第2章細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

1、第第2章章 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)2.1 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2.1.1 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)顯微鏡和顯微鏡的分辨能力顯微鏡和顯微鏡的分辨能力肉眼：肉眼：0.2 mm; 光鏡：光鏡：0.2 m; 電鏡：電鏡：0.2 nm0.61 分辨率分辨率 dn . sin / 2=: 光源波長(zhǎng)光源波長(zhǎng); : 物鏡鏡口角物鏡鏡口角; n: 介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率顯微鏡成像原理顯微鏡成像原理普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡（light microscope）雙目顯微鏡雙目顯微鏡正置顯微鏡正置顯微鏡倒置顯微鏡倒置顯微鏡相差顯微鏡相差顯微鏡（phase-contrast m

2、icroscope）（光程差或相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿嗖畎澹ü獬滩罨蛳辔徊钷D(zhuǎn)變?yōu)檎穹?，相差板）微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡（differential-interference microscope）（厚度差轉(zhuǎn)變?yōu)槊靼挡?；增加樣品反差，立體感強(qiáng)）（厚度差轉(zhuǎn)變?yōu)槊靼挡?；增加樣品反差，立體感強(qiáng)）熒光顯微鏡熒光顯微鏡（fluorescence microscope）熒光顯微鏡及其照片熒光顯微鏡及其照片黏著斑蛋白黏著斑蛋白細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架激光共聚焦原理激光共聚焦原理激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope）激光共聚焦顯微鏡及其顯微圖像激光共

3、聚焦顯微鏡及其顯微圖像黏著斑蛋白黏著斑蛋白細(xì)胞骨架（應(yīng)力纖維）細(xì)胞骨架（應(yīng)力纖維）共定位分析共定位分析暗視野成像原理暗視野成像原理顯微鏡的暗視野功能顯微鏡的暗視野功能(a)明視野顯微術(shù)；明視野顯微術(shù)；(b)相差顯微術(shù)；相差顯微術(shù)；(c)微分干涉顯微術(shù)；微分干涉顯微術(shù)；(d)暗視野顯微術(shù)暗視野顯微術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（fluorescence recovery after photobleaching, frap）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer, fret）1）電鏡基本知識(shí)和結(jié)構(gòu)（波長(zhǎng)小于）電鏡

4、基本知識(shí)和結(jié)構(gòu)（波長(zhǎng)小于0.1nm）2）樣品制備）樣品制備 （超薄切片，負(fù)染色，冰凍蝕刻，三維重構(gòu)，掃描）（超薄切片，負(fù)染色，冰凍蝕刻，三維重構(gòu)，掃描）3）電鏡種類）電鏡種類 掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡2.1.2 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)透射電鏡及其圖像透射電鏡及其圖像透射電鏡照片透射電鏡照片免疫電鏡照片免疫電鏡照片掃描電鏡及其圖像掃描電鏡及其圖像掃描電鏡照片掃描電鏡照片冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻電鏡技術(shù)照片冰凍蝕刻電鏡技術(shù)照片負(fù)染色電鏡技術(shù)照片負(fù)染色電鏡技術(shù)照片2.2.1 高速、超速和梯度密度

5、離心分離各種細(xì)胞器、生物高速、超速和梯度密度離心分離各種細(xì)胞器、生物 大分子及其復(fù)合物大分子及其復(fù)合物2.2 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法差速離心差速離心密度梯度離心密度梯度離心差速離心過(guò)程差速離心過(guò)程2.2.2 細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色dna：福爾根（：福爾根（feulgen）反應(yīng)紫紅色）反應(yīng)紫紅色多糖類：多糖類：pas反應(yīng)黃色反應(yīng)黃色脂肪：蘇丹脂肪：蘇丹iii紅色紅色蛋白質(zhì)：米倫（蛋白質(zhì)：米倫（millon）紅色）紅色2.2.3 特異抗原的定性與定位特異抗原的定性與定位免疫熒光免疫熒光免疫電鏡免疫電鏡免疫沉淀免疫沉淀weste

6、rn blotting2.2.5 特異核酸標(biāo)記技術(shù)特異核酸標(biāo)記技術(shù)in situ hybridizationnorthern blot (rna); southern blot (dna)2.2.4 放射性標(biāo)記生物大分子的合成和動(dòng)態(tài)放射性標(biāo)記生物大分子的合成和動(dòng)態(tài)3h（dna合成）合成）35s（蛋白質(zhì)合成）（蛋白質(zhì)合成）14c（碳水化合物合成）（碳水化合物合成）32p（核酸合成）（核酸合成）定性、定位、半定量研究（標(biāo)記，自顯影）定性、定位、半定量研究（標(biāo)記，自顯影）32p（14天）天）, 14c（5760年）年）, 3h（12年）年）, 35s（87天）天）, 131i （8）原位雜交技術(shù)原位

