酶法合成阿莫西林原理

1、酶法合成阿莫西林原理作者:日期:酶法合成阿莫西林介紹B -內(nèi)酰胺抗生素經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，己成為抗生素中的最主要類型之一。由 于具有良好的抗菌效力，較低的毒副作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，其發(fā)展非常迅速。 現(xiàn)全世界耗用量已過(guò)萬(wàn)噸，預(yù)計(jì)今后還會(huì)增長(zhǎng)。其中，青霉素和頭抱菌素為最重要的兩大類B -內(nèi)酰胺抗生素。酶法合成技術(shù)始于 20世紀(jì)6 0年代末70年代初, 經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，現(xiàn)在酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面 取得很大的發(fā)展，配套技術(shù)日益完善，具備了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。全球著名的B -內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)廠家如荷蘭 D SM公司已有酶法合成的商品頭抱氨 芐、阿莫西林等產(chǎn)品面世。由于酶法應(yīng)

2、用于B-內(nèi)酰胺抗生素合成，不僅可減少反應(yīng)步驟，而且還可減少?gòu)U棄物的產(chǎn)生，有利于保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品 質(zhì)量?jī)?yōu)異,所含雜質(zhì)極少。因此，21世紀(jì)B-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成將是發(fā)展 的必然趨勢(shì)。我國(guó)酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，與國(guó)外先進(jìn)廠家差距較大。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們對(duì)自身居住環(huán)境的 要求，政府對(duì)環(huán)保的重視，政府和越來(lái)越多的企業(yè)加大“綠色化學(xué)制藥”的研究開(kāi) 發(fā)，特別是加快工業(yè)化生產(chǎn)的推進(jìn)進(jìn)程。酶法產(chǎn)品主要有三大特點(diǎn)：一是產(chǎn)品含量穩(wěn)定、變化小，可降低制劑在有效期內(nèi)的檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)，并且雜質(zhì)低，降解速度慢，對(duì)制劑的安全性，尤其是特殊制劑的穩(wěn)定性尤為重要。二是酶法產(chǎn)品生

3、產(chǎn)批量能夠達(dá)到化學(xué)法產(chǎn)品的23倍，這既能夠大幅度節(jié)省制劑生產(chǎn)商的檢驗(yàn)成本，粗略估算原料檢測(cè)成本能夠節(jié)約人民幣 9元/kg;同時(shí)， 也便于物流、倉(cāng)儲(chǔ)和生產(chǎn)管理。？三是酶法產(chǎn)品是通過(guò)生物酶一步到位生產(chǎn)而 得,以純凈水為介質(zhì)，不使用傳統(tǒng)化學(xué)工藝中的特殊 化工原料，有機(jī)溶劑的使用 量大幅度減少90%,廢水排放減少8 0%,品質(zhì)更純凈。1 青霉素酰化酶的發(fā)展青霉素?；甘菑奈⑸锘蚱浯x產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白 質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素酰化酶的微生物廣泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中，如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽抱 桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌（Kluyvera

4、）等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿 菌、巨大芽抱桿菌、柑橘黃單胞菌和大腸桿菌 ，尤以大腸桿菌最為常用。為了獲得廉價(jià)高效的青霉素?；?，人們對(duì)大腸桿菌等進(jìn)行了選育和基因改造，用獲得的大腸桿菌天然或工程菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)而得到所需要的酶。從大腸桿菌或其他微生物獲得的酶可以以游離的形式使用，也可以被固定在載體上制成固定化酶（Immobil i zed Enzyme）使用。與液體酶（酶溶液）相比, 固定化酶的主要優(yōu)點(diǎn)是：酶和反應(yīng)液易于分離，酶可重復(fù)使用。穩(wěn)定性高于 天然酶。有利于反應(yīng)過(guò)程的連續(xù)化和自動(dòng)化控制。反應(yīng)液中殘留雜質(zhì)少，有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制。產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低廉。從微生物發(fā)酵提純的酶溶液制備固

