間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)--來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)

1、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 1. 間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)2. 干細(xì)胞應(yīng)用與干細(xì)胞調(diào)控。3. 間充質(zhì)干細(xì)胞MSC生長(zhǎng)過(guò)程4. 間充質(zhì)干細(xì)胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境5. 細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇6. 如何選用細(xì)胞培養(yǎng)基7. 如何維持培養(yǎng)液 p H8. 血清與干細(xì)胞的培養(yǎng)9. 胎牛血清（F B S ）是否需要滅活10. 細(xì)胞的細(xì)菌、真菌污染及排除11. 細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防12. 使用胰蛋白酶時(shí)加入 E DTA的目的是什么13. 膠原酶的種類和選型14. 膠原酶 V S胰酶15. 干細(xì)胞的種類和表面標(biāo)記16. 間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)原理概述17. 間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化18. 干細(xì)胞老化的表現(xiàn)和處理19.

2、細(xì)胞傳代消化過(guò)程指導(dǎo)20. 冷凍保護(hù)劑作用和選擇21. 細(xì)胞凍存指導(dǎo)22. 干細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇23. 移植細(xì)胞的基因修飾1間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長(zhǎng)特征，可分為貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長(zhǎng)。間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)：形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出23 厘米個(gè)長(zhǎng)短不同的突起?？煽吹郊?xì)胞成螺旋狀生長(zhǎng)。 2干細(xì)胞應(yīng)用與干細(xì)胞調(diào)控干細(xì)胞的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。 

3、2.1內(nèi)源性調(diào)控干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子可對(duì)外界信號(hào)起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞不對(duì)稱分裂的蛋白，控制基因表達(dá)的核因子等。另外，干細(xì)胞在終末分化之前所進(jìn)行的分裂次數(shù)也受到細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子的制約。（1）胞內(nèi)蛋白對(duì)干細(xì)胞分裂的調(diào)控干細(xì)胞分裂可能產(chǎn)生新的干細(xì)胞或分化的功能細(xì)胞。這種分化的不對(duì)稱是由于細(xì)胞本身成分的不均等分配和周圍環(huán)境的作用造成的。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分對(duì)細(xì)胞的發(fā)育非常重要。如在果蠅卵巢中，調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的是一種稱為收縮體的細(xì)胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位，從而把維持干細(xì)胞性狀所必需的成分保留

4、在子代干細(xì)胞中。（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在脊椎動(dòng)物中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。比如在胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4 是必需的。Oct4 是一種哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因產(chǎn)物是FGF-4 等生長(zhǎng)因子，能夠通過(guò)生長(zhǎng)因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周圍滋養(yǎng)層的進(jìn)一步分化。Oct4 缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)。另外白血病抑制因子（LIF）對(duì)培養(yǎng)的小鼠ES 細(xì)胞的自我更新有促進(jìn)作用，而對(duì)人的成體干細(xì)胞無(wú)作用，說(shuō)明不同種屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)上皮干細(xì)胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是W

5、nt 信號(hào)通路的中間介質(zhì)，當(dāng)與-Catenin 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，促使角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)并分化為毛囊。 2.2外源性調(diào)控除內(nèi)源性調(diào)控外，干細(xì)胞的分化還可受到其周圍組織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響。（1）分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活。有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGF家族和Wnt 信號(hào)通路。比如TGF 家族中至少有兩個(gè)成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化。最近研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）不僅能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活和分化，還對(duì)精原細(xì)胞的再生和分化有決定作用。GDNF 缺失的小鼠表現(xiàn)為干細(xì)胞數(shù)量的減少，而

6、GDNF的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致未分化的精原細(xì)胞的累積。Wnts 的作用機(jī)制是通過(guò)阻止-Catenin 分解從而激活Tcf/Lef 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)干細(xì)胞的分化。比如在線蟲(chóng)卵裂球的分裂中，鄰近細(xì)胞誘導(dǎo)的Wnt 信號(hào)通路能夠控制紡錘體的起始點(diǎn)和內(nèi)胚層的分化。（2）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用有些信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。-Catenin 就是一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配體Delta 或Jagged 也對(duì)干細(xì)胞分化有重要影響。在果蠅的感覺(jué)器官前體細(xì)胞，脊椎動(dòng)物的胚胎及成年組織包括視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、骨骼肌和血液系統(tǒng)中，Notch 信號(hào)都起著非常重要的作用。當(dāng)N

