[精品]產(chǎn)纖維素酶低溫菌株的分離鑒定

1、產(chǎn)纖維素酶低溫菌株的分離鑒定產(chǎn)纖維素酶低溫菌株的分離鑒定摘耍：為促進秸稈還田，加快秸稈在北方設施土壤中的降解速 度，以腐爛秸稈為待篩菌株原料，以玉米秸稈粉為培養(yǎng)基，在15°c 低溫條件下，采用剛果紅平板法進行初篩，得到16株菌株，對16株 菌株進行酶活測定復篩，其中l(wèi)-13酶活最高，達1 679.61 u/mlo 對l-13菌株的菌體形態(tài)、菌落特征進行觀察，并進行了一系列生理 生化試驗和16s rdna序列分析，初步鑒定l-13為枯草芽抱桿菌 (bacillus subtilis)o此菌可以在15°c下快速生長繁殖并高產(chǎn)纖 維索酶，低溫條件下能快速降解秸稈。關鍵詞：玉米秸稈

2、；低溫；纖維素酶中圖分類號:q93-331文獻標識號:a文章編號：1001-4942(2014)03-0054-04abstractin order to promote straw returning and speed up its degradation in the north greenhouse soil, using rotten straw as raw materials and corn straw powder as medium, 16 strains were isolated with congo red plate method at 15°c then

3、 the enzyme activities of 16 strains were detected. l-13 had the highest enzyme activity of 1 679 61 u/m1. the mycelial morphology and colony characteristics of l13 were observed, and a series of physiological and biochemical tests and 16s rdna sequence analysis were conducted. the l13 strain was pr

4、eliminarily identified as bacillus subtilis owing to growing fastly and high yielding of cellulase at 15°c, it could degrade the straw tinder low temperature rapidly.key wordscorn straw； low temperature； cellulase我國的玉米秸稈資源分布較廣，是一種易得的可再生生物資源。 目前秸稈的主耍用途是秸稈還田和制備粗飼料，但用量總和不足秸稈 總量的40%,其余則被焚燒掉，造成了極大的資

5、源浪費和環(huán)境污染。 為了進一步提高秸稈的利用率，加快秸稈的降解速度，尤其是低溫條 件下的降解效率，以滿足北方冬季設施秸稈還田的需要，本試驗在低 溫（15°c）環(huán)境下，篩選出了玉米秸稈低溫快速腐熟菌，并進行了菌 株鑒定，以期為北方冬季設施秸稈還田提供科學依據(jù)。1材料與方法1. 1材料與試劑1.1.1材料玉米秸稈，采自朝陽市郊區(qū)，粉碎后用于腐熟菌的篩 選。1. 1.2試劑0.05 mol/l醋酸-醋酸鈉緩沖液;3, 5-二硝基水楊 酸顯色液（dns）； 0.5%竣甲基纖維素鈉溶液；0.2 mg/ml纖維素酶; 2 mol/l鹽酸溶液。1. 1. 3培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基：玉米秸稈粉20 g,瓊

6、脂20 g,水1 000 ml, 121°c滅菌30 min,備用。篩選培養(yǎng)基：剛果紅纖維素鈉培養(yǎng)基， 見微生物學實驗。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g,蛋白腺10 g, nacl 5 g,水 1 000 ml, ph 7.07. 2, 121°c滅菌 30 min,備用。 生理生化鑒定培養(yǎng)基及試劑見常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊。114儀器設備高速冷凍離心機、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、 pcr儀、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、731型分光光度計等。1. 2試驗方法1. 2. 1低溫降解纖維素菌株的分離將腐爛的玉米秸稈（含待篩菌 株）粉碎，取0.5g加入49. 5 ml無菌水，置于振蕩器上振蕩30

7、 min, 后吸取1 ml加入9 ml無菌水，以此類推，共稀釋到109o吸取0.1 ml不同倍數(shù)稀釋液于篩選培養(yǎng)基上，涂平板，15°c低 溫條件下培養(yǎng)，直到形成單菌落。1. 2. 2低溫降解纖維素菌株初篩將所得單菌落分別挑到剛果紅纖 維素鈉平板屮，每個平iil一種菌株，重復3次，15°c恒溫箱屮倒置培 養(yǎng)48 ho觀察平板，標記有水解圈的菌株、測量水解圈直徑并記錄 試驗結(jié)果。1. 2. 3低溫降解纖維素菌株復篩原樣酶液制備：將初篩所得菌株 分別轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，15°c培養(yǎng)48 h,取發(fā)酵液1 ml于ep管中，10 000 r/min離心10 min,上清液

8、即為原樣酶液。dns法測酶活力：取3支容量為20. 0 ml的試管，一支做空白對 照，其余2支做平行樣晶管。取1.0 ml原樣酶液加入樣品管屮，后 向3支試管中分別加入4.0 ml預熱至60°c的底物溶液，60°c水浴準 確計時20 min取出,立即加入1.0 ml 2.0 mol/l的氫氧化鈉溶液和 2.0 ml dns顯色液，搖勻，在對照管中再加入1.0 ml原樣酶液，后 將3支試管置于沸水浴準確計吋顯色5 min取出，流水迅速冷卻，并 用蒸憾水定容至20.0 ml,搖勻后用分光光度計測定490 nm處吸光 度值。定義每分鐘產(chǎn)生1 pg葡萄糖為一個酶活單位。纖維素酶活計