5、 定化酶的方法大致可分為吸附法、包埋法和共價(jià)結(jié)合法三大類。共價(jià)結(jié)合法具有 酶與載體結(jié)合牢固、不易脫離等優(yōu)點(diǎn)，因此應(yīng)用較多。其工藝過(guò)程為：濃縮酶溶液在緩沖溶液中與交聯(lián)劑（如戊二醛）和高分子載體進(jìn)行振蕩偶合，然后過(guò)濾洗滌 得到固定化酶，所得固定化酶因其載體形態(tài)不同大致分為纖維狀和顆粒狀2種。近年來(lái)使用顆粒狀固定化酶比較普遍。 用做固定化酶載體的高分子材料有：聚丙烯纖維、醋酸纖維、聚氨酯泡沫樹(shù)脂、環(huán)氧樹(shù)脂、丫內(nèi)酯樹(shù)脂等。2青霉素催化內(nèi)酰胺抗生素合成研究酶法合成一內(nèi)酰胺類抗生素可以通過(guò)動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)控制完成。動(dòng)力學(xué)控 制的合成反應(yīng)的產(chǎn)量取決于酶催化的 3種不同反應(yīng)的速率:（1） 一內(nèi)酰胺類化合 物的合

6、成反應(yīng)；（2）活化的?；w的水解反應(yīng)；（3 ）合成的抗生素的水解反應(yīng)。 反應(yīng)過(guò)程中青霉素?；竿瑯泳哂兴饣钚裕ㄟ^(guò)固定生物催化劑，選擇適宜的溶 劑,調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，提供高濃度的活化側(cè)鏈供體及一內(nèi)酰胺核等一系列條件可以 減少水解反應(yīng)。合成過(guò)程涉及適宜的親核試劑（如6 一氨基青霉烷酸、7 一氨基頭 抱霉烷酸、7氨基脫乙酰氧頭抱霉烯酸），在低pH值條件下的直接?；饔谩?低pH值條件下，大多數(shù)底物以非解離狀態(tài)存在，有利于合成，因此采用水/有機(jī) 溶劑混合溶劑減少了離子化形式的底物，從而有助于 一內(nèi)酰胺抗生素的合成。Fe rnandez等在含50% （體積分?jǐn)?shù)）的有機(jī)溶劑的非常規(guī)介質(zhì)中，利用來(lái)自于E

7、. co li及Kluyv e ra c it r op hila的固定化青霉素G酰化酶成功地合成了抗生 素。然而，有機(jī)溶劑對(duì)酶有一定的抑制作用，從而使酶的活性降低。目前的解決 方法主要是利用固定化技術(shù)增強(qiáng)酶在不利介質(zhì)中的穩(wěn)定性，如將酶共價(jià)結(jié)合到載體上，使其穩(wěn)定性大大提高。當(dāng)存在高濃度的有機(jī)助溶劑時(shí)，在固定化酶分子周圍人工建立一個(gè)微環(huán)境可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，并使酶活性損失最小。酶法縮合過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過(guò)程 ，它既可以發(fā)生底物間的縮合反應(yīng),同時(shí)又使產(chǎn)物發(fā)生酶解反應(yīng)，此種可逆反應(yīng)過(guò)程又由同一種酶來(lái)催化完成。 除了酶本身的因素外，反應(yīng)體系中的其他條件都會(huì)對(duì)反應(yīng)程度有不同的影響，如：反應(yīng)體系溫

8、度、pH值，反應(yīng)底物的純度及濃度，反應(yīng)原料帶入的雜質(zhì)和反應(yīng)過(guò)程 中產(chǎn)生的副產(chǎn)物及反應(yīng)體系電解質(zhì)濃度，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度等等。3阿莫西林研究現(xiàn)狀自20世紀(jì)90年代以來(lái)，阿莫西林己進(jìn)入快速發(fā)展的黃金時(shí)期，從原料到制劑， 該品種每年均以超過(guò)2 0 %的幅度增長(zhǎng),已成為抗生素品種中最引人注目、發(fā)展最 快的品種之一。工業(yè)上通常使用化學(xué)方法合成阿莫西林，這個(gè)過(guò)程步驟繁多，條件苛刻，而且需要大量有毒、難于降解的有機(jī)試劑，成本很高，污染嚴(yán)重。酶促合 成可以簡(jiǎn)化合成工藝，降低所需成本。而且目前的阿莫西林酶法合成工藝是一種懸濁液懸濁液體系(Su sp ension . S u s pensio n Sy stem),

