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1、第八章第八章dna或蛋白質(zhì)的化學(xué)修或蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾與基因表達(dá)飾與基因表達(dá) 一、一、 dna甲基化與基因表達(dá)甲基化與基因表達(dá) 二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 三、三、 基因重排的分子機(jī)制基因重排的分子機(jī)制 一、一、 dna甲基化與基因表達(dá)甲基化與基因表達(dá) dna甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一,可能存在于所有高等生物中。dna甲基化能關(guān)閉某些基因的活性,去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。 1dna甲基化的主要形式甲基化的主要形式 5-甲基胞嘧啶,n6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥(niǎo)嘌呤。在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在cpg和cpxpg中,原核生物中cca/tgg和ga
2、tc也常被甲基化。 真核生物細(xì)胞內(nèi)存在兩種甲基化酶活性:一種被稱為日常型(mainte-nance)甲基轉(zhuǎn)移酶,另一種是 從頭合成(denovo synthesis)甲基轉(zhuǎn)移酶。前者主要在甲基化母鏈(模板鏈)指導(dǎo)下使處于半甲基化的dna雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化。日常型甲基轉(zhuǎn)移酶常常與dna內(nèi)切酶活性相耦聯(lián),有3種類型。ii類酶活性包括內(nèi)切酶和甲基化酶兩種成分,而i類和iii類都是雙功能酶,既能將半甲基化dna甲基化,又能降解外源無(wú)甲基化dna。 由于甲基化胞嘧啶極易在進(jìn)化中丟失,所以,高等真核生物中cg序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其理論值。哺乳類基因組中約存在4萬(wàn)個(gè)cg islands,大多
3、位于轉(zhuǎn)錄單元的5區(qū)。 沒(méi)有甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用,就可能被氧化成為u,被dna修復(fù)系統(tǒng)所識(shí)別和切除,恢復(fù)成c。已經(jīng)甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用, 它就變?yōu)閠, 無(wú)法被區(qū)分。因此, cpg序列極易丟失。 2甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域dna構(gòu)象變化,從而影響了蛋白質(zhì)與dna的相互作用,抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)dna的結(jié)合效率。 對(duì)弱啟動(dòng)子來(lái)說(shuō),少量甲基化就能使其完全失去轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)這類啟動(dòng)子被增強(qiáng)時(shí),即使不去甲基化也可以恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性。甲基化密度較高時(shí),即使增強(qiáng)后的啟動(dòng)子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。 因?yàn)榧谆瘜?duì)轉(zhuǎn)錄的抑制強(qiáng)度與mecp1(methylcpg-bin
4、ding protein1)結(jié)合dna的能力成正相關(guān),甲基化cpg的密度和啟動(dòng)子強(qiáng)度之間的平衡決定了該啟動(dòng)子是否具有轉(zhuǎn)錄活性。dna甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制直接參與了發(fā)育調(diào)控。隨著個(gè)體發(fā)育,當(dāng)需要某些基因保持沉默時(shí),它們將迅速被甲基化,若需要恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性,則去甲基化。i dna甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的直接機(jī)制某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含有cpg序列,甲基化以后直接影響了蛋白質(zhì)因子的結(jié)合活性,不能起始基因轉(zhuǎn)錄。ii. 甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的間接機(jī)制cpg甲基化,通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象或者通過(guò)與甲基化cpg結(jié)合的蛋白因子間接影響轉(zhuǎn)錄因子與dna的結(jié)合。 與不含甲基化的染色質(zhì)相比,甲基化后染色質(zhì)對(duì)于核酸酶或限制性內(nèi)
