第三節(jié)DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義

1、logo第三節(jié)第三節(jié) dna多態(tài)性分型技術(shù)多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 張薇薇張薇薇email: . q q: 363002530 分型技術(shù)有那些分型技術(shù)有那些?- 血清學(xué)分型血清學(xué)分型 - 生物化學(xué)分型生物化學(xué)分型 - 噬菌體分型噬菌體分型. 傳統(tǒng)的分型技術(shù)傳統(tǒng)的分型技術(shù)分子生物學(xué)分型技術(shù)分子生物學(xué)分型技術(shù)- pfge- 限制性酶切圖譜分析限制性酶切圖譜分析- pcr技術(shù)技術(shù)- 質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒圖譜脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳pulsed-field gel electrophoresis pfge原原 理理 瓊脂糖凝膠依靠不同的瓊脂糖凝膠依靠不同的分子篩效應(yīng)分

2、子篩效應(yīng)對(duì)大小不同的對(duì)大小不同的dna分子分子進(jìn)行分離。超過一定大小的線狀雙鏈進(jìn)行分離。超過一定大小的線狀雙鏈dna分子在瓊脂糖凝膠中分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。以相同速率遷移。 大于該極限長(zhǎng)度（大于該極限長(zhǎng)度（40kb）后）后dna的遷移速率幾乎與分子大的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場(chǎng)強(qiáng)度。但小無關(guān)，而主要決定于電場(chǎng)強(qiáng)度。但 pege 解決了這一問題解決了這一問題原原 理理pfge利用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交流電源，每次電利用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交流電源，每次電流方向改變持續(xù)流方向改變持續(xù)l s到到5min左右，然后改變電流方向左右，然后改變電流方向反復(fù)循環(huán)，故稱為反復(fù)循環(huán)，故

3、稱為脈沖式交變電場(chǎng)脈沖式交變電場(chǎng)。隨著電場(chǎng)方向。隨著電場(chǎng)方向的交替變化，的交替變化，dna分子分子呈呈“z”形向前運(yùn)動(dòng)形向前運(yùn)動(dòng)。每改變。每改變一次電場(chǎng)方向，大的伸展的一次電場(chǎng)方向，大的伸展的dna分子就必須重新定分子就必須重新定向，在新的方向上通過凝膠。向，在新的方向上通過凝膠。重新定向所需的時(shí)間重新定向所需的時(shí)間與與dna分子的長(zhǎng)度成正比。分子的長(zhǎng)度成正比。b+a-+a-b脈沖電場(chǎng)電泳示意圖脈沖電場(chǎng)電泳示意圖（1）細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng) （2）制備膠塊制備膠塊 （3）菌體裂解菌體裂解 （4）膠塊洗滌膠塊洗滌 （5）酶切酶切 （6）電泳）電泳 （7）結(jié)果處理結(jié)果處理 pfge圖譜獲得過程圖譜獲得過

4、程最大限度的最大限度的保證全基因保證全基因組的完整性組的完整性脈沖式交變脈沖式交變電場(chǎng)電場(chǎng) pfge 優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì)重復(fù)性好重復(fù)性好,分辨力強(qiáng)分辨力強(qiáng),被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)” pfge 的局限性的局限性 無法分辨點(diǎn)突變、微小突變無法分辨點(diǎn)突變、微小突變 內(nèi)切酶選擇很關(guān)鍵，否則無法找到圖譜內(nèi)切酶選擇很關(guān)鍵，否則無法找到圖譜 費(fèi)時(shí)，儀器要求高，技術(shù)要求高，成本較高費(fèi)時(shí)，儀器要求高，技術(shù)要求高，成本較高pfge的優(yōu)勢(shì)和局限性的優(yōu)勢(shì)和局限性任何一種技術(shù)都不是完美的！任何一種技術(shù)都不是完美的！ 還有沒有其他技術(shù)作為補(bǔ)充？還有沒有其他技術(shù)作為補(bǔ)充？dna多態(tài)

5、性多態(tài)性 ?分型技術(shù)分型技術(shù)?yes!自然界的生物的個(gè)體差異自然界的生物的個(gè)體差異我是獨(dú)一我是獨(dú)一無二滴無二滴!不同不同or 差異差異? 多態(tài)性（多態(tài)性（polymorphism）定義定義: 是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺，亦稱遺傳多態(tài)性或基因多態(tài)性傳多態(tài)性或基因多態(tài)性 (genetic polymorphism). 從本質(zhì)上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于從本質(zhì)上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平基因水平上的變上的變異，一般發(fā)生在基因序列中異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白