9、這一體系指的是反應(yīng)前的混合物主要由懸浮在 過(guò)飽和液相中的固體反應(yīng)物所組成，反應(yīng)后的混合物則主要由固體產(chǎn)物所組成， 也稱為固固體系(S olid.So lid Syst em)。在這種體系中，底物和產(chǎn)物主要以 不溶的微粒存在，而酶促反應(yīng)則在液相中發(fā)生。與一般的酶促反應(yīng)相比，其單位 體積溶劑的產(chǎn)率獲得了很大提高。在熱力學(xué)控制合成的懸濁液懸濁液體系中，如果達(dá)到平衡時(shí)的理論產(chǎn)物濃度比溶解度高，產(chǎn)物會(huì)在平衡之前達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài) 并從反應(yīng)混合物中沉淀出來(lái)。這個(gè)過(guò)程一直持續(xù)到一種反應(yīng)物濃度降到溶解度以 下，新的平衡建立為止。這樣，起始混合物中的固體反應(yīng)物幾乎都轉(zhuǎn)化成了固體 產(chǎn)物，產(chǎn)率得到很大提高。由于反應(yīng)平衡

10、是由產(chǎn)物沉淀推動(dòng)的，這種懸濁液一懸濁 液體系又被稱為沉淀推動(dòng)法(Pre c i pitati o n Drive n Sy nth esi s)。動(dòng)力學(xué)控制合成的懸濁液懸濁液體系則要復(fù)雜的多，包括多個(gè)子過(guò)程，比 如底物和產(chǎn)物的溶解和結(jié)晶，產(chǎn)物的酶促合成，底物和產(chǎn)物的酶促水解等。而且，由 于反應(yīng)物和產(chǎn)物都是弱電解質(zhì)，動(dòng)力學(xué)懸濁液懸濁液體系的各個(gè)子過(guò)程受pH值的影響特別大，同時(shí)也反過(guò)來(lái)影響pH值。酶法阿莫西林國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)概況：阿莫西林自問(wèn)世以來(lái)，因療效確切、抗菌譜廣、治療方便的優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng) 用上迅速取代青霉素成為用量第一的B內(nèi)酰胺抗生素。從國(guó)際市場(chǎng)總需求量(可實(shí)現(xiàn)銷售產(chǎn)量)來(lái)看，阿莫西林近年來(lái)依然

11、平穩(wěn)增長(zhǎng),表明該品種仍處產(chǎn)品生命周期的穩(wěn)定期，全球市場(chǎng)年銷量超過(guò)3萬(wàn)噸。阿莫西林的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝為化學(xué)合成。在生產(chǎn)過(guò)程中，需要使用大量的有毒 有害有機(jī)溶劑，以及為實(shí)現(xiàn)反應(yīng)順利而必須加入的保護(hù)基團(tuán)。 反應(yīng)條件在低溫下 運(yùn)行,一方面增加了動(dòng)力消耗，另一方面需要使用鹵烴制冷劑。這些，均不符合 現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展、綠色工藝的理念。為此，自上世紀(jì)8 0年代起,業(yè)內(nèi)一直探求阿莫 西林綠色生產(chǎn)工藝。2 0 0 2年8月,DSM率先將酶法阿莫西林生產(chǎn)工業(yè)化。 Al mer ia工廠產(chǎn) 能估計(jì)為30 0 0噸/年；印度Toan sa工廠生產(chǎn)，產(chǎn)能估計(jì)為300 0噸/年。國(guó)內(nèi)酶法阿莫西林研究雖然起步較晚，但進(jìn)展較快。目前

12、，聯(lián)邦、石藥、華 藥、威奇達(dá)、魯抗企業(yè)都已建成不同規(guī)模的酶法阿莫西林西林生產(chǎn)線且完成注冊(cè) 工藝變更實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品上市銷售。隨著酶法阿莫西林的大規(guī)模上市，因其在產(chǎn)品質(zhì)量、生產(chǎn)成本、環(huán)保方面的 明顯優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)正在快速取代目前的化學(xué)阿莫西林市場(chǎng)。酶法阿莫西林反應(yīng)機(jī)理:1、反應(yīng)路線:阿莫西林動(dòng)力學(xué)控制的合成是同一酶催化下的三個(gè)反應(yīng)過(guò)程。即1 阿莫西林的合成,2.對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯水解，3阿莫西林水解，酶法合成阿莫西林的過(guò)程 中產(chǎn)物與底物均被水解形成副產(chǎn)物對(duì)羥基苯甘氨酸4，反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1. 16-Ami nope nicilla nic acid(6-APA)D-Hydroxyphe ny lglyc in

