湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)-03-蛋白質(zhì)化學(xué)-05蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)_PDF轉(zhuǎn)換成word轉(zhuǎn)換器

1、 第二章蛋白質(zhì)化學(xué) 第二章蛋白質(zhì)化學(xué)本章內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸第二節(jié) 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第六節(jié) 蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù) 第五節(jié)、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)和氨基酸的一樣，游離的a-氨基、a-羧基和R基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團(tuán)類似的反應(yīng)。一、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng) 一、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)+ OH-NH2+ OH-NH3+NH3+PrCOO-PrPr+ H+ H+COO-COOHpH< pI凈電荷為

2、正pH = pI凈電荷=0pH > pI凈電荷為負(fù)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定 pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兼性離子，凈電荷為零，在電場中既不向陽極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的 pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI）n酸性AA與堿性AA的比值n中性鹽的影響：可解離基團(tuán)與Cl、Mg- 2+ 等電點(diǎn)時(shí)特點(diǎn)（1）凈電荷為零（2）一定離子強(qiáng)度的緩沖液（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸堿性AA/酸性AA比例 等電點(diǎn)胃蛋白酶 0.2血紅蛋白 1.7細(xì)胞色素C 2.91.06.710.78.2菊糖酶0.34（4）在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓

3、都最小。 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)根據(jù)溶質(zhì)在溶劑中的顆粒大小（分散程度），可以把分散系統(tǒng)分為3類：分散相質(zhì)點(diǎn)小于1nm的為真溶液，大于100nm的為懸濁液，介于l100nm的為膠體溶液。分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需具備3個(gè)條件：p分散相質(zhì)點(diǎn)大小在l-100nm范圍內(nèi)，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中不斷作布朗運(yùn)動(dòng)；p分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥，不易聚集成大顆粒而沉淀；p分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層，質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成 1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征。

4、可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時(shí)這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用透析：利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在透析袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。超濾：是利用外加壓或離心使水和其他分子通過半透膜，蛋白質(zhì)留在膜上。超濾主要用于蛋白質(zhì)分子的濃縮、脫鹽等。 三、蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子凝聚并從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)。變性蛋

5、白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有三種穩(wěn)定因素：顆粒表面的水化層；電荷；布朗運(yùn)動(dòng)。除去前兩個(gè)穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點(diǎn)和加入脫水劑)，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。 常用的沉淀方法：(一)鹽析(Salting Out)在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性（中和電荷的同時(shí)破壞水化層）而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。(二)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽沉淀，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子帶較多的負(fù)離子時(shí)，更易進(jìn)行。(三)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)

6、蛋白質(zhì)可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯乙酸、過氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)帶正電荷時(shí)，易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗(yàn)部門用來除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)。 常用的沉淀方法：(四)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時(shí)間則可使變性速度減慢。(五)加熱凝固加熱蛋白質(zhì)溶液，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固(coagulation)而沉淀。e.g.將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液

7、加熱并點(diǎn)入少量 鹽鹵（含 MgCl2）制作豆腐。 四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性某些物理因素和化學(xué)因素，使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象被破壞，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能隨之改變或喪失，這種現(xiàn)象稱為變性作用（denaturation）。其本質(zhì)是破壞了形成與穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的次級(jí)鍵，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變或破壞，而并不涉及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變或肽鍵的斷裂。n生物活性的喪失是變性的主要表現(xiàn)；n構(gòu)象的破壞是蛋白質(zhì)變性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性物理因素：高溫、紫外線、X-射線、超聲波、高壓、劇烈的攪拌、震蕩等（表面張力）化學(xué)因素：強(qiáng)酸和強(qiáng)堿（破壞解離狀態(tài)等）、尿素和鹽酸胍（競爭氫鍵）、

8、去污劑（破壞疏水鍵）、濃乙醇（破壞疏水2+ + 2+鍵等）、重金屬鹽（如Hg 、Ag 、Pb 等）等。表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)、光譜特性等）和生物化學(xué)性質(zhì)（易被蛋白酶分解）改變。蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。 核糖核酸酶變性與復(fù)性作用8 M脲，巰基乙醇變性透析復(fù)性天然狀態(tài)還原變性狀態(tài) 五、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（ 200-230nm）有較大的吸收，在280nm 有一特征吸收峰，可利用這一特性