7、otch 與其配體結(jié)合時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖；當(dāng)Notch 活性被抑制時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞。（3）整合素（Integrin）與細(xì)胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。比如當(dāng)1整合素喪失功能時(shí)，上皮干細(xì)胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細(xì)胞。此外細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)1整合素的表達(dá)和激活，從而影響干細(xì)胞的分布和分化方向。 2.3干細(xì)胞的可塑性越來(lái)越多的證據(jù)表明，當(dāng)成體干細(xì)胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性。通常情況下，供體的干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來(lái)源一致的細(xì)胞。而在某些情

8、況下干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律。1999 年 Goodell 等人分離出小鼠的肌肉干細(xì)胞，體外培養(yǎng)5 天后，與少量的骨髓間質(zhì)細(xì)胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血細(xì)胞系。這種現(xiàn)象被稱為干細(xì)胞的橫向分化（trans-differentiation ）。關(guān)于橫向分化的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為干細(xì)胞的分化與微環(huán)境密切相關(guān)?？赡艿臋C(jī)制是，干細(xì)胞進(jìn)入新的微環(huán)境后，對(duì)分化信號(hào)的反應(yīng)受到周圍正在進(jìn)行分化的細(xì)胞的影響，從而對(duì)新的微環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號(hào)做出反應(yīng)。 3間充質(zhì)干細(xì)胞MSC生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期指數(shù)增生期停滯期（1）潛伏期(latent phase) 細(xì)胞接

9、種后,先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形，然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24-96 小時(shí)或更長(zhǎng), 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24 小時(shí)。 （2）指數(shù)增生期(logarithmic growth phase) 這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分

10、裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI ）表示，即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5% ，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)35。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力最好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的最好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù) 35 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動(dòng)

11、和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。 （3）停滯期(Stagnate phase) 細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會(huì)停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺(tái)期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會(huì)因培

12、養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會(huì)脫落，嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時(shí)傳代。 4間充質(zhì)干細(xì)胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境干細(xì)胞相關(guān)的培養(yǎng)液都必須在 5 CO2 的氣體環(huán)境中培養(yǎng)使用。否則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH 值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH 為7.2-7.

13、4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。一般情況下，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。 5細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇細(xì)胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U 型和V 型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根據(jù)材質(zhì)的不同有Terasaki 板和普通細(xì)胞培養(yǎng)板。具體選擇時(shí)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型、所需培養(yǎng)體積及不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?#160;（1）平底和圓底（U 型和V 型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇 不同形狀的培養(yǎng)板有不同用途。培養(yǎng)細(xì)胞，通常是選用平底的，這樣便于鏡下觀測(cè)、有明確的底面積、細(xì)胞培養(yǎng)液面高度相對(duì)一致。因此做MTT 等實(shí)驗(yàn)時(shí)，無(wú)論是貼

14、壁和懸浮細(xì)胞，一般選用平底板。測(cè)吸光值一定要使用平底的培養(yǎng)板。要特別注意材質(zhì)，標(biāo)示“Tissue Culture (TC) Treated”是養(yǎng)細(xì)胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時(shí)才使用。如在免疫學(xué)方面，當(dāng)做兩種不同淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，需要二者相互接觸刺激，這時(shí)一般會(huì)選用U 型板，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)由于重力的作用而聚集在很小的范圍內(nèi)內(nèi)。圓底培養(yǎng)板還會(huì)用于同位素?fù)饺氲膶?shí)驗(yàn)，需要用細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞的培養(yǎng)，如“混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)”等。V型板常用做細(xì)胞殺傷、免疫學(xué)血凝集實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞殺傷這種實(shí)驗(yàn)也可用U 型板替代（加入細(xì)胞后，低速離心)。  （2）Terasaki 板和普通細(xì)胞培養(yǎng)板的區(qū)別

