昆蟲分子生態(tài)學

1、昆蟲分子生態(tài)學的昆蟲分子生態(tài)學的主要原理與研究方法主要原理與研究方法陳陳 川川 以昆蟲為研究對象，研究昆蟲及其周圍環(huán)境相互關(guān)系的科學。它是昆蟲學和生態(tài)學的分支學科。昆蟲生態(tài)學（昆蟲生態(tài)學（Insect ecology）昆蟲分子生態(tài)學昆蟲生理生態(tài)學昆蟲種群生態(tài)學昆蟲群落生態(tài)學生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學按研究對象的層次分類：按研究對象的層次分類：昆蟲生態(tài)學一主要原理一主要原理 分子生態(tài)學是應(yīng)用分子進化和群體遺傳學的理論、分子生物學的技術(shù)手段、系統(tǒng)發(fā)生學和數(shù)學的分析方法以及其他學科的知識（如地學、古氣候?qū)W等）去研究種群、進化、生態(tài)、行為、分類、生物地理演化、生物保護等學科領(lǐng)域的各種問題。它主要通過大量使用分子生

2、物學先進的技術(shù)和方法，在分子水平上研究生態(tài)現(xiàn)象，闡明生態(tài)現(xiàn)象的分子機制。昆蟲分子生態(tài)學就是以昆蟲為研究對象，應(yīng)用分子生態(tài)學的原理與方法研究昆蟲進化與適應(yīng)機制的一門學科。 1.基本原理基本原理 通過分子生物學的方法檢測昆蟲種群或個體的遺傳變異，分析和解釋遺傳變異的特點與規(guī)律，揭示遺傳變異所反映的規(guī)律性的東西，從而進一步闡明昆蟲之間以及昆蟲與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。 其研究的最典型特色是運用分子遺傳標記來檢測研究對象的遺傳變異特征，以揭示事物所隱含的演化規(guī)律。2.主要理論主要理論 分子生態(tài)學是建立于群體遺傳學理論、分子進化理論和系統(tǒng)發(fā)生學理論等理論支柱之上的實驗性和理論性都很強的科學。與之相關(guān)的一

3、些主要理論有：（1）種群分化（2）隨機遺傳漂變（3）歸祖理論（4）中性理論（5）哈德-溫伯格理論 二昆蟲分子生態(tài)學的研究方法二昆蟲分子生態(tài)學的研究方法 昆蟲分子生態(tài)學研究包括2個核心部分，即分子標記的建立和分子數(shù)據(jù)的獲取。其中，分子標記的建立是關(guān)鍵。1.分子標記的方法分子標記的方法 同工酶（蛋白質(zhì)電泳技術(shù)）方法；限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）方法；隨機擴增DNA多態(tài)性（RAPD）方法；微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA標記方法；擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記。表表1 昆蟲分子生態(tài)學常用技術(shù)比較昆蟲分子生態(tài)學常用技術(shù)比較技術(shù)名稱技術(shù)名稱區(qū)別水平及區(qū)別水平及所獲得資料類型所獲得資料類型優(yōu)點優(yōu)點缺點缺

4、點同工酶同工酶（蛋白質(zhì)電泳技（蛋白質(zhì)電泳技術(shù)）術(shù)）氨基酸所帶電荷氨基酸所帶電荷及電性，基因頻及電性，基因頻率資料。率資料。相對便宜，已有的方相對便宜，已有的方法較多，產(chǎn)生在生理法較多，產(chǎn)生在生理上重要的共顯性孟德上重要的共顯性孟德爾遺傳。爾遺傳。與與DNA系列方法相比系列方法相比靈敏度較差，較多的試靈敏度較差，較多的試驗數(shù)量局限于小型昆蟲，驗數(shù)量局限于小型昆蟲，酶易受環(huán)境條件影響。酶易受環(huán)境條件影響。RFLP通過限制性內(nèi)切通過限制性內(nèi)切酶能識別單個位酶能識別單個位點的核苷酸差異、點的核苷酸差異、基因頻率和堿基基因頻率和堿基對差異。對差異。常用于常用于mtDNA，效，效果較好，也較為方便，果較好

5、，也較為方便，有標準的探針以供比有標準的探針以供比較之用。較之用。要求大量的要求大量的DNA，通，通常要求放射性標記探針，常要求放射性標記探針，只能分析單個或幾個座只能分析單個或幾個座位，相對較貴，對技術(shù)位，相對較貴，對技術(shù)與操作要求較高。與操作要求較高。PCR-RFLP基因頻率資料基因頻率資料只需要少量的只需要少量的DNA，可以通過可以通過EB顯色而顯色而不用放射性探針標記，不用放射性探針標記，相對便宜且比標準的相對便宜且比標準的RFLP靈敏。靈敏。需要專一性引物。需要專一性引物。RAPD核核DNA中單核苷酸中單核苷酸的變化，基因頻率的變化，基因頻率資料。資料。對已知的遺傳信息較對已知的遺傳

6、信息較少的種較為適用，頻少的種較為適用，頻率高，相對便宜，只率高，相對便宜，只要求少量的要求少量的DNA.對對DNA濃度十分敏感，濃度十分敏感，在在PCR產(chǎn)物中不能提產(chǎn)物中不能提供任何遺傳信息，重供任何遺傳信息，重復(fù)性較差，所做的標復(fù)性較差，所做的標記難以鑒定。記難以鑒定。小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA同同RFLP微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA個體和群體間核個體和群體間核DNA串聯(lián)序列的差串聯(lián)序列的差異。異。鑒別力高、較快且較鑒別力高、較快且較為便宜，能鑒定專一為便宜，能鑒定專一性定位點，專一性高，性定位點，專一性高，對復(fù)雜的交配系統(tǒng)尤對復(fù)雜的交配系統(tǒng)尤其適用。其適用。相對較多的高純分子相對較多的高純分子質(zhì)量質(zhì)量DN

