細(xì)胞培養(yǎng)過程中的遺傳變異

1、細(xì)胞培養(yǎng)過程中的遺傳變異細(xì)胞培養(yǎng)過程中的遺傳變異 離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn) 體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ) 體細(xì)胞突變體誘導(dǎo)與篩選的方法體細(xì)胞突變體誘導(dǎo)與篩選的方法遺傳與變異特點(diǎn)遺傳與變異特點(diǎn) 離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性 離體培養(yǎng)下的變異離體培養(yǎng)下的變異 影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性 離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂，有離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂，有絲分裂的絲分裂的dna半保留復(fù)制和染色體的均半保留復(fù)制和染色體的均等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物

2、在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。 離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個(gè)方離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個(gè)方面是即使發(fā)生某些變異，只需根據(jù)需要面是即使發(fā)生某些變異，只需根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式進(jìn)行離體繁殖，即選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式進(jìn)行離體繁殖，即可淘汰或選擇變異、或分離純合體。可淘汰或選擇變異、或分離純合體。離體培養(yǎng)下的變異特點(diǎn)離體培養(yǎng)下的變異特點(diǎn) 普遍性：普遍性： 變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類型中；各種培養(yǎng)植物中變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類型中；各種培養(yǎng)植物中 局限性：局限性： 從表型上看，在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)從表型上看，在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)胞變異主要是植株形態(tài)（株高

3、、葉形、葉色等）、胞變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異。生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異。 從生理生化特性上看，容易出現(xiàn)同功酶譜、次生從生理生化特性上看，容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長(zhǎng)等變異。代謝的消長(zhǎng)等變異。 嵌合性：嵌合性： 嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞。同的細(xì)胞。 嵌合體可以以不同倍性的形式存在，必須分離培嵌合體可以以不同倍性的形式存在，必須分離培養(yǎng)才能純化。養(yǎng)才能純化。離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率植物種類植物種類再生植株來源再生植株來源變異頻率變

4、異頻率(%)煙草煙草體細(xì)胞愈傷組織體細(xì)胞愈傷組織10水稻水稻胚愈傷組織胚愈傷組織71.9甘蔗甘蔗幼葉愈傷組織幼葉愈傷組織18玉米玉米體細(xì)胞愈傷組織體細(xì)胞愈傷組織14大麥大麥花粉植株花粉植株1015馬鈴薯馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體葉肉原生質(zhì)體100菠蘿菠蘿頂芽愈傷組織頂芽愈傷組織7腋芽愈傷組織腋芽愈傷組織34幼果愈傷組織幼果愈傷組織100離體培養(yǎng)變異的影響因素離體培養(yǎng)變異的影響因素 供體植物供體植物 遺傳背景遺傳背景倍性水平，二倍體比單倍體穩(wěn)定倍性水平，二倍體比單倍體穩(wěn)定基因型基因型 生理狀態(tài)生理狀態(tài)來源于莖尖的愈傷組織的來源于莖尖的愈傷組織的dna含量及染色含量及染色體數(shù)的穩(wěn)定性好于來源于薄壁細(xì)胞的體

5、數(shù)的穩(wěn)定性好于來源于薄壁細(xì)胞的 繼代培養(yǎng)的次數(shù)繼代培養(yǎng)的次數(shù) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式1.8亞二倍體是指正常的亞二倍體是指正常的46條染色體丟失一個(gè)或多個(gè)染色體條染色體丟失一個(gè)或多個(gè)染色體 繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異概率越高繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異概率越高 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式 不同的激素濃度可以有選擇地誘導(dǎo)不同倍不同的激素濃度可以有選擇地誘導(dǎo)不同倍性的細(xì)胞的分裂。性的細(xì)胞的分裂。 豌豆，低濃度豌豆，低濃度2,4-d(0.25 mg/l)多倍體多倍體 高濃度高濃度2,4-d(20 mg/l)二倍體二倍體 激素除了引起染色體倍性的增加外，在一激素除了引起染色體倍性的增加外，在一些培

