FACSCanto流式細(xì)儀原理

1、facscanto流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用 陳清ingbin_bd公司介紹nbd公司是由是由maxwell w. becton和和fairleigh s. dickinson 于于1897年在紐約創(chuàng)立的年在紐約創(chuàng)立的,總部位于美國新澤西州bd公司介紹n位居財富周刊500強(qiáng)的大型跨國公司n產(chǎn)品涵蓋諸多醫(yī)療領(lǐng)域n生物科學(xué)部:流式細(xì)胞儀及應(yīng)用于生物科學(xué)的試劑、耗材bd公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品nfacs vantage se-大型分選機(jī)nfacs aria-高速分選的臺式機(jī)nfacs diva-高速分選的數(shù)字化大型機(jī)bd公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品facscount流式細(xì)胞儀facscalibu

2、r流式細(xì)胞儀facscanto ii流式細(xì)胞儀bd 公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品nbd facscanto ii流式細(xì)胞儀facscanto ii流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀可告訴我們一個細(xì)胞的什么指標(biāo)?n細(xì)胞的相對大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘枺琭sc）n細(xì)胞的相對顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（側(cè)向散射光信號，ssc）n相關(guān)的熒光強(qiáng)度散射光信號的特征nfsc和sscn當(dāng)顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（fsc）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號（ssc）。n488nm激光激發(fā)產(chǎn)生散射光前向角散射光信號前向角散射光信號fsc側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號ssc散射光信

3、號的特征n紅細(xì)胞裂解的全血熒光信號的特征n什么是熒光信號n當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，染料吸收光子躍遷到高能級，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。熒光信號的特征n發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與結(jié)合的位點成正比信號產(chǎn)生n熒光信號熒光信號的特征n常見熒光染料的發(fā)射波長直方圖顯示熒光信號點圖顯示熒光信號什么是流式細(xì)胞儀？n在流動的狀態(tài)中檢測細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器；injector tipsheath fluid流式細(xì)胞儀特點及檢測標(biāo)本n特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；n可檢測的樣本種類多樣n(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實

4、體組織，培養(yǎng)細(xì)胞n(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液facscanto ii流式細(xì)胞儀系統(tǒng)組成n流式細(xì)胞儀n液流車n工作站facscanto簡介n配置空冷激光n兩根激光:488nm、633nm、n光路固定，無需調(diào)校n液流系統(tǒng)n信號檢測系統(tǒng)n八角形和三角形光學(xué)收集系統(tǒng)，將光信號轉(zhuǎn)換成電信號n電子系統(tǒng)將電信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字化信號液流系統(tǒng)n流動室n鞘液n工作液，可選pbs、血球稀釋液或蒸餾水。n樣本流n單細(xì)胞懸液，濃度51051 106/ml液流系統(tǒng)n鞘液是壓力驅(qū)動的。在壓力作用下，鞘液經(jīng)過濾器進(jìn)入流動室下部的小室中。n檢測的樣本在壓力的作用下，也進(jìn)入流動室下部的小室中，樣本壓力略大于鞘液的壓力。n

5、在鞘液的包裹下，樣本由下向上通過流動室，經(jīng)激光激發(fā)后，樣本中的顆粒被檢測。液流系統(tǒng) -flow cell(流動室)injector tip熒光信號聚焦的激光光束鞘液鞘液液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)-樣本流速樣本流速的選擇n高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.n低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如dna分析。光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)n染色的細(xì)胞或其他顆粒通過聚焦的激光束時，會散射激光或熒光。因為激光束是一個小斑點，顆?？焖偻ㄟ^流動室，散射光或熒光持續(xù)的時間非常短-只有幾微秒。這些短暫的光信號被收集、過濾然后被檢測器轉(zhuǎn)換成電信號。信號采集系統(tǒng)n激光n488nm，633nm，n激發(fā)樣本中

6、的顆?；蚣?xì)胞產(chǎn)生散射光信號和熒光信號n信號檢測組件-八角形和三角形n光學(xué)濾片n將激光激發(fā)后產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號引導(dǎo)至相應(yīng)的pmtnpmt-將光信號轉(zhuǎn)換成電信號常用熒光染料的特性常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(nm) 用途 顏色fitc 488 525 免疫熒光 綠色pe(rd1) 488 575 免疫熒光 橙色 percp 488 670 免疫熒光 深紅apc 633 670 免疫熒光 紅色pi 488 620 dna染色 橙紅ecd 488 620 免疫熒光 橙紅pecy5 488 675 免疫熒光 紅 常用熒光染料(488nm,633nm激發(fā))nfluore

7、scein isothiocyanate (fitc)n異硫氰酸熒光素nphycoerythrin (pe)n藻紅素nallophycocyanin (apc)n異藻藍(lán)蛋白nperidinin-chlorophyll protein (percp)n多甲藻黃素-葉綠素蛋白ntandem dyesnpe-texas red (ecd)npe-cy5 (pc5)npe-cy5.5 (pc5.5) (futures)npe-cy7 (pc7) (futures)facscanto信號檢測組件n種類n八角形n三角形n構(gòu)成n檢測器n濾片facscanto信號檢測組件n八角形檢測組件facscanto信號

