻線，每一個小格即為10微米（µm）（圖8）。4) 分辨率版圖 9分辨率板結(jié)構(gòu)分辨率板的結(jié)構(gòu)如圖9所示。常用的分辨率板有兩種，每板上面都有25個單元圖案，每個單元有四個方向，每個方向都由一些平行的刻線所組成的。2號板從第1單元到25單元，條紋寬度從20 遞減到5；3號板則從40遞減到10。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作要點(diǎn)】1) 顯微鏡的調(diào)節(jié)和使用:裝上目鏡和物鏡,物鏡可裝10×及40

12、15;兩種。先用低倍物鏡，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，聽到“咔”的響聲后，說明物鏡已對準(zhǔn)了目鏡。接通照明電源并撥動亮度調(diào)節(jié)鈕，使視場內(nèi)亮度適當(dāng)。將被觀察的樣品放在載物臺上，先用低倍物鏡尋找被觀察的部位。旋動調(diào)焦粗調(diào)及微調(diào)手輪，直到看見清晰的象，將被觀察部分利用工作臺的縱向及橫向移動手輪調(diào)到視場中心。如果要用高倍物鏡時，可轉(zhuǎn)動物鏡換上高倍物鏡，然后稍微調(diào)節(jié)微調(diào)手輪，就可以清晰聚焦了(注意：生物顯微鏡由低倍換高倍這個辦法是有條件的，即物與物鏡之間不能有東西，或者只有厚度小于0.17mm的蓋玻片，否則換高倍鏡頭用這個方法，鏡頭會碰到樣品造成損失）。由于高倍物鏡的工作距離很短，如我們這次用的生物顯微鏡的工作距離為

13、：10×物鏡工作距離為6.3mm，40×時為0.5mm，100×時為0.1mm。調(diào)焦一不小心就可能使物鏡與被觀察物擠壓而造成物鏡或被觀察樣品的損壞。為了避免這種事故，我們規(guī)定此種顯微鏡的調(diào)焦操作規(guī)程如下：先調(diào)整旋鈕使工作臺慢慢升高，使被觀察物慢慢靠近物鏡頭而不接觸。做這一步時眼睛必須在旁邊監(jiān)視，千萬不要讓被觀察樣品與物鏡頭相接觸！ 然后眼睛通過目鏡觀察視場，這時只允許工作臺下降使樣品與鏡頭之間的距離增大進(jìn)行調(diào)焦工作。這個規(guī)定無論使用多大放大倍數(shù)的鏡頭都必須嚴(yán)格遵守.2) 物鏡放大倍數(shù)的測定、微小物體的長度測量1用測微目鏡代替顯微鏡的目鏡，調(diào)節(jié)照明亮度，把測微尺放在

14、顯微鏡載物臺上 ,調(diào)焦。測量測微尺的某一段長度 (盡量取大些，以減小誤差)經(jīng)物鏡放大后的中間象長 (注意使測微目鏡中刻度尺的方向與的 方向一致)。從而計(jì)算出物鏡的放大倍數(shù) ，與物鏡上所標(biāo)的數(shù)值作比較，說明二者不同的原因。.2將測微尺換成全息光柵，調(diào)焦，測出光柵條紋間距 經(jīng)物鏡放大后的中間象長 ，由此得出未知長度 (可測量若干條條紋間距再除以條數(shù)得到 )，算出光柵的空間頻率 。3) 顯微鏡分辨本領(lǐng)的測定1仍用10×目鏡代替測微目鏡，將移測顯微鏡上用的3×物鏡裝在生物顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器上。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使3×物鏡對準(zhǔn)鏡筒。把裝在特制套筒里的鑒別率板放在載物平臺上，調(diào)

15、顯微鏡的照明并調(diào)焦，使2 號鑒別率板從顯微鏡中看去最清楚，并轉(zhuǎn)動工作臺的縱向和橫向移動手輪，使鑒別率板的圖象在視野正中。將帶有小圓孔的特制圓罩蓋在鑒別率板套筒上，小圓孔與物鏡頭的距離很近。重新調(diào)整載物臺的縱向及橫向移動手輪，使圓孔與顯微鏡共軸。從顯微鏡中看到的鑒別率板有25組方塊，每組方塊中有四組平行條紋，其中單元號碼小的平行條紋間距大，號碼大的條紋間距小。號碼大到一定程度方塊中會模糊一片，看不出條紋。記住那個臨界的剛剛能看出有條紋的方塊號碼(每一組中有四個方塊，只要一個方塊個中看出有條紋就算這一組有條紋)。從本實(shí)驗(yàn)的附表中查出2號鑒別率板相應(yīng)單元號碼的條紋寬度，這個便是加了圓孔光闌的被測顯微