9、對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。注意事項(xiàng)：測定范圍 0.10.5mg/mL經(jīng)驗(yàn)公式法：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）= 1.55A 2801cm- 0.76A1cm260 六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)1、茚三酮反應(yīng)NH2末端的氨基酸殘基也能與茚三酮發(fā)生定量反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，可用于蛋白質(zhì)的定性、定量分析。2、酚試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)可以與酚制劑（如Folin酚）發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物，可以用于蛋白質(zhì)的精確定量分析。3、雙縮脲反應(yīng)是肽與蛋白質(zhì)所特有、而氨基酸則沒有的一個(gè)顏色反應(yīng)。含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物，可用于測定蛋白質(zhì)的含量。 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

10、 第二章蛋白質(zhì)化學(xué)本章內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸第二節(jié) 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第六節(jié) 蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù) 第六節(jié) 蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)一、蛋白質(zhì)分離、純化一般原則二、蛋白質(zhì)分離、純化方法三、蛋白質(zhì)含量測定和純度鑒定 一）蛋白質(zhì)分離、純化一般原則對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x純化程序以獲得高純度的制品。蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度或比活，以增加單位蛋白質(zhì)重量中所需蛋白質(zhì)的含量或生物活性。分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為：1、前處理2、粗分級(jí)分離3、細(xì)分級(jí)分離 1、前處理分離純化某一蛋白質(zhì)

11、，首先要將蛋白質(zhì)從原來的組織或者細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。動(dòng)物材料：剔除結(jié)締組織及脂肪組織種子材料：去殼、去種皮、脫脂破細(xì)胞動(dòng)物組織或細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波處理植物組織和細(xì)胞：存在細(xì)胞壁（纖維素、果膠等），利用石英砂、玻璃粉以及適當(dāng)?shù)奶崛∫貉心?，或用纖維素酶處理細(xì)菌細(xì)胞： 超聲震蕩、研磨、溶菌酶處理如果目的蛋白質(zhì)集中在某一細(xì)胞器中，如細(xì)胞核、染色體、核糖體、可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可以采用差速離心的方法對相應(yīng)的細(xì)胞組分進(jìn)行富集。 不同離心場下沉降的細(xì)胞組分相對離心場（g）1000時(shí)間（min）沉降的組分真核細(xì)胞5400010葉綠體、細(xì)胞碎片、細(xì)胞核線

12、粒體、細(xì)菌15 000203030 000溶酶體、細(xì)菌細(xì)胞碎片核糖體100 0003 10（h）相對離心場（Relative Centrifugal Field, RCF），以重力加速度g（980.66 cm/s ）2的倍數(shù)表示。4 p3600 x 980其中：離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為（r/min）r為平均半徑，以cm為單位，指離心機(jī)旋轉(zhuǎn)軸到離心管中間的距離(r/min)2·r2= 11.19 x 10 (r/min)-5 2·rRCF = 2、粗分級(jí)分離粗分級(jí)分離（Rough Fractionation）：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液獲得以后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開來

13、。常用方法：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)分離等特點(diǎn)：簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)溶液濃縮方法：超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥、聚乙二醇，等 3、細(xì)分級(jí)分離細(xì)分級(jí)分離（Fine Fractionation）：樣品經(jīng)過粗分級(jí)分離后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去，需要對樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化。常用的方法：1、層析法：包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等；2、電泳法：包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等特點(diǎn)：規(guī)模較小，但分辨率很高 二、蛋白質(zhì)分離、純化方法蛋白質(zhì)分離純化的方法，是以目的蛋白質(zhì)與雜蛋白或其他雜質(zhì)成分在溶液中下列性質(zhì)的差異為原理的：1、分子大小2、溶解

14、度3、帶電荷性質(zhì)4、吸附性質(zhì)5、對配體分子的生物學(xué)親和力 1、根據(jù)分子大小不同的純化方法1）透析和超（過）濾2）密度梯度（區(qū)帶）離心3）凝膠過濾 1）透析和超（過）濾透析袋透析（ dialysis）：利用蛋白質(zhì)分子不能通透析液過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。攪拌子常用的半透膜是玻璃紙（賽璐玢紙）、火棉紙（賽璐琔紙）以及其它改進(jìn)型的纖維素材料。磁力攪拌器透析裝置示意圖超過濾（ultrafiltration）：利用壓力或者離心力，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。濾膜離心 2）密度梯度（區(qū)帶）離心蛋白質(zhì)顆粒的沉降，不僅決

15、定于滴加樣品其大小，而且取決于其密度。蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身的密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不動(dòng)，最后，各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。4%8%離心管蔗糖濃度12%16%20%分成區(qū)帶的蛋白質(zhì)可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分部收集。蔗糖密度梯度 3）凝膠過濾凝膠過濾，又稱凝膠過濾層析，也稱分子排阻層析或凝膠滲透層析，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一。A、凝膠過濾的介質(zhì)B、凝膠過濾的原理 A、凝膠過濾的介質(zhì)凝膠過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠或稱凝膠顆粒，其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的交聯(lián)度或