8、檢測組件n三角形檢測組件facscanto信號檢測組件n檢測器n鞘液流中的顆粒通過激光束時會產(chǎn)生光信號，光信號到達(dá)檢測器生成電脈沖信號，電子系統(tǒng)對電脈沖信號進(jìn)一步處理。nfacscanto 兩類檢測器n光電二極管：fscn光電倍增管pmt：ssc和熒光信號facscanto信號檢測組件n光學(xué)濾片用于調(diào)整光譜的分布。n當(dāng)光子遇到濾片時，光子或通過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。facscanto的濾片n長通濾片（lp）：長于設(shè)定波長的光通過，并反射短于設(shè)定波長的光facscanto的濾片n帶通濾片：允許一定帶寬波長的光通過。facscanto的濾片facscanto的濾片facscanto電子

9、系統(tǒng)n將與電脈沖信號 強(qiáng)弱相關(guān)的電壓 數(shù)字化n有三類電脈沖信號n高度信號hn面積信號an寬度信號w幾個概念n信號放大npmt將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整pmt的電壓，信號強(qiáng)度將隨之改變。n閾值n信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。幾個概念n顏色補(bǔ)償n采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時，都需要作顏色補(bǔ)償。顏色補(bǔ)償nfitc主要由fitc的檢測器檢測，但部分光也會進(jìn)入pe檢測器幾個概念n顏色補(bǔ)償n帶通濾片接受的是一定帶寬波長的熒光，故會有干擾光同時被接收，然后一同進(jìn)

10、入pmt進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換并放大。幾個概念n顏色補(bǔ)償n通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的x%補(bǔ)償模型圖補(bǔ)償模型圖顏色補(bǔ)償判斷標(biāo)準(zhǔn) n未作顏色補(bǔ)償顏色補(bǔ)償判斷標(biāo)準(zhǔn) n補(bǔ)償后怎樣進(jìn)行顏色補(bǔ)償ncomp beadsn用于流式細(xì)胞儀多色分析時調(diào)整熒光補(bǔ)償。含兩種微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白鏈的微球，可與小鼠/大鼠免疫球蛋白的鏈結(jié)合；及陰性對照微球，不與免疫球蛋白結(jié)合。這兩種微球與鼠源性的熒光抗體混合時，顯示為清晰的陽性群與陰性群（背景熒光），可據(jù)此手動調(diào)整顏色補(bǔ)償。 nanti-mouse ig補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552843nanti-rat ig補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552844nanti-rat/h

11、amsterig補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552845儀器運作需要的質(zhì)控品n儀器校準(zhǔn)需要微球nbd facs 7-color setup beads（cat no.335775）n補(bǔ)償調(diào)整需要微球nbd compbeads anti-mouse ig, (cat no.552843)nbd compbeads anti-rat ig, (cat no.552844)n儀器清潔nbd facsrinsen漂白水流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀可以告訴我們什么？細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)生了什么事件？流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用n細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞膜表面標(biāo)記n胞內(nèi)標(biāo)記n細(xì)胞周期分析n凋亡分析n分選ncba細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞相

12、對大小和顆粒性n胞內(nèi)ph值檢測nca+流動性檢測n膜電勢檢測n細(xì)胞活性檢測n細(xì)胞活力(增殖能力)的檢測細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞相對大小和顆粒性分析細(xì)胞生理學(xué)研究n胞內(nèi)ph值的檢測細(xì)胞生理學(xué)研究nca2+流動性檢測nca2+ 是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)ca2+濃度會發(fā)生改變。n最常用的染料nindo-1 excited at uvnfluo-3 excited at 488nmnfura red excited at 488nm細(xì)胞生理學(xué)研究nca2+流動性檢測細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞膜電位的改變n超極化的細(xì)胞攝取更多的染料，細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度增大；

13、細(xì)胞去極化時，染料釋放到細(xì)胞外，總的熒光強(qiáng)度減少。n染料和試劑ndioc6(3) dioc5(3) dioc1(3) dioc1(5) valinomycin gramicidin d cccp細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞膜電位的改變細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞活性分析 fluorescein diacetate進(jìn)入活細(xì)胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細(xì)胞會發(fā)綠色熒光細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞活力分析ncfse (carboxyfluorescein succinimidyl ester) 是一種親脂性染料，可被細(xì)胞膜吸收。細(xì)胞標(biāo)記cfse后再誘導(dǎo)增殖，分裂后的細(xì)胞將含半量的cfse，如此可監(jiān)控細(xì)胞分裂的數(shù)目

14、。細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞活力分析n上圖中人t細(xì)胞被標(biāo)記并刺激后，可跟蹤六代的分裂。如果配合使用modfit軟件分析，可確定每代的細(xì)胞數(shù)。cd # = cluster designation number細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記 胞內(nèi)多種肽類已被成功標(biāo)記，包括病毒顆粒、免疫球蛋白、雌激素受體、細(xì)胞因子、特殊蛋白如bcl-2和cyclooxygenase.n胞內(nèi)細(xì)胞因子n磷酸化蛋白 細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記n胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記n磷酸化蛋白n接受刺激后細(xì)胞的動態(tài)反應(yīng)n刺激因子對特異位點的作用n檢測轉(zhuǎn)錄后調(diào)控n特殊蛋白在正常及異常細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記n磷酸化蛋白relative cell numberalexa fluor 488controlifn-g g stimulated (1000 u/