奶和奶粉中頭孢類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見稿）

1、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB×××××-×××× 代替GB/T 22989-2008 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)奶和奶粉中頭孢類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法National food safety standards-Determination of cephalosporins residues in milk and milk powder by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method（征求意見稿）×××

2、×-××-發(fā)布 ××××-××-××實(shí)施發(fā)布中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會國家市場監(jiān)督管理總局 GB ×××××××××前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 22989-2008牛奶和奶粉中頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 22

3、989-2008相比, 除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：增加了適用范圍，由原標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶和奶粉調(diào)整為適用于牛奶、羊奶和奶粉。增加了藥物種類，由原標(biāo)準(zhǔn)4種藥物增加到9種藥物，增加了頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢噻肟。修改了前處理步驟。調(diào)整了方法檢出限，由原標(biāo)準(zhǔn)4種藥物在牛奶和奶粉中分別為4.0 µg/kg和32 µg/kg調(diào)整為0.5µg/kg和4.0 µg/kg。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：GB/T 22989-2008。I食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)奶和奶粉中頭孢類藥物殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛奶、羊奶和奶粉中

4、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈、頭孢匹林、頭孢洛寧、頭孢喹肟、頭孢噻肟殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶、羊奶和奶粉中頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈、頭孢匹林、頭孢洛寧、頭孢喹肟、頭孢噻肟殘留量的檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理試樣中的藥物殘留用磷酸鹽緩沖溶液提取，親水親脂平衡固相萃取柱凈化，液相色譜-

5、串聯(lián)質(zhì)譜法測定，基質(zhì)校準(zhǔn)外標(biāo)法定量。4 試劑與材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。4.1 試劑4.1.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。4.1.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。4.1.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。4.1.4 正己烷（C6H14）。4.1.5 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。4.1.6 氫氧化鈉（NaOH）。4.2 溶液配制4.2.1 2.5mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉50 g，加水溶解并稀釋至500 mL。4.2.2 30%乙腈溶液：取乙腈30 mL，用水稀釋至100 mL。4.2.3 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=8

6、.5）：取磷酸二氫鉀6.8 g，用水溶解并稀釋至1000 mL，用2.5 moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。4.2.4 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀釋至1000 mL。4.2.5 0.1%甲酸溶液-甲醇（95:5）：取0.1%甲酸溶液95 mL，甲醇5 mL，混勻。4.3 標(biāo)準(zhǔn)品 頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈、頭孢匹林、去乙?；^孢匹林，頭孢洛寧、頭孢喹肟、頭孢噻肟標(biāo)準(zhǔn)品，含量均95%，具體見附錄A。4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，精密稱量，分別用30%乙腈溶液適量使溶解并稀釋定容至25 mL容量瓶，配制成濃度為400

7、g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于-18避光保存，有效期1個(gè)月。4.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙腈溶液稀釋至刻度，配制成濃度為10 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于-18避光保存，有效期7天。4.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用0.1%甲酸溶液-甲醇（95:5）稀釋成濃度為2.5 g/L、5.0 g/L、20 g/L、100 g/L、200 g/L和500 g/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。4.5 材料4.5.1 固相萃取柱：HLB，500mg/6mL，或相當(dāng)者。4.5.2 針頭式過濾器：尼龍材質(zhì)，孔徑0.22 m

8、或性能相當(dāng)者。5 儀器和設(shè)備5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。5.2 分析天平：感量0.01 g和 0.000 01 g。5.3氮吹儀。5.4固相萃取裝置。5.5渦旋混合器。5.6離心管：聚丙烯塑料離心管，10 mL、50 mL。5.7 pH計(jì)。6 試料的制備與保存6.1 試料的制備取適量新鮮或解凍的空白或供試樣品，并使均質(zhì)。取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。6.2 試料的保存-18以下保存。7 測定步驟7.1 提取取牛奶、羊奶試料5 g（準(zhǔn)確至±0.05 g）或奶粉試料0.

9、5 g（準(zhǔn)確至±0.01 g），于50 mL離心管，加磷酸鹽緩沖溶液20 mL，混勻，用2.5mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，備用。7.2 凈化取固相萃取柱，依次用甲醇5 mL、磷酸鹽緩沖溶液10 mL活化。取備用液，過柱，待液面到達(dá)柱床表面時(shí)再依次用磷酸鹽緩沖溶液3 mL和水2 mL淋洗，棄去全部流出液。用乙腈3 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中，加正己烷3 mL，渦旋混合1 min，靜置5 min，棄去上層正己烷層，取乙腈層在40水浴氮?dú)獯蹈?，?.1%甲酸溶液-甲醇（95:5）1.0 mL溶解，過0.22 m濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。7.3 基質(zhì)匹配標(biāo)