16、孔度（網(wǎng)孔大小）決定了凝膠的分級(jí)分離范圍，即能夠被該凝膠分離開的蛋白質(zhì)混合物的相對分子量范圍，例如：Sephadex G-50的分級(jí)分離范圍是 1500 30000排阻極限有時(shí)候也被用來表示分級(jí)分離范圍的上限，其定義為“不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠微孔的最小分子的相對分子量”，例如：Sephadex G-50的排阻極限為 30000目前經(jīng)常使用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖（ Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gel P)和瓊脂糖(Sepharose或Bio-Gel A)等。 B、凝膠過濾的原理蛋白質(zhì)混合物小溶質(zhì)分子大溶質(zhì)分子水化的凝膠顆粒多孔板當(dāng)不同大小的蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子，不能

17、進(jìn)入珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被阻擋在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的間隙向下移動(dòng)，首先流出凝膠柱。比網(wǎng)孔小的分子，不同程度地進(jìn)入凝膠珠中，以不同的速度流出層析柱。 2、利用溶解度差異的純化方法利用蛋白質(zhì)溶解度的差別來分離純化蛋白質(zhì)是實(shí)踐中最常用的方法。1） 等電點(diǎn)沉淀和 pH控制2） 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析3） 有機(jī)溶劑分級(jí)分離4） 溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 1）等電點(diǎn)沉淀和 pH控制蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷pH、離子強(qiáng)度對b-乳球蛋白溶解度的影響基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，帶電基團(tuán)的電3荷數(shù)量可根據(jù) pH的不同而變化。20 mmol/L當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，相鄰分子間不存在靜電排斥力，分

18、子間容易相互聚集沉淀。因此，在其它條件相同時(shí)，處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)溶解度最低。210 mmol/L15 mmol/L不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，因此，可以通過等電點(diǎn)沉淀的方法將它們分離。1 mmol/L04.85.05.25.45.6pH 2 ）蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析中性鹽對球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。0.60.4鹽溶(salting in)：蛋白質(zhì)分子吸附鹽離子后，帶電層使得蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，而蛋白質(zhì)分子與水之間的相互吸引增加，溶解度提高。0.20.0鹽析(salting out)：溶液的離子強(qiáng)度增加到一定的程度時(shí)，可以使蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來。-0.21.02.0離子強(qiáng)度（I）

19、原因：溶液中的水大部分成為鹽離子的水化水，不再參與蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)溶劑化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水表面暴露，并由于疏水相互作用而沉淀。等電點(diǎn)狀態(tài)下，K2SO4對血紅蛋白溶解度的影響 3 ）有機(jī)溶劑分級(jí)分離與水互溶的有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮等），能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。室溫下，這些溶劑不但可以引起蛋白質(zhì)的沉淀，同時(shí)還伴隨著蛋白質(zhì)的變性。如果預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻到 -40至-60，同時(shí)不斷攪拌以避免局部有機(jī)溶劑濃度過高的現(xiàn)象發(fā)生，則可以在很大的程度上避免蛋白質(zhì)的變性。實(shí)例：用25%的-5乙醇可以將卵清蛋白與卵清中的其他蛋白分開?；驹碛袡C(jī)溶劑可以降低水溶液的介電常數(shù)，從而增加相反電荷之間的吸引力。

20、蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)離子化程度減弱，水化程度降低，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集而導(dǎo)致沉淀。與鹽析相似，有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)直接爭奪水化層，致使蛋白質(zhì)聚集沉淀。 4 ）溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定的溫度范圍內(nèi)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增加。例外人類血紅蛋白的溶解度，在 0 25之間，隨溫度上升而下降。0 40溫度高于40 50，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定，容易發(fā)生變性。低于 0時(shí)，運(yùn)用：在低溫下分離純化蛋白質(zhì)。 3、根據(jù)電荷不同的純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的不同、亦即蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)的不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法可以分為兩類：1）電泳2）離子交換層析 電泳的原理在一定pH條件下，某些物

21、質(zhì)分子會(huì)成為帶電的粒子，不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，因此可將它們分離。帶電粒子在電場中的移動(dòng)與:粒子大小有關(guān)，顆粒直徑愈小愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快 電泳的分類原則上按電泳的原理來分，可分為二類：Ø自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。Ø區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。