7、A，要求有標，要求有標記探針，相對較貴且記探針，相對較貴且費時，難以獲得可靠費時，難以獲得可靠的的PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。DNA序列序列核核DNA和和mtRNA單單一核苷酸的差異；一核苷酸的差異；基因頻率和堿基對基因頻率和堿基對變化。變化。只需相對少量的只需相對少量的DNA，分辨率高，一些通用分辨率高，一些通用的的PCR引物。引物。費時費錢，在技術(shù)費時費錢，在技術(shù)上比上比PCR-RFLP和和RAPD要求更高。要求更高。AFLP同同RFLP兼有兼有RFLP的可靠性的可靠性與與PCR的高效性，只的高效性，只需少量的需少量的DNA且相對且相對純度要求不高，重復(fù)純度要求不高，重復(fù)性比性比RAPD好，預(yù)先好，

8、預(yù)先不必知道引物序列。不必知道引物序列。相對較貴且費時，步相對較貴且費時，步驟較繁。驟較繁。2.遺傳變異的檢測方法遺傳變異的檢測方法 從所揭示的遺傳變異信息的類型和層次上看，遺傳變異的檢測方法包括兩大類：（1）序列分析序列分析（sequence analysis） 直接對DNA標記的核苷酸組成進行分析；（2）片段分析片段分析（fragment analysis） 通過檢測多肽片段的長度或構(gòu)象來區(qū)分不同的基因型。 進行遺傳變異的最基本的檢測方法是電泳技術(shù)。三昆蟲分子生態(tài)學研究內(nèi)容三昆蟲分子生態(tài)學研究內(nèi)容（1）由于昆蟲遷飛、擴散或外來種、地理隔離的 昆蟲種群在分子水平上的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)；（2

9、）昆蟲種群的生物型；（3）昆蟲植物相互作用的分子機理；（4）昆蟲抗藥性分子機理；（5）昆蟲對環(huán)境適應(yīng)（如耐寒性）的分子機理。 四昆蟲分子生態(tài)學的應(yīng)用四昆蟲分子生態(tài)學的應(yīng)用1.昆蟲地理種群的遺傳變異分析2.昆蟲生物型差異的分子特征3.昆蟲嗅覺的分子識別4.昆蟲與共生菌互作的分子機制 以利用ITS2序列分析赤眼蜂不同地理種群的遺傳變異為例。（1）樣品采集）樣品采集 將不同地方采集的赤眼蜂分裝于1.5mL消毒微量離心管中，置于-80保存待用。（2）DNA提取提取 將單頭預(yù)凍赤眼蜂置于預(yù)冷的1.5mL離心管，加入20L抽提緩沖液（200mmol/L Tris-HCl，pH8.0，70mmol/L Na

10、2EDTA，2 mol/L NaCl，20 mmol/L 偏重亞硫酸鈉），用微型研杵在冰浴中將昆蟲研碎。再加5 L 3% 十二烷基肌氨酰鈉溶液和5 L 蛋白酶K，并混勻，置于56 水浴2 h，接著用95-99加熱10 min。所抽提的DNA置于-20保存待PCR、克隆和測序。（3）PCR擴增及電泳擴增及電泳 PCR反應(yīng)在Hybaid熱循環(huán)儀中進行，總反應(yīng)體積50L：40.2L超純水、5L 10反應(yīng)緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl,pH8.3,500mmol/LKCl,15mmol/L MgCl2），0.8L 10mmol/L dNTP混合液，25mol/L正反引物各1.2L，1L

11、模板DNA，0.6L GIBCOBRL Taq酶（5U/L）。擴增ITS2區(qū)段（兩端含部分5S和28S序列）的引物為：TrichLSf-5-TTC TCG CAT CGA TGA AGA ACG-3(forward)和TrichLSr-5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3(reverse)。PCR循環(huán)程序為：97變性1min，接著進行35個循環(huán)：95變性1min、50退火1min、72延伸2min，最后72延伸7min，置于4保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，1TAE緩沖液（0.04mol/L Tris-acetate pH8.0,0.002mol/L Na2E

12、DTA）100bpDNA Ladder 相對分子質(zhì)量標準參照物，電泳膠用溴化乙啶（EB）染色。（4）克隆及測序）克隆及測序 電泳后，將約564 bp 的PCR產(chǎn)物割下，分別置于1.5L 離心管，采用DNA快速純化試劑盒（Promega）回收PCR產(chǎn)物，每樣用25L TEbuffer(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1 mmol/L Na2EDTA)收集。連接反應(yīng)使用5L 回收DNA，載體為Pgem-T Vector System ，操作按用戶指南。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞。陽性克隆鑒定時，先純化質(zhì)粒，再用內(nèi)切酶BstZ(Eco521)(Promega)進行酶切鑒定。酶切反應(yīng)體積20L ，包括0.2-1.5g DNA底物和內(nèi)切酶，混合液37水浴3 h，用1 % 瓊脂糖膠檢測消化反應(yīng)。最后將每板1-3個陽性克隆測序（ABI PRISM,Model 377），采用Pharmacia DNA測序試劑盒雙脫氧鏈終止法。（5）地理種群序列