10、準(zhǔn)曲線的制備取空白試料依次按7.1和7.2處理，40水浴氮?dú)獯蹈珊蠓謩e加入1.0 mL4.4.3中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 m濾膜，得2.5 g/L、5.0 g/L、20 g/L、100 g/L、200 g/L和500 g/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。7.4 測定7.4.1 液相色譜參考條件a）色譜柱： C18色譜柱 （100 mm×2.0 mm，1.7 µm）或相當(dāng)者； b）流動(dòng)相：A：0.1%甲酸溶液，B：甲醇，梯度洗脫程序見表1；c）流速：0.3

11、 mL/min；d）柱溫：35 ；e）進(jìn)樣量：10 µL。表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí)間 （min）0.1% 甲酸溶液（%）甲醇（%）09551.09554.550506.050506.19557.59557.4.2 質(zhì)譜參考條件a）離子源：電噴霧（ESI）離子源；b）掃描方式：正離子掃描；c）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；d）毛細(xì)管電壓：2 000 V；e）RF透鏡電壓：0.5 V；f）離子源溫度：150 ；g）脫溶劑氣溫度：500 ；h）錐孔氣流速：50 L/h；i）脫溶劑氣流速：1000 L/h；j）二級碰撞氣：氬氣；k）定性離子對、定量離子對、碰撞能量和錐孔電壓見表2。表2

12、定性離子對、定量子離子對、碰撞能量和錐孔電壓化合物名稱定性離子對和碰撞能量（eV）定量離子對和碰撞能量（eV）錐孔電壓（V）頭孢氨芐348.1/106.0（32）348.1/158.0（10）348.1/158.0（10）26頭孢拉定350.2/157.9（12）350.2/176.0（12）350.2/176.0（12）24頭孢乙腈362.0/178.0（14）362.0/258.0（10）362.0/258.0（10）24頭孢唑林455.0/156.0（16）455.0/323.0（10）455.0/323.0（10）4頭孢哌酮646.2/143.0（38）646.2/530.1（10）6

13、46.2/143.0（38）28頭孢匹林424.1/151.9（22）424.1/292.0（12）424.1/151.9（22）28頭孢洛寧459.1/151.9（18）459.1/337.0（8）459.1/151.9（18）12頭孢喹肟529.2/134.0（14）529.2/396.0（12）529.2/134.0（14）34去乙?；^孢匹林382.1/111.8（20）382.1/151.9（26）382.1/151.9（26）32頭孢噻肟456.0/167.0（18）456.0/396.0（8）456.0/167.0（18）227.4.3 測定法取試料溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按7.

14、4.1和7.4.2設(shè)定儀器條件操作，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法計(jì)算?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及試料溶液中目標(biāo)藥物的特征離子質(zhì)量色譜峰峰面積均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。試料溶液中待測物質(zhì)的保留時(shí)間與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測物質(zhì)的保留時(shí)間之比，偏差在±2.5%以內(nèi)，且試料溶液中的離子相對豐度與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子相對豐度相比，符合表3的要求，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見附錄B。表3 定性確證時(shí)相對離子豐度的允許偏差相對離子豐度/（%）允許偏差/（%）50±202050±251020±3010±507.5 空白試驗(yàn)取空白

15、試料，除不加藥物外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。8 結(jié)果計(jì)算和表述試料中頭孢類藥物的殘留量按標(biāo)準(zhǔn)曲線或式（1）計(jì)算：X=.（1）式中：X 試料中被測組分的殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；Cs標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測給分的濃度，單位為微克每升（mg/L）；A 試料溶液中被測組分的色譜峰面積； As 標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分的色譜峰面積；V試料定容體積，單位為毫升（mL）；m供試試料質(zhì)量，單位為克（g）；注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。頭孢匹林殘留量以頭孢匹林和去乙酰基頭孢匹林之和計(jì)。9 檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度9.1 靈敏度本方法中頭孢哌

16、酮、頭孢乙腈和頭孢唑林在奶和奶粉中的檢測限分別為2.0µg/kg和20 µg/kg，定量限分別為4.0 µg/kg和40 µg/kg；其余頭孢類藥物和去乙?；^孢匹林在奶和奶粉中的檢測限分別為0.5 µg/kg和5 µg/kg，定量限分別為1.0 µg/kg和10 µg/kg。9.2 準(zhǔn)確度本方法在1.0200 µg/kg添加濃度水平上的回收率為60%120%。9.3 精密度本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差15 %，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差20 %。附 錄 A（資料性附錄）9種頭孢類藥物和去乙?；^孢匹林的英文名稱、CA

17、S號、分子式表A.1 9種頭孢類藥物和去乙?；^孢匹林的英文名稱、CAS號、分子式化合物英文名稱CAS號分子式頭孢氨芐cefalexin15686-71-2C16H17N3O4S頭孢拉定cefradine38821-53-3C16H19N3O4S頭孢乙腈cefacetrile10206-21-0C13H13N3O6S 頭孢唑林cefazolin25953-19-9C14H14N8O4S3頭孢哌酮cefoperazone62893-19-0C25H27N9O8S2頭孢匹林cefapirin21593-23-7C24H24N4O2頭孢洛寧cefalonium5575-21-3C20H18N