CIK細(xì)胞臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范探討

1、cik細(xì)胞臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范探討作者：朱建平等單位：無錫旺莊醫(yī)院牛物治療中心關(guān)鍵詞：生物技術(shù)生物制品細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokin induced killer cells, cik細(xì)胞)因具有體外增殖倍數(shù)高、 抗瘤譜廣、殺瘤活性強(qiáng)、副作用極小等特點(diǎn)而受到關(guān)注。研究表明，cik細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的 殺傷作用是lak細(xì)胞的100倍。cik細(xì)胞過繼性免疫治療是腫瘤治療中的一項(xiàng)新技術(shù)，s 前己逐步在臨床上應(yīng)用，兇此，制訂科學(xué)、嚴(yán)格的技術(shù)規(guī)范對(duì)該技術(shù)的正確使用及推廣意義 重大。但迄今國內(nèi)述沒有關(guān)于cik細(xì)胞培養(yǎng)和臨床應(yīng)用的統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范。無錫旺莊醫(yī)院主 物治療中心參考國家食品藥晶監(jiān)督管理局1999年制

2、訂的新牛物制品市批辦法和美國fda 1998年制訂的人體細(xì)胞治療和基因治療指導(dǎo)原則，結(jié)合數(shù)年的cik細(xì)胞臨床應(yīng)川經(jīng)驗(yàn)， 制訂出我們的c1k細(xì)胞臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范，現(xiàn)介紹如下，供同行切磋和討論，以期促成全 國性統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范的早口制定。1cik細(xì)胞培養(yǎng)條件l1細(xì)胞培養(yǎng)場地符合國家gmp標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，采用彩綱板框架，自流平地而，保持符合實(shí)驗(yàn)室要求的恒定 溫度和濕度。細(xì)胞培養(yǎng)場地應(yīng)定期清潔和消毒。1.2主要材料與試劑細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)該川無血清培養(yǎng)基，其他細(xì)胞活化因子采用國內(nèi)外正式廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，藥甜 應(yīng)有國藥準(zhǔn)字文號(hào)。每批新的試劑都應(yīng)該進(jìn)行無菌試驗(yàn)及活性測定。一次性使用的物品不得 重復(fù)使用。1.3消毒實(shí)驗(yàn)器械、

3、用品，凡能t烤的，應(yīng)在180 °c烤2h (或200 °clh),其他物品用高壓熬汽消 毒。2cik細(xì)胞制備2細(xì)胞供體(培養(yǎng)用單個(gè)核細(xì)胞來源)口體細(xì)胞：采集患者口體外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。 自體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是可以避免交叉感染。同種異體細(xì)胞：細(xì)胞來源必須是當(dāng)?shù)刂行难静杉?符合獻(xiàn)血條件的健廉獻(xiàn)血員細(xì)胞。一些中、晚期腫瘤患者或接受放、化療后的患者，由于機(jī) 體免疫功能低下，外周血屮的單個(gè)核細(xì)胞無法進(jìn)行擴(kuò)增，因此可川同種異體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。 有些學(xué)者認(rèn)為，腫瘤患者存在免疫耐受，自體來源的cik細(xì)胞無法打破免疫耐受，發(fā)揮有 效殺瘤功能，建議應(yīng)用異體來源的cik細(xì)胞進(jìn)行治療。2.2 cik

4、細(xì)胞培養(yǎng)2.2.1 cik細(xì)胞培養(yǎng)方法口前主要參照美國斯坦福人v骨髓移植中心建立的cik細(xì)胞培養(yǎng) 方法：第0天加入ifn-γ500u/ml,置37°c、5%co2孵箱中培養(yǎng)24h,第1天加入 il-2300u/ml, cd310ng/ml, il-1100u/ml繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞牛長并根據(jù)情況進(jìn)行擴(kuò) 增。2.2.3 cik細(xì)胞培養(yǎng)吋間培養(yǎng)10d后細(xì)胞就表現(xiàn)出殺瘤活性，1520d達(dá)到高峰，因此臨床 用cik細(xì)胞應(yīng)在培養(yǎng)后的1020d內(nèi)收獲。2.2.4 cik細(xì)胞的形態(tài)及表面標(biāo)記在顯微鏡下細(xì)胞呈惻形，體積增人，胞質(zhì)飽滿，折光性 好，有顆粒，核增人，細(xì)胞表面有很多