6、的區(qū)域不編碼蛋白的區(qū)域和和沒有沒有重要調(diào)節(jié)功能重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。的區(qū)域。 dna多態(tài)性在微生物中的實(shí)際意義？多態(tài)性在微生物中的實(shí)際意義？將導(dǎo)致將導(dǎo)致 不同的細(xì)菌亞型不同的細(xì)菌亞型 耐藥菌株出現(xiàn)耐藥菌株出現(xiàn) 毒力變異株出現(xiàn)毒力變異株出現(xiàn) 抗原漂移與抗原變異抗原漂移與抗原變異 。在疾病預(yù)防控制中的應(yīng)用在疾病預(yù)防控制中的應(yīng)用同源性追蹤同源性追蹤細(xì)菌分型細(xì)菌分型傳染控制傳染控制dna多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (rflp) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (aflp) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析

7、技術(shù)分析技術(shù) (rapd) 細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù) (rep-pcr) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge) 。dna多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (rflp) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (aflp) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析技術(shù)分析技術(shù) (rapd) 細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù) (rep-pcr) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge) 。 1974年首創(chuàng)，以年首創(chuàng)，以dna-dna雜交為基礎(chǔ)雜交為基礎(chǔ)的的第一代遺傳標(biāo)記

8、第一代遺傳標(biāo)記，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術(shù)、探針印跡技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用 一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析restriction fragment length polymorphism，rflp 因此，因此，rflp即是基于限制性核酸內(nèi)切酶即是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消酶切消化核酸化核酸及及標(biāo)記的標(biāo)記的dna探針探針能與任何序列相似的片能與任何序列相似的片段雜交，通過片段長(zhǎng)度變異性來檢測(cè)生物體多態(tài)段雜交，通過片段長(zhǎng)度變異性來檢測(cè)生物體多態(tài)性性基基 本本 原原 理理 每種生物基因型具有其每種生物基因型具有其

9、獨(dú)特的特征獨(dú)特的特征，及，及獨(dú)特獨(dú)特的限制酶識(shí)別序列分布的限制酶識(shí)別序列分布，其基因組，其基因組dna在限制性在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等片段大小不等片段，這，這些片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射些片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射性同位素性同位素標(biāo)記的標(biāo)記的dna作探針作探針，將與被標(biāo)記的，將與被標(biāo)記的dna相關(guān)的片段檢測(cè)出來，即可構(gòu)建出相關(guān)的片段檢測(cè)出來，即可構(gòu)建出多態(tài)性圖譜多態(tài)性圖譜。核酸分子雜交技術(shù)原理核酸分子雜交技術(shù)原理v 核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度2020 3030時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中加入的時(shí)，反

10、應(yīng)系統(tǒng)中加入的核酸探針核酸探針與待測(cè)核酸樣品中具有互補(bǔ)序列的單鏈與待測(cè)核酸樣品中具有互補(bǔ)序列的單鏈dnadna或或rnarna形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)即形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)即可檢測(cè)特定的核苷酸片段?？蓹z測(cè)特定的核苷酸片段。 rflp操作流程圖操作流程圖基本基本方法方法 提取基因組提取基因組dna限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 dna變性、轉(zhuǎn)膜、固定變性、轉(zhuǎn)膜、固定核酸雜交核酸雜交 顯影、顯色、分析顯影、顯色、分析轉(zhuǎn)移電泳槽聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)性分析技術(shù) pcr-rflp基本原理基本原理 結(jié)合結(jié)合

11、pcr技術(shù)技術(shù)與與rflp技術(shù)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其基本原的優(yōu)點(diǎn)，其基本原理是對(duì)理是對(duì)目的基因片段目的基因片段pcr擴(kuò)增擴(kuò)增后，利用多種限制后，利用多種限制性內(nèi)切酶，對(duì)性內(nèi)切酶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同基因序列，不同基因序列，不同限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳后可產(chǎn)生不同限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳后可產(chǎn)生不同電泳圖譜不同電泳圖譜，通過對(duì)電泳圖譜的分析，得出基因，通過對(duì)電泳圖譜的分析，得出基因多態(tài)性結(jié)果。多態(tài)性結(jié)果。2021-11-13四川大學(xué)華西公衛(wèi) 裴曉方 26kary mullis1993 年因此榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年因此榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) v聚合酶鏈反應(yīng)是在體外酶促擴(kuò)增特定聚合