15、Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計(jì)便于對(duì)晶體的觀察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種 sitting 和 handing drop 兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)與伸展。當(dāng)然還有浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)材料，同時(shí)還有l(wèi)ow binding surface  （3）細(xì)胞培養(yǎng)板與酶標(biāo)板的區(qū)別 酶標(biāo)板一般要比細(xì)胞培養(yǎng)板貴，細(xì)胞板主要做細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用來(lái)測(cè)蛋白濃度；酶標(biāo)板包括包被板和反應(yīng)板，一般不用做細(xì)胞培養(yǎng)，它主

16、要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測(cè)，需要更高的要求和特定的酶標(biāo)工作液。 （4 ）常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量 不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在23mm 范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量（參考下表）。若加液量過(guò)多會(huì)影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動(dòng)過(guò)程中易溢出造成污染。具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握。                     

17、;                                                  

18、;         常用的培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)器皿 底面積（cm2） 加培養(yǎng)液量（mL） 可獲細(xì)胞量96 孔培養(yǎng)板 0.32 0.1 10524 孔培養(yǎng)板 2 1.0 5×10512 孔培養(yǎng)板 4.5 2.0 1066 孔培養(yǎng)板 9.6 2.5 2.5×1064 孔培養(yǎng)板 28 5.0 7×1063.5cm 培養(yǎng)皿 8 3.0 2.0×1066cm 培養(yǎng)皿 21 5.0 5.2×1069cm 培養(yǎng)皿 49 10.0 12.2×10610cm 培養(yǎng)皿 5

19、5 10.0 13.7×10625cm 塑料培養(yǎng)瓶 25 5.0 5.2×10675cm 塑料培養(yǎng)瓶 75 1530 2×10725cm 玻璃培養(yǎng)瓶 19 4.0 3×106100cm 玻璃培養(yǎng)瓶 37.5 10.0 6×106250cm 玻璃培養(yǎng)瓶 78 15.0 2×1072500cm 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 700 100250 2.5×108注：各種單層生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)，主要取決于器皿底表面積和細(xì)胞體積的大小。上表以293 細(xì)胞為例給出的可獲細(xì)胞量?jī)H作參考。  6如何選用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生

20、存和生長(zhǎng)的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)最重要的條件。細(xì)胞培養(yǎng)基大致有：  （1）合成培養(yǎng)基 主要成分為：氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、輔助物質(zhì)（核酸降解物、氧化還原劑等）。常用的有：199細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種。 1950年由Morgan 等設(shè)計(jì)，除BSS 外，含有53 種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細(xì)胞培養(yǎng)、病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)等。 199 （HB）細(xì)胞培養(yǎng)基，主要應(yīng)用于Vero 細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。BME細(xì)胞培養(yǎng)基?；A(chǔ)Eagle 培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 設(shè)

21、計(jì)，BSS12 種氨基酸谷氨酰胺8種維生素。簡(jiǎn)單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM 等。MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。低限量Eagle 培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細(xì)胞單層生長(zhǎng)，是一種最基本、適用范圍最廣的培養(yǎng)基，是一種被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要注意的是，MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基有含 Earle's 平衡鹽的類型，也有含 Hanks'平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過(guò)濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產(chǎn)和科研時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況

22、注意選擇合適的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，因MEM 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分所限，針對(duì)生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，并不一定是使用效果最佳或者最經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。細(xì)胞生長(zhǎng)快。附著稍差的腫瘤細(xì)胞、克隆培養(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和DNA 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)。例如CHO 細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO 細(xì)胞表達(dá)EPO。 IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基。 IMDM 是由Iscove's 改良的Eagle 培養(yǎng)基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量?？捎糜陔s

23、交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，以及無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，BSS21種氨基酸維生素11 種等，廣泛適于許多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，也用做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 Fischers細(xì)胞培養(yǎng)基。用于白血病微粒細(xì)胞培養(yǎng)。 HamF10、F12 細(xì)胞培養(yǎng)基。 1963 年、1969 年由Ham 設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞，F(xiàn)12 適用于CHO 細(xì)胞。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基。 DMEM 和F12 細(xì)胞培養(yǎng)基按照