6、養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。 蠶豆，無激素多倍體發(fā)生頻率蠶豆，無激素多倍體發(fā)生頻率6.31% 10naa，2.5kt-單倍體單倍體13.3 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會(huì)引起培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會(huì)引起細(xì)胞的變異。一般來講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞的變異。一般來講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ) 遺傳學(xué)基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ) dna在核內(nèi)重復(fù)復(fù)制同源多倍體在核內(nèi)重復(fù)復(fù)制同源多倍體培養(yǎng)天數(shù)培養(yǎng)天數(shù)不同不同dna值細(xì)胞比例（）值細(xì)胞比例（）2c2c4c8c088.311.7580.716

7、.82.5134.879.56.69.1179.781.57.90.9硬粒小麥中胚軸培養(yǎng)中硬粒小麥中胚軸培養(yǎng)中dnadna值的變化值的變化體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ) 遺傳學(xué)基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ) 染色體斷裂與重組非整倍體、四倍體染色體斷裂與重組非整倍體、四倍體 產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異的一般不能正常生長(zhǎng)產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異的一般不能正常生長(zhǎng) 染色體畸變中出現(xiàn)的雙著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期染色體畸變中出現(xiàn)的雙著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期如不能被拉斷，就會(huì)在兩核之間形成染色體橋，出現(xiàn)如不能被拉斷，就會(huì)在兩核之間形成染色體橋，出現(xiàn)四倍體。四倍體。 體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ) 遺傳學(xué)基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ) 非正常有

8、絲分裂非整倍體非正常有絲分裂非整倍體體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ) 分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)分子遺傳學(xué)基礎(chǔ) 堿基突變堿基突變 dna序列的選擇性擴(kuò)增與丟失序列的選擇性擴(kuò)增與丟失 抗除草劑草甘磷，抗除草劑草甘磷，3-烯醇丙酮酸莽草酸烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸合成酶磷酸合成酶 轉(zhuǎn)座子活化轉(zhuǎn)座子活化 dna甲基化甲基化突變突變的類型及應(yīng)用的類型及應(yīng)用 自發(fā)突變自發(fā)突變(spontaneous mutation) 離體培養(yǎng)再生植株的自發(fā)變異比自然條件離體培養(yǎng)再生植株的自發(fā)變異比自然條件下的變異高得多，一般可高出幾百倍下的變異高得多，一般可高出幾百倍 誘導(dǎo)突變誘導(dǎo)突變(induced mutation) 物理誘

9、變物理誘變 化學(xué)誘變化學(xué)誘變 復(fù)合因子誘變復(fù)合因子誘變 轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變誘變劑誘變劑物理誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑x,x,射線及紫外線射線及紫外線堿基類似物堿基類似物誘發(fā)染色體誘發(fā)染色體斷裂的物質(zhì)斷裂的物質(zhì)烷化劑烷化劑dnadna復(fù)制中，復(fù)制中，“以假以假亂真亂真”，如，如5-5-溴尿嘧溴尿嘧啶啶(bu)(bu)、2-2-氨基嘌呤氨基嘌呤等等帶有不穩(wěn)定烷基，帶有不穩(wěn)定烷基，能改變能改變dnadna的化學(xué)結(jié)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。甲基磺酸乙酯構(gòu)。甲基磺酸乙酯馬來酰肼馬來酰肼 絲裂霉素絲裂霉素轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變 轉(zhuǎn)座子體系轉(zhuǎn)座子體系-玉米的玉米的ac/ds系統(tǒng)系統(tǒng) ac（act

10、ivation，意為活化）。相當(dāng)于一個(gè)顯，意為活化）。相當(dāng)于一個(gè)顯性因子性因子,它位于它位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,ac與與ds （dissociation，意為離異）隔開一段距離，意為離異）隔開一段距離,但但卻能遙控指揮卻能遙控指揮ds( (ds是不穩(wěn)定的，它可以從染是不穩(wěn)定的，它可以從染色體的一個(gè)位點(diǎn)跳到另一個(gè)位點(diǎn)色體的一個(gè)位點(diǎn)跳到另一個(gè)位點(diǎn)) ) 轉(zhuǎn)座子作用：既可直接將外源基因帶入細(xì)胞轉(zhuǎn)座子作用：既可直接將外源基因帶入細(xì)胞內(nèi)獲得新性狀，又可以獨(dú)立插入通過其轉(zhuǎn)座內(nèi)獲得新性狀，又可以獨(dú)立插入通過其轉(zhuǎn)座功能誘導(dǎo)變異。功能誘導(dǎo)變異。轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變 操作過程操作過程 采用基因