12、酶鏈反應(yīng)是在體外酶促擴(kuò)增特定dna或或rna片段的技術(shù)。片段的技術(shù)。 v由變性由變性 、 退火退火 、 延伸三個(gè)基本步驟構(gòu)成延伸三個(gè)基本步驟構(gòu)成 pcr反應(yīng)五要素的優(yōu)化反應(yīng)五要素的優(yōu)化 1、多聚核苷酸引物、多聚核苷酸引物 2、taq dna聚合酶聚合酶 3、dntp（三磷酸脫氧核苷酸）（三磷酸脫氧核苷酸） 4、模板核酸、模板核酸 5、緩沖液、緩沖液基基 本本 程程 序序1. 提取提取dna2. 設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行目的基因設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行目的基因pcr反應(yīng)反應(yīng)3. 將將dna擴(kuò)增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶切4. 將酶切出來的具各種長(zhǎng)度的將酶切出來的具各種長(zhǎng)度的dna

13、片段在瓊脂片段在瓊脂 糖凝膠上電泳分離糖凝膠上電泳分離5. 對(duì)顯示出來的帶譜進(jìn)行分析對(duì)顯示出來的帶譜進(jìn)行分析。 rflp與與pcr-rflp的應(yīng)用的應(yīng)用1.結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌is6110-rflp分析分析2.厭氧菌厭氧菌16srrna基因基因pcr-rflp分析分析 3.其他其他 我的肥胖課題我的肥胖課題ppar-2及及ucp2基因多態(tài)性與成都地區(qū)基因多態(tài)性與成都地區(qū)單純性肥胖相關(guān)性初探單純性肥胖相關(guān)性初探 ppar-2 調(diào)節(jié)脂肪組織分化，脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵作用調(diào)節(jié)脂肪組織分化，脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵作用 其基因突變發(fā)生于染色體其基因突變發(fā)生于染色體3p25 外顯子外顯子2的第的第12位

14、密碼子位密碼子cca-gca突變突變 造成造成脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼岣彼徂D(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，即，即pa多態(tài)性多態(tài)性 ucp2 調(diào)節(jié)機(jī)體的基礎(chǔ)代謝率調(diào)節(jié)機(jī)體的基礎(chǔ)代謝率(bmr)來控制體重來控制體重 其定位于人類其定位于人類11號(hào)染色體號(hào)染色體(11q13) 外顯子外顯子2 ，第，第55位密碼子位密碼子gca-gta突變突變 造成造成丙氨酸轉(zhuǎn)變纈氨酸，即丙氨酸轉(zhuǎn)變纈氨酸，即av多態(tài)性多態(tài)性 600bp 500bp 400bp 300bp 250bp 200bp 150bp 126bp 100bp 98bp maker 1 2 3圖9 ucp2 pcr產(chǎn)物經(jīng)bbv內(nèi)切酶酶切后3.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果注：

15、基因型為基因型為aa型型:被酶解為98bp,1條帶(第3泳道); 基因型為基因型為av型型:被酶解為126bp、98bp，2條帶(第1泳道) 基因型為基因型為vv型型:被酶解，仍為126bp l條帶(第2泳道)a vv vaadna多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (rflp) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (aflp) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析技術(shù)分析技術(shù) (rapd) 細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù) (rep-pcr) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge) 。 二、擴(kuò)增

16、片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)二、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)amplified fragment length polymorphism，aflp 結(jié)合了限制性酶切消化的可靠性和嚴(yán)格的結(jié)合了限制性酶切消化的可靠性和嚴(yán)格的pcr退火條件，有退火條件，有高度特異性高度特異性，既，既克服克服了了rflp技技術(shù)中術(shù)中southen雜交雜交繁瑣和耗時(shí)繁瑣和耗時(shí)的缺點(diǎn)，又解決了的缺點(diǎn)，又解決了rapd等技術(shù)中非特異等技術(shù)中非特異pcr擴(kuò)增引起的可信度問題。擴(kuò)增引起的可信度問題。 aflp技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明基基 本本 原原 理理 aflp指紋圖譜是通過指紋圖譜是通過pcr技術(shù)擴(kuò)增基因組技術(shù)擴(kuò)增基因組dna限制性酶