24、 1:1 比例混合效果最佳，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無(wú)血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。  （2）低血清細(xì)胞培養(yǎng)基 主要應(yīng)用于VERO 細(xì)胞、BHK21 細(xì)胞等細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶、微載體反應(yīng)器中的培養(yǎng)。 （3）無(wú)血清培養(yǎng)基 是設(shè)計(jì)用來(lái)在無(wú)血清條件下促使特殊類型的細(xì)胞生長(zhǎng)或進(jìn)行專門應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長(zhǎng)因子和或細(xì)胞因子，含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。  （4）替代天然培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。面對(duì)如此多的細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基的選用，建議：可以查閱相關(guān)文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢選用最適合細(xì)胞株的培養(yǎng)基，或

25、購(gòu)買相配套的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。 許多培養(yǎng)基都適合多種細(xì)胞株的培養(yǎng)，可以采用現(xiàn)有的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。結(jié)合細(xì)胞特性及培養(yǎng)基的培養(yǎng)效能，用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、克隆形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基。 注：目前也有不少商業(yè)化的msc培養(yǎng)基，如百恩維的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（低血清） 7如何維持培養(yǎng)液 p H配好的培養(yǎng)液變堿（變紫紅）是正常的現(xiàn)象。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿?，培養(yǎng)液中的

26、HCO3 -被漸漸耗掉，培養(yǎng)液的pH值也逐漸升高，變成了紫紅色。如果培養(yǎng)基pH值偏堿的程度不大，可將裝培養(yǎng)液的瓶口擰松，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中一段時(shí)間，讓培養(yǎng)箱中的CO2進(jìn)入培養(yǎng)液，pH值就可以糾正。如果pH值偏離的程度很大，可以通過(guò)添加少量無(wú)菌的H Cl 或者NaOH調(diào)節(jié)pH，便可以使用。將配制好的培養(yǎng)基小劑量分裝，可以避免反復(fù)開(kāi)蓋引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同時(shí)因NaHCO3遇熱不穩(wěn)定，會(huì)分解釋放出CO2 ，而使培養(yǎng)基的pH升高，偏堿。因此在配置使用培養(yǎng)的過(guò)程中應(yīng)注意： （1）動(dòng)作迅速，不可使培養(yǎng)液長(zhǎng)時(shí)間處于較高室溫下； （2）配置過(guò)程中，混勻時(shí)切不可加熱?；靹蚝髴?yīng)立即放入4&#

27、176;C 冰箱，待過(guò)濾時(shí)再取出； （3）使用完畢應(yīng)盡快將瓶口封好，放于4°C 冰箱保存。通過(guò)在培養(yǎng)液中同時(shí)添加Hepes 也可以有效的穩(wěn)定pH 值。Hepes （羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液,它在pH 7.27.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。其最大優(yōu)點(diǎn)是在開(kāi)放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH 值。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。該緩沖液使用的終濃度為1050mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/L Hepes 便可達(dá)到緩沖能力。Hepes 的使用方法有以下兩種：（1）Hepes 可按所需的濃度直接加入到配制的培

28、養(yǎng)液中，再過(guò)濾除菌。每1000ml 培養(yǎng)液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 調(diào)pH 至7.2，過(guò)濾除菌后使用。此時(shí)HEPES 的使用濃度為10 mmol/L。（2）配成 100x 貯存液（1 mol/L），使用前取 99mL 培養(yǎng)液加入 lmL 貯存液，最終應(yīng)用濃度仍為 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 貯存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 雙蒸水中，用1N NaOH 調(diào)pH 至7.58.0，然后用水定容至100mL，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2mL/瓶），4或-20保存。 8血清與干細(xì)胞的培養(yǎng)干細(xì)胞在體內(nèi)存在的量很少，處在一

29、個(gè)個(gè)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的“niche”中，所以一旦完成分離進(jìn)入體外環(huán)境，最重要的就是保證細(xì)胞的活力不受影響，那么就必須提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。這些環(huán)境就是靠培養(yǎng)基和培養(yǎng)箱來(lái)提供了。培養(yǎng)液中最重要的莫過(guò)-血清，特別是對(duì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)。所以為了最優(yōu)的干細(xì)胞培養(yǎng)效果，推薦選用對(duì)應(yīng)的干細(xì)胞專用血清。牛血清是最常用的，但是根據(jù)血清的來(lái)源不同又可以分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24 小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生1030 天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少，所以也成為了干細(xì)胞培養(yǎng)的首選。 培