11、轉(zhuǎn)化的方法將采用基因轉(zhuǎn)化的方法將ac/ds導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞 通過體細(xì)胞培養(yǎng)或再生植株的自交或側(cè)交使通過體細(xì)胞培養(yǎng)或再生植株的自交或側(cè)交使ac因子切除，由于轉(zhuǎn)座子插入的隨機(jī)性，因子切除，由于轉(zhuǎn)座子插入的隨機(jī)性，即可在切除即可在切除ac的植株中篩選出不同變異。的植株中篩選出不同變異。 成果：已在苜蓿（顏色改變）、馬鈴薯、成果：已在苜蓿（顏色改變）、馬鈴薯、番茄、甘藍(lán)等多種植物上獲得可利用的體番茄、甘藍(lán)等多種植物上獲得可利用的體細(xì)胞變異植株。細(xì)胞變異植株。突變體的應(yīng)用突變體的應(yīng)用 創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種 在全世界在全世界50多個(gè)國(guó)家中，已培育出多個(gè)國(guó)

12、家中，已培育出1000多個(gè)由多個(gè)由直接突變獲得的或由這些突變體雜交而衍生的直接突變獲得的或由這些突變體雜交而衍生的品種品種 通過體細(xì)胞誘變選育的谷類作物品種中，品質(zhì)通過體細(xì)胞誘變選育的谷類作物品種中，品質(zhì)得到不同程度改良的占得到不同程度改良的占34.3。 抗病，占誘變品種的抗病，占誘變品種的1/4 耐鹽耐鹽 抗除草劑抗除草劑 耐寒耐寒 耐旱耐旱突變體的應(yīng)用突變體的應(yīng)用 遺傳研究遺傳研究 用于基因功能鑒定用于基因功能鑒定 突變突變dna序列用于分子標(biāo)記序列用于分子標(biāo)記 發(fā)育生物學(xué)研究發(fā)育生物學(xué)研究 用于建立器官發(fā)育模式用于建立器官發(fā)育模式 分析鑒定一些基因的表達(dá)與植物發(fā)育的關(guān)分析鑒定一些基因的表

13、達(dá)與植物發(fā)育的關(guān)系系 在煙草、玉米中均通過質(zhì)體突變體分離鑒定了在煙草、玉米中均通過質(zhì)體突變體分離鑒定了與植物葉綠體發(fā)育的基因與植物葉綠體發(fā)育的基因突變體的應(yīng)用突變體的應(yīng)用 生化代謝途徑研究生化代謝途徑研究 根據(jù)需要建立某一代謝途徑中每一個(gè)調(diào)節(jié)根據(jù)需要建立某一代謝途徑中每一個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)的突變體。點(diǎn)的突變體。 煙草硝酸還原酶缺失突變體煙草硝酸還原酶缺失突變體cnx和和nia具有實(shí)用性的突變體具有實(shí)用性的突變體類類 型型應(yīng)應(yīng) 用用抗氨基酸及類似物突變體抗氨基酸及類似物突變體 高賴氨酸水稻突變體高賴氨酸水稻突變體抗病突變體抗病突變體煙草抗野火病突變體煙草抗野火病突變體抗除草劑突變體抗除草劑突變體煙草抗煙草

14、抗“毒莠定毒莠定”突變體突變體耐鹽突變體耐鹽突變體煙草已選擇出抗鹽突變體煙草已選擇出抗鹽突變體（1%2%nacl) )抗金屬離子突變體抗金屬離子突變體抗汞、銅、鋁抗汞、銅、鋁抗逆突變體抗逆突變體抗旱、抗低溫抗旱、抗低溫營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體銀杏賴氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型銀杏賴氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體篩選突變體篩選方法方法直接選擇法直接選擇法間接選擇法間接選擇法綠島法綠島法正選擇法正選擇法負(fù)選擇法負(fù)選擇法直接選擇法直接選擇法 正選擇法：正選擇法： 用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在其上用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在其上只有突變的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，非突變細(xì)胞不能只有突變的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，非突變細(xì)胞不能生