17、切片段限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰，然后在高分辨率聚丙烯酰胺凝膠或毛細(xì)管凝膠中胺凝膠或毛細(xì)管凝膠中電泳電泳而獲得。而獲得。 aflp技術(shù)檢測(cè)的是酶切位點(diǎn)單核苷酸改變技術(shù)檢測(cè)的是酶切位點(diǎn)單核苷酸改變或其臨近的用于或其臨近的用于aflp引物退火的核苷酸改變所引物退火的核苷酸改變所致的序列多態(tài)性。致的序列多態(tài)性。補(bǔ)充原理圖補(bǔ)充原理圖aflp原理和操作流程圖原理和操作流程圖基因組基因組dna提取提取酶切與接頭連接酶切與接頭連接pcr擴(kuò)增擴(kuò)增電泳分析電泳分析基本程序基本程序例子：例子：ewgli制定的軍團(tuán)菌制定的軍團(tuán)菌aflp分型標(biāo)準(zhǔn)方法分型標(biāo)準(zhǔn)方法1. 細(xì)菌培養(yǎng)和模板制備細(xì)菌培養(yǎng)和模板制備

18、初次分離的軍團(tuán)菌單個(gè)菌株在初次分離的軍團(tuán)菌單個(gè)菌株在bcye-瓊脂平板上二瓊脂平板上二次傳代，次傳代，3537培養(yǎng)培養(yǎng)23d，確定為純培養(yǎng)。挑取次代，確定為純培養(yǎng)。挑取次代純培養(yǎng)菌落純培養(yǎng)菌落用用nucleon bacc2配套配套dna提取液，提取液，rnase a酶消化后酶消化后提取基因組提取基因組dna。在。在260nm吸光度測(cè)定基因吸光度測(cè)定基因組組dna濃度。濃度。 2. 限制性酶切與連接反應(yīng)限制性酶切與連接反應(yīng) 限制性酶切與連接反應(yīng)體系限制性酶切與連接反應(yīng)體系包括包括基因組基因組dna、接接頭頭aflp-lg1（5-ctcgtagactgcg tacatgca-3）、）、接頭接頭af

19、lp-lg2（5-tgtacgcagtctac-3）、）、pst酶酶、t4連接酶連接酶、1酶連接緩沖液，酶連接緩沖液，37反應(yīng)反應(yīng)3h。 與接頭連接好的標(biāo)記與接頭連接好的標(biāo)記dna片段用片段用2.5mol/l醋酸胺、醋酸胺、純乙醇沉淀。室溫孵育純乙醇沉淀。室溫孵育5min后，后，4 12000g離心離心10min，70%乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入100l te緩沖液配成懸液，緩沖液配成懸液，-20保存。保存。3. pcr擴(kuò)增擴(kuò)增 pcr擴(kuò)增反應(yīng)采用處理過的固化擴(kuò)增反應(yīng)采用處理過的固化taq酶珠，酶珠，反應(yīng)體系包括模板反應(yīng)體系包括模板dna ，選擇性引物選擇性引物（

20、aflp-pst-g：5-gactgcgtacatgcagg-3），），dntp，2.5mmol/l mgcl2。熱循環(huán)參數(shù)為：。熱循環(huán)參數(shù)為：94 1min，60 1min，72 2.5min，循環(huán)，循環(huán)33次。次。 4. 凝膠電泳凝膠電泳 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓瓊脂糖凝膠電泳，電壓3.45v/cm，電，電泳泳4h。需在每一個(gè)樣品電泳帶旁加一個(gè)分子量。需在每一個(gè)樣品電泳帶旁加一個(gè)分子量標(biāo)記條帶。每塊膠的第一個(gè)樣品孔加入來源于標(biāo)記條帶。每塊膠的第一個(gè)樣品孔加入來源于ewgli標(biāo)準(zhǔn)化分型的標(biāo)準(zhǔn)化分型的dresden aflp015型型aflp產(chǎn)物（產(chǎn)物（eul no.137）。凝膠經(jīng)）。凝