30、養(yǎng)中如何正確的使用血清？避免不好的影響呢？血清的濃度：對(duì)大部分的干細(xì)胞，最佳的血清濃度是10%。過(guò)高的血清濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，如果是需要高濃度的血清，培養(yǎng)的時(shí)間也不能超過(guò)兩周，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化能力下降。過(guò)低的血清會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度下降。血清的溶解：必須在 4進(jìn)行，最好過(guò)夜溶解。這樣可以減少沉淀的產(chǎn)生，避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流式。同時(shí)也要避免血清的過(guò)濾，如果需要過(guò)濾可以和培養(yǎng)基一起過(guò)濾。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出

31、來(lái)的血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不同批次的血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。注意以下幾點(diǎn)：（1）需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20或-80低溫冰箱中。4冰箱中保存時(shí)間切勿超過(guò)1 個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約10，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽?。?）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 或 -

32、80 低溫冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20 進(jìn)入37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。影響使用效果！（3）熱滅活是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement ）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用, 促

33、進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。（4 ）切勿將血清在 37放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破壞而影響血清質(zhì)量。（5）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 9胎牛血清（F B S ）是否需要滅活滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒害作用。胎牛血清（FBS

34、）對(duì)許多細(xì)胞系均有促生長(zhǎng)作用，主要適用于細(xì)胞株的保藏及特殊用途的細(xì)胞株的體外培養(yǎng)。胎牛血清是取自剖腹產(chǎn)的胎牛。因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的成分最少，質(zhì)量是最高的。所以不必要滅活。 10細(xì)胞的細(xì)菌、真菌污染及排除真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見(jiàn)于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可

35、見(jiàn)到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米（m）計(jì)。常見(jiàn)的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見(jiàn)。一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)

36、液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取 10ml 細(xì)胞懸液以 100rpm 離心5min，沉淀中加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37培養(yǎng)，24h 可得結(jié)果。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗， 最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。細(xì)菌和真菌污染多在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且由于增生迅速，多再發(fā)生污染48h以內(nèi)就已明顯。在實(shí)驗(yàn)的最初兩天密切觀察實(shí)驗(yàn)樣品是否有污染發(fā)生，有利于及時(shí)采取措施予以補(bǔ)救或排除。培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；有細(xì)胞

37、株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室和二氧化碳培養(yǎng)箱(若發(fā)現(xiàn)真菌污染，可在污染孔內(nèi)加入1mol/L氫氧化鈉或硫酸銅 11細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防溶液處理（具體操作方法可參考細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防），復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采用510 倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用2448h，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能奏效。細(xì)胞培養(yǎng)中常用的抗生素及用量見(jiàn)下表。                &#

38、160;                                                 &#

39、160;    常用抗生素用量和效應(yīng) 抗生素 抗菌譜 濃度（量/mL）        細(xì)菌 真菌 支原體 青霉素 G+ 1001000g鏈霉素 G- 1001000g慶大霉素 G+ /G- + 50200g四環(huán)素 G+ /G- + 1050g卡那霉素 G+ /G- + 1001000g兩性霉素 + 常用2g/mL制霉菌素 + 常用25g/mL+表示效應(yīng)程度 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗

40、生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 （1）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 （2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。 （3）每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 （4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度23 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞23 代。（5）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 （6）重復(fù)步驟4

41、。 （7）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)46 代，確定污染是否以已被消除。 12使用胰蛋白酶時(shí)加入 E DTA的目的是什么體外培養(yǎng)的細(xì)胞受到嚴(yán)重污染時(shí)，有時(shí)即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵。只有將預(yù)防措施貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。 一般預(yù)防可從以下幾方面著手： （1）添加抗生素 各種抗生素性質(zhì)不同，對(duì)各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好（但迄今尚無(wú)對(duì)抗支原體特效抗生素）。但反復(fù)使用抗生素會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)細(xì)胞本身也有一定影響，因此為避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素，或盡可能不用

42、抗生素處理。（2）從物品、用品消毒滅菌著手 細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在取樣檢菌一周后確認(rèn)無(wú)菌才能使用。同時(shí)，在無(wú)菌過(guò)濾操作中，隨著濾過(guò)體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇最后過(guò)濾的液體進(jìn)行檢測(cè)。定期對(duì)二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養(yǎng)箱后，使用可移動(dòng)的紫外燈至少消毒30min，加入高壓滅菌過(guò)的超純水于培養(yǎng)箱水槽中保持濕度。也可配制300ml 的飽和硫酸銅加3L 滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。 （3）從操作者做起 進(jìn)無(wú)菌室前要徹底洗手，按規(guī)定穿隔離衣。開(kāi)始操作前要用 75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。 操作者動(dòng)作要輕，安裝