15、長(zhǎng)，從而直接篩選出突變體的辦法。生長(zhǎng)，從而直接篩選出突變體的辦法。 小麥幼胚愈傷組織小麥幼胚愈傷組織-1.4%nacl n6培養(yǎng)基培養(yǎng)基小麥耐鹽系。小麥耐鹽系。 900個(gè)甘薯胚性細(xì)胞系個(gè)甘薯胚性細(xì)胞系-射線射線-2.0%nacl=22個(gè)抗鹽愈傷組織個(gè)抗鹽愈傷組織直接選擇法直接選擇法 負(fù)選擇法（富集選擇法，又稱濃縮法負(fù)選擇法（富集選擇法，又稱濃縮法 ）：）： 在特定培養(yǎng)基中，讓正常細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，在特定培養(yǎng)基中，讓正常細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，突變體細(xì)胞受抑制不分裂呈休眠狀態(tài)，突變體細(xì)胞受抑制不分裂呈休眠狀態(tài)， 然后用一種能毒害正常生長(zhǎng)細(xì)胞，而對(duì)休然后用一種能毒害正常生長(zhǎng)細(xì)胞，而對(duì)休眠細(xì)胞無害的藥物淘汰正常細(xì)

16、胞，眠細(xì)胞無害的藥物淘汰正常細(xì)胞， 再用正常培養(yǎng)基恢復(fù)突變體生長(zhǎng)。再用正常培養(yǎng)基恢復(fù)突變體生長(zhǎng)。 該方法主要應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體篩選。該方法主要應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體篩選。間接選擇法間接選擇法 間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法。性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法。 當(dāng)缺乏直接選擇表型指標(biāo)或直接選擇條件對(duì)當(dāng)缺乏直接選擇表型指標(biāo)或直接選擇條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利時(shí)，可考慮采用間接篩選法細(xì)胞生長(zhǎng)不利時(shí)，可考慮采用間接篩選法 如脯氨酸（如脯氨酸（pro）錦橙珠心懸浮細(xì)胞錦橙珠心懸浮細(xì)胞-射線射線-高濃度高濃度pro細(xì)細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)pro含量提高

17、一倍耐寒愈傷及植株。含量提高一倍耐寒愈傷及植株。 抗病突變體的篩選也常常用間接篩選的策略?？共⊥蛔凅w的篩選也常常用間接篩選的策略。綠綠 島島 法法 綠島法是利用已分化組織進(jìn)行篩選和鑒定的綠島法是利用已分化組織進(jìn)行篩選和鑒定的方法。方法。 對(duì)于抗病毒突變體、抗除草劑突變體的篩選，對(duì)于抗病毒突變體、抗除草劑突變體的篩選，可以采用可以采用“綠島法綠島法”。 這種方法最早用于抗除草劑，葉片大面積枯這種方法最早用于抗除草劑，葉片大面積枯黃，僅有少量抗除草劑突變細(xì)胞組織仍保持黃，僅有少量抗除草劑突變細(xì)胞組織仍保持綠色，取這部分材料則成為很小的綠島，因綠色，取這部分材料則成為很小的綠島，因而形象地稱之為而形

18、象地稱之為“綠島法綠島法”。 單倍體煙草植株單倍體煙草植株- -射線射線-除草劑除草劑-葉片部葉片部分變黃分變黃-取出綠色部分取出綠色部分-愈傷組織愈傷組織=耐除草劑耐除草劑的單倍體植株的單倍體植株=二倍體二倍體 突變體篩選程序突變體篩選程序預(yù)預(yù) 處處 理理預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)（懸浮或平板）（懸浮或平板）誘發(fā)突變誘發(fā)突變（平板培養(yǎng)）（平板培養(yǎng)）高抗高產(chǎn)細(xì)胞株選擇高抗高產(chǎn)細(xì)胞株選擇（平板培養(yǎng)）（平板培養(yǎng)）愈傷組織增殖愈傷組織增殖或再生植株或再生植株突變體鑒定突變體鑒定小結(jié)小結(jié) 離體培養(yǎng)中體細(xì)胞變異發(fā)生是普遍的，離體培養(yǎng)中體細(xì)胞變異發(fā)生是普遍的，但具有局限性，變異的程度可以通過培但具有局限性，變異的程度可以通過培養(yǎng)類型和條件進(jìn)行控制。養(yǎng)類型和條件進(jìn)行控制。 體細(xì)胞變異可自發(fā)產(chǎn)生也可通過理化因體細(xì)胞變異可自發(fā)產(chǎn)生也可通過理化因子誘導(dǎo)產(chǎn)生