21、膠經(jīng)eb染色染色30min，紫外光下照相或數(shù)字記錄。，紫外光下照相或數(shù)字記錄。5. 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 將未知型在將未知型在ewgli建立的軍團(tuán)菌建立的軍團(tuán)菌aflp型數(shù)據(jù)庫型數(shù)據(jù)庫中分析，中分析，聚類分析聚類分析以條帶的選擇為以條帶的選擇為基礎(chǔ)，分群分析通過基礎(chǔ)，分群分析通過dice系數(shù)和應(yīng)用平均數(shù)系數(shù)和應(yīng)用平均數(shù)的非加權(quán)成組配對(duì)法（的非加權(quán)成組配對(duì)法（udgma）。條帶位置）。條帶位置容許誤差容許誤差=2%，最優(yōu)化位置，最優(yōu)化位置=0.5%。可分析?？煞治?00bp2500bp的的dna擴(kuò)增片段。擴(kuò)增片段。補(bǔ)充原理圖補(bǔ)充原理圖aflp原理和操作流程圖原理和操作流程圖 影影 響響 因因 素素1

22、. 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（1）一般采用）一般采用雙酶切雙酶切（2）由一個(gè)）由一個(gè)高頻高頻內(nèi)切酶和一個(gè)內(nèi)切酶和一個(gè)低頻低頻內(nèi)切酶組成內(nèi)切酶組成（3）一般）一般高（高（g+c）摩爾分?jǐn)?shù)的基因組選擇識(shí)別位摩爾分?jǐn)?shù)的基因組選擇識(shí)別位點(diǎn)富含（點(diǎn)富含（g+c）的內(nèi)切酶組合；）的內(nèi)切酶組合；低（低（g+c）摩爾分摩爾分?jǐn)?shù)的基因組選擇識(shí)別位點(diǎn)富含數(shù)的基因組選擇識(shí)別位點(diǎn)富含at的內(nèi)切酶組合的內(nèi)切酶組合（4）酶切反應(yīng)對(duì)）酶切反應(yīng)對(duì)模板質(zhì)量模板質(zhì)量要求很高要求很高（5）酶切時(shí)間）酶切時(shí)間1 3h（6）dna含量一般含量一般0.5g左右，左右，dna含量不應(yīng)太高含量不應(yīng)太高 2. 接頭接頭 接頭是人工合成的接頭是

23、人工合成的一段短核苷酸一段短核苷酸雙鏈雙鏈，一，一般長(zhǎng)度是般長(zhǎng)度是1117個(gè)核苷酸，由個(gè)核苷酸，由中心序列中心序列和和限制酶限制酶切特異序列切特異序列兩部分組成。注意兩部分組成。注意接頭接頭5端為非磷酸端為非磷酸化化，以防接頭間的連接并保證其只能在，以防接頭間的連接并保證其只能在3端與限端與限制性片段連接。制性片段連接。 apa(gggcc/c)接頭的結(jié)構(gòu)接頭的結(jié)構(gòu) 5- tcgtagactgcgtaca ggcc-3 3- catctgacgcatgt-5中心序列中心序列酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)補(bǔ)充原理圖補(bǔ)充原理圖aflp原理和操作流程圖原理和操作流程圖3. 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 引物由三部分組成：與引

24、物由三部分組成：與接頭序列匹配的中心序列接頭序列匹配的中心序列，相，相應(yīng)的應(yīng)的酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)和和3端的選擇性堿基端的選擇性堿基。如如apa 引物：引物： 5-gactgcgtaca ggccc nnn-3 中心序列中心序列 apa切點(diǎn)切點(diǎn) 選擇性堿基選擇性堿基 重要特征是所有引物重要特征是所有引物5 端是端是g堿基堿基, 可有效防止雙可有效防止雙鏈的形成引物。鏈的形成引物。 設(shè)計(jì)主要在選擇性設(shè)計(jì)主要在選擇性堿基數(shù)目及組合堿基數(shù)目及組合上。選擇性堿上。選擇性堿基通常為基通常為13個(gè)，對(duì)基因組較復(fù)雜的生物體在兩個(gè)引個(gè)，對(duì)基因組較復(fù)雜的生物體在兩個(gè)引物的物的3端至少有端至少有3個(gè)選擇性核苷酸才能獲