5、突起和偽足。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)cd3+cd56-及 cd3+cd56+細(xì)胞增多。有報(bào)道，cik細(xì)胞的殺傷活性主耍來口 cd3+cd56+雙陽性細(xì)胞。2.2.5 c1k細(xì)胞殺傷活性檢測采川曝畔藍(lán)(mtt)法或乳酸脫氫酶(ldh)釋放法測定殺傷活性，當(dāng)效/靶比為20:1時(shí)， 應(yīng)保證cik細(xì)胞對(duì)自然殺傷細(xì)胞(nk)敏感腫瘤株k56-細(xì)胞的殺傷率人于50%,對(duì)nk不 敏感腫瘤株raji細(xì)胞的殺傷率大于30%o2.2.6 cik細(xì)胞質(zhì)檢cik細(xì)胞質(zhì)檢包扌舌無菌檢測（需氧菌檢測，厭氧菌檢測，真菌檢測， 支原體檢測）、細(xì)胞活率檢測和熱源檢測。2.2.7 c1k細(xì)胞收獲培養(yǎng)終止后離心棄上淸液，用生理鹽水洗滌細(xì)

6、胞2次以上，重新混勻, 懸于100200ml輸注用生理鹽水中。3cik細(xì)胞臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道，cik細(xì)胞對(duì)多種實(shí)體腫瘤均有明就療效，對(duì)白血病也有很好作用，尤其是忖髓 移植或化療緩解后能夠清除殘存的腫瘤細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)。cik細(xì)胞治療腫瘤的療效除與輸注 細(xì)胞數(shù)量及活性有明顯關(guān)系外，還與患者的選擇有很大關(guān)系。3適應(yīng)證cik細(xì)胞可川于下述腫瘤患者的輔助治療：手術(shù)后患者，可防止腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；無法 進(jìn)行手術(shù)、放療、化療的中晚期患者；放療、化療失敗的患者；放療或化療后患者的綜 合治療；骨髄移植后或化療緩解后的白血病患者；癌性胸、腹腔積液患者。cik細(xì)胞 治療乙型、丙型肝炎也有一定效果。3.2病例選擇患者預(yù)期生

7、存&gt；3個(gè)月，生存質(zhì)量評(píng)分（kps） > 60%o重要生命器官功能正常, 血膽紅素<68μmol/l,天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶<90iu/l,肌酊<353μmol/l,白細(xì) 胞計(jì)數(shù)>3.5×10*9/l,血小板計(jì)數(shù)>80× 10*9/l,紅細(xì)胞壓積>0.20o 無嚴(yán) 重的病毒、細(xì)菌感染。非妊娠及哺乳期患者。對(duì)生物制品過無敏反應(yīng)者。3.3中斷治療在治療期間出現(xiàn)明顯的毒副作用；重要生命器官出現(xiàn)明顯功能并常；患者因某種原因提出 終

8、止治療。3.4治療方案根據(jù)治療途徑可分為金身治療和局部治療。全身治療是通過靜脈輸注進(jìn)行；局部治療是將 收獲的濃縮cik細(xì)胞直接注入病灶部位（胸、腹腔積液患者直接注入胸、腹腔內(nèi)），也可通 過介入方法。3.5治療過程3.5.1自體細(xì)胞治療 第13天連續(xù)給患者注射il-2,每天50萬u,第4天采集患者自體 外周血50100ml并做分離培養(yǎng)，第20天開始輸注cik細(xì)胞，每天1次，連續(xù)5d為1個(gè) 療程;也可2dl次，5次為1個(gè)療程。3.5.2異體細(xì)胞治療 將擴(kuò)增好的同種異體cik細(xì)胞輸注給患者進(jìn)行治療，方法同上。3.5輸注cik細(xì)胞數(shù)量研究表明，當(dāng)輸注的cik細(xì)胞數(shù)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)就可岀現(xiàn)明顯的治療效果，