22、區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。 區(qū)帶電泳p濾紙電泳和薄膜電泳（如醋酸纖維素薄膜電泳，聚酰胺薄膜電泳）p粉末電泳：支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉p細(xì)絲電泳：如尼龍絲和其他人造絲電泳。p凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠電泳。 濾紙電泳：指用濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。醋酸纖維素薄膜電泳：分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少，比紙電泳分辨率高。適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。 凝膠電泳+-ABC圖中A，B，C均為陽離子，分子量大小依次為M

23、A=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)共同作用分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖(agarose)是從瓊脂中精制出來的膠狀多糖，瓊脂又是從天然的紅色的墨角藻(red-seaweed)中提取出來的。ü瓊脂糖凝膠屬于大孔膠，可以分析10 的大分子，7但電泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝膠電泳。ü具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，對樣品吸附極??；ü瓊脂糖無毒，具有熱可逆性，膠凝過程不需催化劑

24、，制備簡單、快速。ü瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，染色、脫色程序簡單快速； 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacrylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophorsis，簡稱PAGE)。ü凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好ü凝膠性能穩(wěn)定，電滲作用小，無吸附，化學(xué)惰性強(qiáng)。電泳過程中不受溫度、pH的變化的影響。&#

25、252;集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，具有高分辨率，重復(fù)性好 電泳 2）離子交換層析離子交換層析是利用離子交苯乙烯(單體)+苯二乙烯(交聯(lián)劑)換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同，經(jīng)過交換平衡達(dá)到分離的目的的一種柱層析法。共聚功能基反應(yīng)基質(zhì)H2SO4基質(zhì)(骨架)R SO3 H離子交換樹脂固定離子可交換離子活性基團(tuán)基質(zhì)固定離子可交換離子 按載體種類不同Ø離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂陽離子交換樹脂強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)-N+ (CH)弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)-N(CH)

26、3332Ø離子交換纖維素：陰離子交換纖維素（DEAE-纖維素，陽離子交換纖維素（CM-纖維素）Ø離子交換凝膠：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose） 離子交換反應(yīng)離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要是以離子交換方式進(jìn)行。所進(jìn)行的離子交換反應(yīng)是可逆的。假定以+RX代表陽離子交換劑，在溶液中解離出來的陽離子X 與溶液中的陽離子Y 可發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：+離子交換現(xiàn)象方程式：R-X+ Y+R Y + X- + +R-+: 陽離子交換劑的功能基團(tuán)和載體: 平衡離子XY: 交換離子 離子交換層析的基本步驟平衡裝柱離子交換劑帶

27、上反離子(R-O-X )+上樣樣品（AB+ ，C ，等）與反離子（X ）競爭與電荷基, + 團(tuán)結(jié)合；（結(jié)合力A > B+>Y >C >X ） + + 洗脫洗脫液中的離子成分（Y ）與樣品(A 等）競爭結(jié)合電 荷基團(tuán)，首先C洗下來，隨著Y濃度增加，B洗脫出，最后A出來，使樣品分離。所以從上樣到洗脫都是根據(jù)結(jié)合力的大小進(jìn)行進(jìn)行的。洗脫液的選擇很重要，要使有效成分和雜質(zhì)分離。 4、利用選擇性吸附的純化方法某些固體物質(zhì)具有將其他種類分子吸附在自己表面的能力，被稱為“吸附劑”。吸附過程涉及范德華力、氫鍵等非離子吸引力。吸附層析就是利用待純化的分子與雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力以

28、及解吸附能力的性質(zhì)不同而達(dá)到分離的目的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭等。運(yùn)用實(shí)例1、羥磷灰石層析：用于選擇性除去DNA2、疏水作用層析：高效蛋白質(zhì)分離純化方法利用不同蛋白質(zhì)表面所存在的疏水性氨基酸殘基的數(shù)量的不同。 5、利用對配體的特異生物學(xué)親和力親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識(shí)別能力建立起來的一種有效的純化方法，目前已廣泛應(yīng)用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細(xì)胞起乃至完整細(xì)胞的純化。蛋白質(zhì)混合物瓊脂糖凝膠珠連接臂目的蛋白質(zhì)得到純化配體分子 5、利用對配體的特異生物學(xué)親和力 三、蛋白純化原則Guidelines for Protein PurificationØ

29、確定目標(biāo) purity, activity and quantityØ充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性 to simplify technique selection and optimisationØ確定活性測定方法（enzymatic assays，ligand-bindingassays，immunological assays） fast detection of protein activity/recovery and criticalcontaminantsØ盡量減少純化步驟 extra steps reduce yield and increase time, combine stepslo