25、得合適指紋圖，個(gè)選擇性核苷酸才能獲得合適指紋圖，而細(xì)菌基因組小，一般而細(xì)菌基因組小，一般1個(gè)選擇性核苷酸即足夠了。個(gè)選擇性核苷酸即足夠了。補(bǔ)充原理圖補(bǔ)充原理圖aflp原理和操作流程圖原理和操作流程圖gg4. 擴(kuò)增條件擴(kuò)增條件 aflp反應(yīng)條件與常規(guī)反應(yīng)條件與常規(guī)pcr主要不同之處是采用主要不同之處是采用溫溫度梯度度梯度pcr，即，即pcr始于高溫復(fù)性始于高溫復(fù)性（一般采用（一般采用65，比常規(guī)比常規(guī)pcr退火溫度高退火溫度高10左右）左右）以期獲得最佳選擇以期獲得最佳選擇性性，以后，以后退火溫度逐步降低退火溫度逐步降低（每循環(huán)降低（每循環(huán)降低0.7），一），一直降到最適退火溫度，然后在這個(gè)溫度

26、下完成其余直降到最適退火溫度，然后在這個(gè)溫度下完成其余pcr循環(huán)。循環(huán)。 對(duì)于復(fù)雜基因，一般采用對(duì)于復(fù)雜基因，一般采用兩步法擴(kuò)增兩步法擴(kuò)增。 應(yīng)應(yīng) 用用 1. 細(xì)菌分型細(xì)菌分型 軍團(tuán)菌、大腸桿菌、根瘤土壤桿菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌、根瘤土壤桿菌、表皮葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、黃桿菌屬、表皮葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、黃桿菌屬、氣單胞菌屬、梭狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌氣單胞菌屬、梭狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬等。屬和弧菌屬等。 2. 細(xì)菌鑒定細(xì)菌鑒定 芽孢桿菌屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽芽孢桿菌屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、耶爾森菌、孢桿菌、蘇云金芽

27、孢桿菌、大腸桿菌、耶爾森菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌等。金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌等。3. 流行病學(xué)調(diào)查流行病學(xué)調(diào)查 aflp at esr: towards an international standarda. butzleric. colic. jejunidna多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (rflp) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (aflp) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析技術(shù)分析技術(shù) (rapd) 細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù) (rep-pcr) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈

28、沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge) 。三、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性三、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析技術(shù)分析技術(shù)random amplified polymorphism dna， rapd 以以pcr技術(shù)為背景，以技術(shù)為背景，以人工合成的堿基人工合成的堿基順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈為引物順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈為引物，對(duì)所研究，對(duì)所研究的基因組的基因組dna進(jìn)行進(jìn)行pcr擴(kuò)增擴(kuò)增，經(jīng)，經(jīng)電泳分離電泳分離后產(chǎn)生后產(chǎn)生dna指紋圖譜。指紋圖譜。 基基 本本 原原 理理 模板模板dna經(jīng)經(jīng)9294變性解鏈后，在較低變性解鏈后，在較低溫度下退火，此時(shí)，有溫度下退火，此時(shí)，有許多位點(diǎn)許多位點(diǎn)能能與隨機(jī)合成與隨機(jī)合成的短引物

29、互補(bǔ)而形成雙鏈結(jié)構(gòu)的短引物互補(bǔ)而形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果某兩位點(diǎn)。如果某兩位點(diǎn)間在可擴(kuò)增范圍之內(nèi)，且分別位于互補(bǔ)的兩條間在可擴(kuò)增范圍之內(nèi)，且分別位于互補(bǔ)的兩條單鏈上，并且與引物的單鏈上，并且與引物的3端相對(duì)應(yīng)，就可以通過端相對(duì)應(yīng)，就可以通過pcr得到一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。得到一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物?；?本本 原原 理理 rapd所用的一系列所用的一系列dna引物序列各不相引物序列各不相同，但同，但對(duì)于任意特定引物對(duì)于任意特定引物，它同基因組，它同基因組dna序序列有其特定結(jié)合位點(diǎn)，列有其特定結(jié)合位點(diǎn)，如果基因組在這些區(qū)域如果基因組在這些區(qū)域發(fā)發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特生片段插入、缺失或堿基突變就可