9、其效果并不隨 著輸注細(xì)胞增加而呈線性增大。cik細(xì)胞輸注數(shù)量：每次輸注的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)<2×10*9,每療程輸注細(xì)胞數(shù)應(yīng) >l×10*10o每次輸注的細(xì)胞中加入il-2i00萬u。3.6毒副作用及處理cik細(xì)胞治療中可能出現(xiàn)的主要毒副作用是寒戰(zhàn)、發(fā)熱、乏力。發(fā)熱常常出現(xiàn)在治療后4 8h,體溫一般38°c左右，發(fā)熱在24h內(nèi)?？删徑?，不需特殊處理。對(duì)體溫超過39°c的患 者可用退熱藥解除癥狀。極少數(shù)患者可能出現(xiàn)惡心等消化道癥狀，個(gè)別患者可見皮疹等過敏 反應(yīng)，給予對(duì)癥處理可緩解癥狀。4療效評(píng)估療效評(píng)估的主要指標(biāo)：形

10、態(tài)學(xué)檢查（腫瘤人小變化），腫瘤標(biāo)志檢測，免疫功能檢測，生命 質(zhì)量評(píng)價(jià)，以及生存期觀察等。4.1形態(tài)學(xué)檢査應(yīng)川影像學(xué)手段，觀察腫瘤治療前后人小的變化。4.1.1 who通用實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)完全緩解(cr)：所有可見病變完全消失至少維持4 周以上。部分緩解(pr)：腫瘤病灶最大徑及垂直徑乘積減少50%以上，并維持4周以上。 好轉(zhuǎn)(mr)：腫瘤病灶的二徑乘積縮小25%以上，但小于50%,無新病灶出現(xiàn)。穩(wěn)定(sd)： 腫瘤病灶的二徑乘積縮小小于25%,或增大小于25%,無新病灶出現(xiàn)。病情進(jìn)展(pd)：腫 瘤病灶的兩徑乘積增人25%,或出現(xiàn)新的病灶。4.1.2胸、腹腔積液療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)胸、腹腔積液均分為

11、3個(gè)量級(jí)，即大量、中量、少量。 胸腔積液在第2前肋下緣水平以上者為大量;第2前肋下緣至第5前肋下緣水平者為中量; 第5前肋下緣水平以下者為少量。腹腔積液量級(jí)根據(jù)腹部b超檢查確定，全腹腔及肝臟周 圍均有液體為大量；腹腔和盆腔內(nèi)有液體(上腹腔無積液)為中量；單純盆腔內(nèi)并限于膀胱 后壁及周圍有積液，英液性喑區(qū)不超過5cm為少量。完全緩解(cr)：胸、腹腔積液完全消失，維持1個(gè)月以上，經(jīng)臨床、x線和b超檢查未 見異常。部分緩解(pr)：胸、腹腔積液降低1個(gè)量級(jí)，維持1個(gè)月以上。微小反應(yīng)(mr)：胸、腹腔積液在同一量級(jí)內(nèi)減少，維持1個(gè)月。穩(wěn)定(sd)：胸、腹腔積液在同一量級(jí)內(nèi)維持原來水平，維持1個(gè)月以上。述展(pd)：胸、腹腔積液較原來水平增加。有效率=(cr+pr) /可觀察的治療總數(shù)× 100%4.2實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)實(shí)驗(yàn)室常用指標(biāo)主耍有腫瘤標(biāo)志檢測和免疫功能檢測。腫瘤標(biāo)志檢測:甲胎蛋白、癌胚抗原、ca199、前列腺特異抗原等,觀察治療前后腫瘤 標(biāo)志物變化以判斷療效。免疫功能檢測：常用的有t淋巴細(xì)胞亞群、nk細(xì)胞活性檢測以及特顯性ctl細(xì)胞測定。 外周血t淋巴細(xì)胞及其亞群正常參考值：cd3, 64.85±2.37； cd4,42.45&plu