9、算：u二ml-m0/20式中，u為樣品的酶活力，單位為微克每分鐘（ug/inin）； m0為 對照葡萄糖量，單位為微克（pg）; ml為分解后樣品質(zhì)量，單位為 微克（ug）; 20為酶與底物反應吋間，單位為分鐘（min）。<!-endprint-> <!-startprint->1 3 菌種鑒定1. 3. 1菌株形態(tài)和生理生化鑒定根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體 形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽抱染色性狀及有關生理生化鑒別試驗, 參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊、伯杰細菌鑒定手冊進行屬和種的 鑒定。菌株形態(tài)鑒定：將復篩得到l-13菌株進行10倍梯度稀釋，取 10-4、10-5稀釋液于分

10、離培養(yǎng)基上涂平板，15°c培養(yǎng)48 h得單菌落， 觀察記錄菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及 培養(yǎng)基的顏色等。另挑取15°c培養(yǎng)24 h的菌株，參照常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并進行芽 抱、鞭毛染色。生理生化鑒定：參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊對菌株進行生理 生化試驗。主要進行h2s產(chǎn)生試驗、卩引味試驗、明膠液化試驗、過 氧化氫酶（接觸酶）試驗、精氨基脫竣酶試驗、淀粉水解、v.p （乙 酰甲基甲醇）試驗、m.r （甲基紅）試驗、檸檬酸鹽試驗、酪素水解、 糖、醇發(fā)酵試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、纖維素水解試驗、豚酶（尿 素水解）試驗、

11、丙二酸鹽試驗、硝酸鹽還原試驗和3-酮基乳糖試驗。1. 3. 216s rdna鑒定dna提取和16s rdna擴增:參考kim等和rainey等方法提取細菌總dna。1%瓊脂糖電泳檢測。引物為通用引物:27f (5z -agagtttgatcctggctcag-3')和 1495r(5 -ctacggctaccttgttacga-3z )。pcr 反應體系：dna 模板(70 ng/u 1) 2 n 1； dntpmix (2. 5mmol/l) 2. 5 u 1； 27f (20 umol/l) 1.5 u 1； 1495 r (20 umol/l) 1. 5 u 1； loxex

12、taq buffer (mg2+ pluse) 5 ul； ex taq dna 聚合酶 0. 2 n 1；補足 ddii20 到 50 卩 1。 pcr 條件：94°c預變性 3 min； 94°c變性 1 min, 55°c退火 1 min, 72°c延伸3 min, 30個循環(huán)；最后72°c延伸5 mino pcr產(chǎn)物經(jīng)試劑 盒純化后，送大連寶生物工程技術服務有限公司測序。16s rdna序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得的16s rdna序列 用blast軟件與genbank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，將所得相近序列利 用 clustal x

13、(1.8)進行多重序列比對(multiple alignments), 并用neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。2結(jié)果與分析2. 1低溫降解纖維素菌株的篩選2. 11低溫降解纖維素菌株的初篩經(jīng)初篩得到產(chǎn)纖維素酶的菌株 16株，分別命名為l-1l-16(表1),水解圈直徑為15.235.3 mm, 其中l(wèi)-13水解圈直徑最大，為35. 3 mmo3結(jié)論利用剛果紅纖維素鈉初篩、纖維素酶活復篩,從腐熟秸稈粉中篩選出一株低溫條件下能夠快速降解玉米秸稈的菌株l-13,根據(jù)其形 態(tài)、生理生化特性及16s rdna序列分析結(jié)果，初步鑒定為枯草芽鞄 桿菌。北方冬季(122月)設施地溫低，多在12

14、20°c之間，低溫 條件下能夠快速生長并高產(chǎn)纖維素酶的l-13菌種有一定的應用前景。參考文獻: 1頓寶慶，吳薇，王旭靜，等一株高纖維素酶活力纖維素分解菌 的分離與鑒定j中國農(nóng)業(yè)科技導報，2008, 10 (1)： 113-1172 陳合，張強菌酶共降解玉米秸稈的t藝研究j農(nóng)業(yè)工程學 報，2008, 24 (3)： 270-273.3 韓學易，陳惠，吳琦，等產(chǎn)纖維素酶枯草芽抱桿菌c-36的 產(chǎn)酶條件研究j四川農(nóng)業(yè)大學學報，2006, 24 (2)： 179-181.4 燕紅，楊謙，潘忠誠一株地衣芽鞄桿菌對稻草降解作用的研 究j浙江大學學報，2007, 33 (4)： 360-366.5

15、 祝小，耿秀蓉，潘康成，等枯草芽抱桿菌pab02產(chǎn)纖維素 酶活性的研究j飼料研究,2007 (1)： 61-636 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊m.北京：科學出 版社，2001.7 霍爾特jg伯杰細菌鑒定手冊m.劉復今，編譯簡明第8 版濟南：山東大學出版社，1988.8 kim s b, yoon j h, kim h, et al a phylogenetic analysisof the genus saccharomonospora conducted with 16s rrna gene sequences j international journal of systematic bacteriology, 1995,45 (2)：351-356.9 rainey f a, rainey n w,