30、能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)變化發(fā)生相應(yīng)變化，而使，而使pcr產(chǎn)物產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量改變，增加、減少或發(fā)生分子量改變，產(chǎn)生多態(tài)性圖譜產(chǎn)生多態(tài)性圖譜?？偪俤na提取提取隨機(jī)引物合成隨機(jī)引物合成pcr擴(kuò)增擴(kuò)增隨機(jī)引物篩選隨機(jī)引物篩選電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)圖譜分析圖譜分析基本程序基本程序dna多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (rflp) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (aflp) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna分析技術(shù)分析技術(shù) (rapd) 細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù)

31、 (rep-pcr) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge) 。細(xì)菌基因組重復(fù)序列細(xì)菌基因組重復(fù)序列pcr技術(shù)技術(shù)repetitive-element pcr, rep-pcr 一種基于一種基于pcr的的dna標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)rep-pcr-原理原理 rep-pcr技術(shù)是利用基因組中廣泛分布技術(shù)是利用基因組中廣泛分布的的短重復(fù)序列（短重復(fù)序列（repetitive sequences)為引物為引物進(jìn)行進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過對(duì)擴(kuò)增，通過對(duì)pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行比較，來分析菌株間基因組存在的差異。進(jìn)行比較，來分析菌株間基因組存在的差異。rep-pcr-短重復(fù)序列短重復(fù)序列 目前研

32、究最多、最常用的細(xì)菌基因組短重復(fù)序列有目前研究最多、最常用的細(xì)菌基因組短重復(fù)序列有：基因外重復(fù)回文序列基因外重復(fù)回文序列（repetitive intergenic palindrome, rep)腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列（entero-bacterial repetitive intergenic consensus, eric)rep-pcr-短重復(fù)序列短重復(fù)序列 兩者的兩者的共同特征共同特征是它們?cè)诩?xì)菌基因組中存是它們?cè)诩?xì)菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量的分布和拷貝數(shù)量的差異差異，而序列本身在進(jìn)化過程中又具有較強(qiáng)的，而序列

33、本身在進(jìn)化過程中又具有較強(qiáng)的保守性保守性?；谶@兩種短重復(fù)序列的?；谶@兩種短重復(fù)序列的pcr就成為就成為rep-pcr的的2個(gè)重要的技術(shù)個(gè)重要的技術(shù) rep-pcr eric-pcr兩種短重復(fù)序列的特點(diǎn)及功能兩種短重復(fù)序列的特點(diǎn)及功能rep序列序列 基因外重復(fù)回文序列（基因外重復(fù)回文序列（rep）又稱回文單位，其結(jié)）又稱回文單位，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是構(gòu)特點(diǎn)是回文性質(zhì)回文性質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄的，其轉(zhuǎn)錄的mrna有形成莖有形成莖-環(huán)環(huán)（stem-loop）結(jié)構(gòu)的潛能。）結(jié)構(gòu)的潛能。 rep家族序列由家族序列由38bp構(gòu)成，含有構(gòu)成，含有6個(gè)非常保守的位個(gè)非常保守的位點(diǎn)及點(diǎn)及5bp構(gòu)成的位于非常保守的回文臂之間的

34、保守環(huán)。構(gòu)成的位于非常保守的回文臂之間的保守環(huán)。 rep家族序列廣泛分布在家族序列廣泛分布在大腸埃希菌大腸埃希菌和和沙門菌沙門菌基因基因組內(nèi)。組內(nèi)。rep序列可以單獨(dú)出現(xiàn)或增加為序列可以單獨(dú)出現(xiàn)或增加為4個(gè)串聯(lián)的重復(fù)個(gè)串聯(lián)的重復(fù)單位。在單位。在e.coli的染色體上，存在的染色體上，存在500到到1000個(gè)的個(gè)的rep串串聯(lián)重復(fù)單位，在沙門菌上聯(lián)重復(fù)單位，在沙門菌上rep串聯(lián)重復(fù)單位約占基因組串聯(lián)重復(fù)單位約占基因組的的1%。rep序列的功能：序列的功能：轉(zhuǎn)錄終止作用；轉(zhuǎn)錄終止作用；穩(wěn)定穩(wěn)定mrna；在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用rep-pcr-rep-pcr技術(shù)技術(shù) 根據(jù)根據(jù)rep這段高度保守的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)這段高度保守的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增兩段