16、鏡實(shí)際的最小分辨距離。這是實(shí)驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)(記作)。測量物鏡的數(shù)值孔徑由光闌與鑒別率板之間的距離以及光闌的孔徑，代入 算出數(shù)值孔徑。其中、的值由測量顯微鏡測出。將值代入(10)式，即可算出(理論)值(其中按550nm計(jì)算)。將與作比較。 注意:鑒別率板上復(fù)蓋有一層較厚的玻璃片，因此不得用高倍物鏡去觀察它, 否則會損壞儀器。用低倍物鏡已足夠清楚。【數(shù)據(jù)記錄】1) 物鏡放大率的測量次數(shù)測微尺格數(shù)n起始 終止 平均值 2) 光柵條紋間距的測量次數(shù)條紋格數(shù)n起始 終止 平均值光柵空間周期 3) 顯微鏡分辨本領(lǐng)分辨率實(shí)驗(yàn)值光闌直徑(mm)剛能分辨的單元號碼條紋寬度w（）分辨率實(shí)驗(yàn)值 (m）物鏡數(shù)值孔徑的測

17、量光闌直徑(mm)光闌與鑒別率板之間的距離 d(mm)數(shù)值孔徑NA= 分辨率實(shí)驗(yàn)值和理論值的對比光闌直徑(mm)（）分辨率實(shí)驗(yàn)值 （）附表： 分辨率板條紋寬度及分辨率角值分辨率板號2 號3 號單元號碼單元中每組條紋數(shù)條紋寬度（m）為名義值時分辨率角值（秒）條紋寬度（m）為名義值時分辨率角值（秒）1420.015.0040.030.002418.914.1837.828.353417.813.3535.626.74516.812.6033.625.205515.911.9331.723.786515.011.2530.022.507614.110.5828.321.238613.39.9826.

18、720.039612.69.4525.218.9010711.98.9323.817.8511711.28.4022.516.8812810.67.9521.215.9013810.07.5020.015.001499.47.0518.914.181598.96.6817.813.3516108.46.3016.812.6017117.95.9315.911.9318117.55.6315.011.2519127.15.3314.110.5820136.75.0313.39.9821146.34.7312.69.4522145.94.4311.98.9323155.64.2011.28.402

19、4165.33.9810.67.9525175.03.7510.07.50【思考題】1.在實(shí)驗(yàn)中測出的物鏡放大倍數(shù)經(jīng)常比標(biāo)稱值大很多，比如測得0=46.85，而標(biāo)稱值才40，這是為什么？2. 一張全息照片的干涉條紋最密得是2500lin/mm，即干涉條紋的空間周期為0. 4m，如欲在生物顯微鏡下觀察，試問不用油鏡頭又行不行？為什么？(注:生物顯微鏡的100×物鏡使用時要在物和物鏡間加油，以便增大NA值，所以把這個鏡頭叫做油鏡頭。)已知油鏡頭( 物鏡)的放大倍數(shù)為100×，數(shù)值孔徑為1.25，而放大倍數(shù)僅次于它的物鏡為40×，數(shù)值孔徑為0.65, 照明光波長以于55

20、0nm計(jì)算。（要有計(jì)算過程）【閱讀材料】光學(xué)顯微鏡如何變成納米顯微鏡2014 年諾貝爾化學(xué)獎介紹2014 年 10 月 9 日瑞典皇家科學(xué)院宣布把 2014 年諾貝爾化學(xué)獎授予埃里克貝齊格、斯特凡黑爾和威廉莫納，以表彰他們在超分辨率熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域取得的突破性成就。血紅細(xì)胞，細(xì)菌，酵母菌以及游動的精子。當(dāng)17世紀(jì)的科學(xué)家們第一次在光學(xué)顯微鏡下看到這些活生生的生物現(xiàn)象時，一個嶄新的世界在他們的眼前打開了。這就是光學(xué)顯微成像技術(shù)的誕生。自那以后，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究領(lǐng)域最重要的工具之一。圖 1：在19世紀(jì)末，恩斯特阿貝（Ernst Abbe）對光學(xué)顯微鏡的分辨率限制做出了界定，認(rèn)為大約是光波長的一半，即約為0.2微米。這意味著科學(xué)家們可以辨別完整細(xì)胞，以及其中一些被稱為細(xì)胞器的組成部分。然而，他們卻無法分辨一個正常大小的病毒或者單個蛋白質(zhì)。然而，長期以來，光學(xué)顯微成像技術(shù)的發(fā)展卻一直受制于一個物理極限值的約束。1873年，顯微技術(shù)專家Ernst Abbe提出了傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)的物理極限值：這種技術(shù)的分辨率將永遠(yuǎn)不能超過0.2微米。這一預(yù)言導(dǎo)致在20世紀(jì)的絕大多數(shù)時間里，科學(xué)家們都相信光學(xué)顯微成像技術(shù)將永遠(yuǎn)無法讓他們突破到更細(xì)微的尺度上(圖 1)。一些細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器，如為細(xì)胞活動提供能量的線粒體，它們的輪廓是可以看到的。但要