7、雜交技術(shù)2.2.6 定量細(xì)胞化學(xué)技術(shù)定量細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.2.7 細(xì)胞內(nèi)大分子的分離與分析細(xì)胞內(nèi)大分子的分離與分析 柱層析、分子篩、免疫吸附、免疫沉淀等方法分離柱層析、分子篩、免疫吸附、免疫沉淀等方法分離 蛋白質(zhì)組分及復(fù)合物（交聯(lián)和變性）蛋白質(zhì)組分及復(fù)合物（交聯(lián)和變性）顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù) （紫外顯微分光光度儀、可見(jiàn)光顯微分光光度染色）（紫外顯微分光光度儀、可見(jiàn)光顯微分光光度染色）流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀蛋白質(zhì)電泳分析蛋白質(zhì)電泳分析流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 1）植物細(xì)胞）植物細(xì)胞 （單倍體細(xì)胞培養(yǎng)

8、，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細(xì)胞培養(yǎng)）（單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細(xì)胞培養(yǎng)） 2）動(dòng)物細(xì)胞）動(dòng)物細(xì)胞 （原代細(xì)胞培養(yǎng)，永生細(xì)胞系）（原代細(xì)胞培養(yǎng)，永生細(xì)胞系） 3）非細(xì)胞體系）非細(xì)胞體系 （dna復(fù)制，復(fù)制，rna轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡 運(yùn)輸，細(xì)胞核裝配等）運(yùn)輸，細(xì)胞核裝配等） 細(xì)胞提取物，細(xì)胞核提取物細(xì)胞提取物，細(xì)胞核提取物植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的克隆細(xì)胞的克隆2.3.2 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 1）細(xì)胞融合與雜交）細(xì)胞融合與雜交 植物細(xì)胞先去壁；植物細(xì)胞先去壁； 融合方式：仙臺(tái)病毒或聚乙二醇介導(dǎo)，電融合等融合方式：仙臺(tái)病毒或聚乙

9、二醇介導(dǎo)，電融合等 同核融合細(xì)胞，異核融合細(xì)胞，染色體丟失同核融合細(xì)胞，異核融合細(xì)胞，染色體丟失 2）單克隆抗體技術(shù)）單克隆抗體技術(shù)2.3.3 顯微操作技術(shù)顯微操作技術(shù)1975年英國(guó)科學(xué)家年英國(guó)科學(xué)家milstein and kohler, 1984年獲諾貝爾獎(jiǎng)年獲諾貝爾獎(jiǎng)b淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 + 小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞核、細(xì)胞器、基因等轉(zhuǎn)移細(xì)胞核、細(xì)胞器、基因等2.3.4 轉(zhuǎn)基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等轉(zhuǎn)基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)顯微操作儀顯微操作儀顯微操作示意圖顯微操作示意圖mario capecchi (late 1980s) (universi

10、ty of utah)embryonic stem cells in inner cell mass as target cells1/104 cells undergo a process of homologous recombination. 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)2.4 細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物病毒（轉(zhuǎn)基因載體）病毒（轉(zhuǎn)基因載體）細(xì)菌（大腸桿菌作為基因工程菌株）細(xì)菌（大腸桿菌作為基因工程菌株）酵母（真核表達(dá)載體，基因功能分析）酵母（真核表達(dá)載體，基因功能分析）線蟲(chóng)（線蟲(chóng)（1000個(gè)左右細(xì)胞構(gòu)成）個(gè)左右細(xì)胞構(gòu)成）黏菌（同步化材料）黏菌（同步化材料）蛙（卵細(xì)胞大，易操作）蛙（卵細(xì)胞大，易操作）果蠅（遺傳背景清楚，表型易掌握）果蠅（遺傳背景清楚，表型易掌握）斑馬魚（胚胎發(fā)育研究的好材料）斑馬魚（胚胎發(fā)育研究的好材料）小鼠（與人更接近）小鼠（與人更接近）學(xué)生報(bào)告題目：學(xué)生報(bào)告題目： 1，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用；，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用； 2，細(xì)胞工程技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用；，細(xì)胞工程技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用； 3，基因敲除技術(shù)及其應(yīng)用；，基因敲除技術(shù)及其應(yīng)用； 4，模式生物線蟲(chóng)及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用；，模式生物線蟲(chóng)及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用； 5，模式生物斑馬魚及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用；，模式生