13、e methyl ester(HPGM)Metha nolHydroxyphe ny lglyc ine (HPG)6-Ami nope nicilla nic acid圖1.1酶法合成阿莫西林反應(yīng)路線圖2、反應(yīng)機(jī)理?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌青霉素G?；复呋铣砂⒛髁值臋C(jī)理如下，首先 具有活性的Ser B ：0丫羥基親核進(jìn)攻對(duì)羥基苯甲酸酯上的羰基碳原子， 形成一種 四面體結(jié)構(gòu)的反應(yīng)中間體，由于兩個(gè)氨基酸的氫鍵作用使得氧負(fù)離子空穴穩(wěn)定。 當(dāng)釋放甲醇，羰基復(fù)原后形成共價(jià)的?；?酶復(fù)合體中間體。在接下來(lái)的步驟中， ?；c6- A PA中的氨基結(jié)合生成酰胺鍵，合成阿莫西林，酶復(fù)原,當(dāng)然若酰基與 水中的羥

14、基結(jié)合，則生成羧基，即發(fā)生對(duì)羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)生成對(duì)羥苯 甘氨酸9。從反應(yīng)的歷程可以推測(cè)，在進(jìn)行阿莫西林的合成過(guò)程中，對(duì)羥苯甘氨 酸甲酯的水解反應(yīng)是不可避免的，只能是通過(guò)改變其它條件盡可能降低水解反應(yīng) 的速率，進(jìn)而降低側(cè)鏈酯的消耗，當(dāng)然最根本的還是通過(guò)酶特性的改進(jìn)，改善 S/H值。具體反應(yīng)歷程見(jiàn)圖1. 2_Asn 超41OAsn 超41hnHN .'I Ala 岡 |HOSer B1|HOOCH3HHvO _N N .： A0J69HHHOOCH3OH“0、H H NhAsn p241HHAsn 3241YOAsn 3241LI- NNd Ala 369 | Ala 339,_N

15、HNCl Ala 369H N1H NHHNHHOHO| Ser Bl|°rnC HO H OO <H H.NH2圖1 .2酶法合成阿莫西林反應(yīng)機(jī)理參考文獻(xiàn)1l n flue n c e of 6- am i n open icill a n ic acid o n amoxicilli n syn thesisa n d p hy d rox y phe nyl g I y cin e methyl e st e r hyd r oly s is Biocat a lysis a n d B io t ra n s fo rma ti o n 200 5 ,23 ( 2)2

16、A Ki n etic Stu d y of Synt hes is ofAm o xi c illin Us i n g Pen icilli n G A cylase Imm ob ili zedon A ga r ose3 Ma t h em a ti cal m ode ling of bat cha n d semi b atch r e acto rs for t he en zym i c sy nth esi sofamo xi ci 1 li n4 Use of n eura 1 netw or ks i n th e math emat ical m od el lin g

17、of the e nzy mic sy nt hesi sof amo xi ci 1 lincatal ysed by penic i 1 lin G acy las e i m mo b i li zedin ch itosa n ,Wor 1 d Jourr na 1 of Micro b iology & B io techno1 ogy,24(9) ,1761-1767;20085P r oce s s fo r prep a rati on of 3 -lact a ms a t con s tan tly high conce n trat i o n of re act

18、a nts US60487 0 86 :酶法阿莫西林質(zhì)量研究，河北化工，20 0 8,31 (4)水6-AP生物邛阿莫結(jié)d予阿莫 酶反西林晶離燥?工藝路線簡(jiǎn)述：將水、側(cè)鏈活性酯（或酯的鹽酸鹽）和6-APA加入反應(yīng)罐,在固定化酶的作用下，反應(yīng)生成阿莫西林。反應(yīng)過(guò)程中，以氨水/鹽酸控制pH。反應(yīng)完畢,將分離出的固體阿莫西林及反應(yīng)液混勻、加鹽酸溶解過(guò)濾，加氨水進(jìn)行等電點(diǎn)結(jié)晶。將濕晶進(jìn)行分離、洗滌、干燥、混粉、磨粉、檢驗(yàn)、包裝（出口產(chǎn)品可干壓加工成重粉）得成品。1. 3酶的實(shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展歷程青霉素?；甘菑奈⑸锘蚱浯x產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白 質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素酰化酶的微生物廣泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中,如：醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、 芽抱桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌（Kluyv e ra）