43、吸管帽、打開(kāi)或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長(zhǎng)時(shí)間燒灼，以防退火；燒過(guò)的器械要冷卻后才能使用；已吸過(guò)培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液成分如蛋白質(zhì)等燒焦后會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時(shí)會(huì)將其帶到培養(yǎng)液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細(xì)胞培養(yǎng)用品過(guò)火焰是也不能時(shí)間太長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)塑料細(xì)胞培養(yǎng)用品也會(huì)產(chǎn)生變形影響使用。使用培養(yǎng)液前不宜過(guò)早開(kāi)瓶，開(kāi)瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細(xì)菌的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前勿過(guò)早暴露在空氣中。 操作時(shí)盡量不要談話，咳嗽以防止來(lái)自唾沫和呼出的

44、氣流所造成的污染。 吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)專管專用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。操作完畢后應(yīng)整理好工作臺(tái)面，用消毒水浸泡的紗布擦拭臺(tái)面。（4）防止細(xì)胞交叉污染 所有從別處轉(zhuǎn)來(lái)的或是自己所建的細(xì)胞系都要早期留有的充足的凍存儲(chǔ)備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細(xì)胞遺傳物發(fā)生改變，可以復(fù)蘇早期凍存的細(xì)胞使用。重要細(xì)胞系（株）的傳代工作應(yīng)由兩人獨(dú)立進(jìn)行。（5）無(wú)菌室的徹底消毒新潔爾滅全面徹底擦洗無(wú)菌室。使用前應(yīng)稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是便宜，因?yàn)樾聺崰枩?500ml只需5元，而且可以稀釋50

45、倍用，而同樣量的酒精價(jià)格可能是新潔爾滅的幾十倍。甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對(duì)各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價(jià)廉，熏蒸消毒時(shí)不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含3740%的甲醛。 13膠原酶的種類和選型在細(xì)胞的取材中，各種消化酶經(jīng)常用于組織的分散，在組織中取得目的細(xì)胞。例如脂肪間質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs ）、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)等。其中膠原酶是最常用的一種。種類：I-IV 型選擇：結(jié)締組織I，III 型；骨組織、脂肪組織I 型；軟骨組織II 型；胰島細(xì)胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增強(qiáng)膠原酶的消化能力，對(duì)細(xì)胞損傷最小。

46、0;14膠原酶 V S胰酶胰蛋白酶（Trypsin ），簡(jiǎn)稱胰酶，可使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而達(dá)到細(xì)胞離散的目的，是目前應(yīng)用最為廣泛的消化劑，主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織（如胚胎、上皮、羊膜、肝、腎等軟組織）及傳代細(xì)胞的消化，但對(duì)于纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見(jiàn)有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.10.25%濃度，常用0.25%，特別敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、溫度、胰酶的濃度、組織塊的大小

47、和硬度有關(guān)。胰酶作用及溶解的最佳pH 是89，配制胰酶溶液可將液體調(diào)至pH8 左右，充分溶解，過(guò)濾除菌，過(guò)濾后再調(diào)至pH7.4 左右。胰酶作用的最適溫度為37，在夏季室溫25以上對(duì)一般傳代細(xì)胞也能達(dá)到消化效果。一般新鮮配制的胰酶消化能力較強(qiáng)。消化時(shí)間要根據(jù)不同的情況而定，胰酶對(duì)細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，溫度低，組織塊大、胰酶濃度低者，消化時(shí)間長(zhǎng)，反之則相應(yīng)減少時(shí)間。酶的濃度過(guò)大或消化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致消化過(guò)度，對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，被消化掉；消化時(shí)間太短，消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性，也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。影

48、響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或 4保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶進(jìn)行消化時(shí)，可改變不同參數(shù)以確定出最佳消化效果。胰酶的配置方法： （1）稱取胰酶：按胰酶液濃度為0.25 ，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入PBS 或D-hanks 中，低速攪拌34小時(shí)或者置于 4過(guò)夜混勻（低速很重要，機(jī)械攪拌對(duì)酶是一種沖擊，如果起沫嚴(yán)重，有可能導(dǎo)致酶的變性）。（0）調(diào)節(jié)pH 值為7.4 左右。用注射濾器過(guò)濾除菌，因蛋白制劑不宜4長(zhǎng)期保存，忌反復(fù)凍融，建議分裝成小瓶（離心管）于-20

49、凍存或置4保存?zhèn)溆?。注意事?xiàng)：是否需要4放置過(guò)夜，取決于胰酶的純度。過(guò)去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要4過(guò)夜。而現(xiàn)在的胰酶純度都很高，就沒(méi)有必要4過(guò)夜。從理論上來(lái)說(shuō)，4放置過(guò)夜，給細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，盡管過(guò)濾可以除去細(xì)菌，但除不掉其代謝產(chǎn)物。 如果胰酶不溶、有絮狀物，考慮可能的原因有：胰酶過(guò)期或是已經(jīng)部分變性；溶液 pH 值不對(duì)；在沒(méi)過(guò)濾之前的絮狀沉淀是正?，F(xiàn)象，因胰酶多取自動(dòng)物胰腺，沉淀為組織塊，過(guò)濾后即可。Ca2+、Mg2+、血清和蛋白質(zhì)對(duì)胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、這些離子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 來(lái)配制。正是這個(gè)道理，開(kāi)始消化前，需用PBS

50、 將培養(yǎng)液沖洗干凈后方加入胰酶進(jìn)行消化，否則會(huì)大大影響胰酶的作用效果。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，將胰酶與EDTA （乙二胺四乙酸）混合來(lái)進(jìn)行消化。EDTA 可通過(guò)結(jié)合（螯合）細(xì)胞間質(zhì)中的二價(jià)陽(yáng)離子從而破壞細(xì)胞連接從而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，終止消化后，需用培養(yǎng)液或PBS 徹底沖洗培養(yǎng)瓶（板），使得更好的再次利用培養(yǎng)瓶（板），否則再培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞容易脫壁。 EDTA在常溫下難溶于酸，微溶于水（20時(shí)溶解度只有 0.02g ），但在堿性溶液中溶解性較大。因此為了更

51、快的溶解 EDTA 可采取調(diào)節(jié) PH或者是加熱的辦法。但須注意：由于胰酶不耐高溫，因此待EDTA溶解后，溫度有所下降才能加入胰酶。如果是單獨(dú)配置 EDTA 溶液，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。膠原酶（collagenase ）是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果較差，這時(shí)可采用膠原酶解離細(xì)胞法。膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml （約為1mg/mL ）或0

52、.03%0.3%。膠原酶分為、型以及肝細(xì)胞專用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。具體可見(jiàn)膠原酶的種類和選型。膠原酶消化緩和、無(wú)須機(jī)械振蕩，因而可進(jìn)一步提高細(xì)胞成活率，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。膠原酶的配置膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲(chǔ)藏。關(guān)于胰蛋白酶配置方法可見(jiàn)：胰蛋白酶消化法。注意：因?yàn)樾湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。鈣、鎂離子和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，因而可用 BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培養(yǎng)液配制。 膠原酶的使用： （1）將漂洗、修剪干凈的組織剪成12mm3左右小塊（2）將組織

53、塊放入離心管（三角燒瓶）中加入3050 倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 （3）將燒瓶放入37水浴或者37孵箱內(nèi)，每隔3min 振搖一次，如能放在37的恒溫震蕩水浴箱中則更好。消化時(shí)間與組織的類別很有關(guān)系，對(duì)于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織，消化時(shí)間448h，對(duì)于容易消化的組織可以采用37震蕩消化 1545min，也可以根據(jù)具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可以認(rèn)為已消化充分。上皮組織經(jīng)膠原酶消化后，由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性，可能仍有一些細(xì)胞團(tuán)未完全分散，但成團(tuán)的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此，如無(wú)特殊需要可以不必再進(jìn)一步處理。

54、 （4）收集消化液（有時(shí)含個(gè)別組織塊及沒(méi)有充分消化的組織碎屑則需用 100 目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者無(wú)血清培養(yǎng)液離心漂洗12 次，去除上清，加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。 膠原酶Vs 胰蛋白酶 胰蛋白酶和膠原酶消化時(shí)間與濃度上的差異，依消化溫度而異。另外這兩種酶也可混合應(yīng)用，濃度為：胰蛋白酶0.1mg+膠原酶0.25mg/mL。兩酶相比的差別見(jiàn)表1 和表2。               

55、;                                         表1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 項(xiàng)目 胰蛋白酶 膠原酶消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的

56、組織用量 0.01%0.5% 0.10.3 mg/mL（200 U/mL）消化時(shí)間 0.5 2h 1 12hpH 89 6.57.0作用強(qiáng)度 強(qiáng)烈 緩和細(xì)胞影響 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響 無(wú)大影響血清抑活 有 無(wú)Ca2+和Mg2+ 有影響 無(wú)影響                             表2 胰蛋白酶和

57、膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊（0.51cm3 ）時(shí)所需時(shí)間（h） 酶種類和用量 較硬組織 軟組織        4 室溫 37 4 室溫 37胰蛋白酶（0.25%） 2448 16 12 1224 12 0.51膠原酶（1200 U/mL） 24 6 0.5 12 3 0.25胰蛋白酶（0.25%）+膠原酶（200 U/mL） 1246 1224 412 1224 612 12 15干細(xì)胞的種類和表面標(biāo)記通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、

58、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干細(xì)胞，骨髓中絕大多數(shù)是HSC，BMSC 只占骨髓有核細(xì)胞的0.001%0.01% 。因此鑒定BMSC 的方法是在骨髓的干細(xì)胞中排除HSCBMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。 16間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)原理概述間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可分化成多種組織細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。間質(zhì)干細(xì)胞最早是從骨髓中分離得到的，正常情況

59、下，它在骨髓中的比例非常低，僅占單核細(xì)胞的1/105 1/104 。骨髓中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.0751.090 g/ml，血小板為1.0301.035 g/ml。為此利用一種密度介于1.0751.092 g/ml之間而近于等滲的溶液（分層液）進(jìn)行密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。在骨髓的原代培養(yǎng)物中，除了貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)干細(xì)胞外，還混雜著一些巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、

60、造血細(xì)胞及紅細(xì)胞等，要得到較均一的間質(zhì)干細(xì)胞，必須除去其他細(xì)胞。根據(jù)其他細(xì)胞的特性，可采用不同的方式排除它們。對(duì)于紅細(xì)胞，因其不貼壁，可通過(guò)換液除去。對(duì)于貼壁的單核巨噬細(xì)胞，可根據(jù)其黏附能力的不同，通過(guò)調(diào)整Trypsin/EDTA 的消化時(shí)間，保證間質(zhì)干細(xì)胞在短暫的作用時(shí)間內(nèi)與塑料培養(yǎng)瓶壁分離，而巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等仍貼附于培養(yǎng)瓶壁，從而使間質(zhì)干細(xì)胞與其他的貼壁細(xì)胞得到分離。在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí)，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過(guò)程中，若細(xì)胞

61、過(guò)度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時(shí)傳代。 17間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細(xì)胞的一種重要的方法，也是最常用、報(bào)道見(jiàn)得最多的方法。成骨最常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)最常用是Oil Red O （油紅O）染色法。下面我介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。 茜素紅染色方法和原理：成骨誘導(dǎo)的過(guò)程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來(lái)，這就是我們常說(shuō)的“鈣結(jié)節(jié)”。鑒定鈣結(jié)節(jié)的染色方法常用“茜素紅”。 步驟： （1）吸去誘導(dǎo)液，再PBS 洗一到兩次；（2）加入10中性甲醛，固定30min-60min；（3）吸去固定液，加入0.1%的

62、茜素紅染色液，染色6-10min；（4）用PBS 洗兩次，去處殘留的染色液；（5）加入PBS，完成染色； 茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫氧化鈉后則變成藍(lán)紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。 Oil Red O（油紅O）染色的方法和原理：成脂肪誘導(dǎo)的過(guò)程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個(gè)細(xì)胞的胞漿中都是油滴。Oil Red O染色的方法是對(duì)油滴的染色的一種方法。 步驟：