5、切酶的敏感度下降,更容易與組蛋白h1相結(jié)合,說(shuō)明甲基化與非甲基化dna在構(gòu)象上有差異。已經(jīng)分離純化了數(shù)個(gè)與甲基化dna特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。mecp1可以與至少12個(gè)對(duì)稱的甲基化cpg結(jié)合,而mecp2僅同單個(gè)甲基化的cpg序列結(jié)合。 3dna甲基化與甲基化與x染色體失活染色體失活 雌性胎生哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中兩條x染色體之一在發(fā)育早期隨機(jī)失活,以確保其與只有一條x染色體的雄性個(gè)體內(nèi)x染色體基因的劑量相同。一旦發(fā)生x染色體失活,使該細(xì)胞有絲分裂所產(chǎn)生的后代都保持同一條x染色體失活。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn),在x染色體上存在一個(gè)與x染色體失活有密切聯(lián)系的核心部位稱為x染色體失活中心(x-chromosome ina
6、ctivation center,xic),定位在xq13區(qū)(正好是barr氏小體濃縮部位)。 xi-specific transcript (xist)基因只在失活的x染色體上表達(dá),其產(chǎn)物是一功能性rna,沒(méi)有orf卻含有大量的終止密碼子。實(shí)驗(yàn)證明,xist rna分子能可能與xic位點(diǎn)相互作用,引起后者構(gòu)象變化,易于結(jié)合各種蛋白因子,最終導(dǎo)致x染色體失活。二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)是指通過(guò)酶促反應(yīng)把磷酸基團(tuán)從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物上的過(guò)程,是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式,在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過(guò)程中占有極其重要的地位。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)有
7、多達(dá)2000個(gè)左右的蛋白質(zhì)激酶和1000個(gè)左右的蛋白質(zhì)磷酸酶基因。蛋白質(zhì)的磷酸化是指由蛋白質(zhì)激酶催化的把a(bǔ)tp或gtp上位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過(guò)程,其逆轉(zhuǎn)過(guò)程是由蛋白質(zhì)磷酸酶催化的,稱為蛋白質(zhì)脫磷酸化。 1 蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(1). 在胞內(nèi)介導(dǎo)胞外信號(hào)時(shí)具有專一應(yīng)答特點(diǎn)。與信號(hào)傳遞有關(guān)的蛋白激酶類主要受控于胞內(nèi)信使,如camp,ca2+,dg(二酰甘油,diacyl glycerol)等,這種共價(jià)修飾調(diào)節(jié)方式顯然比變構(gòu)調(diào)節(jié)較少受胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響。 (2).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化控制了細(xì)胞內(nèi)已有的酶“活性”。與酶的重新合成
8、及分解相比,這種方式能對(duì)外界刺激做出更迅速的反應(yīng)。(3).對(duì)外界信號(hào)具有級(jí)聯(lián)放大作用;(4).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化保證了細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的持續(xù)反應(yīng)。被磷酸化的主要氨基酸殘基:絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。組氨酸和賴氨酸殘基也可能被磷酸化。2. 真核細(xì)胞主要跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑真核細(xì)胞主要跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 3. 蛋白激酶的種類與功能蛋白激酶的種類與功能 根據(jù)底物蛋白質(zhì)被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類: 第一類為絲氨酸/蘇氨酸型。這類蛋白激酶使底物蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化第二類為酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸殘基。第三類是雙重底物特異性蛋白激酶(dual-specificity prot
9、ein kinase),既可使絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化又可使酪氨酸殘基磷酸化。 根據(jù)是否有調(diào)節(jié)物來(lái)分又可分成兩大類: 信使依賴性蛋白質(zhì)激酶(messenger-dependent protein kinase),包括胞內(nèi)第二信使或調(diào)節(jié)因子依賴性蛋白激酶及激素(生長(zhǎng)因子)依賴性激酶兩個(gè)亞類; 非信使依賴型蛋白激酶。4. 受受camp調(diào)控的調(diào)控的a激酶激酶 被a激酶磷酸化的蛋白質(zhì)其n端上游往往存在兩個(gè)或兩個(gè)以上堿性氨基酸,特異氨基酸的磷酸化(x-arg-arg-x-ser-x)改變了這一蛋白的酶活性。這一酶活性代表了絕大多數(shù)細(xì)胞中camp所引起的全部反應(yīng)。pka全酶由4個(gè)亞基組成(r2c2)包括兩
10、個(gè)相同的調(diào)節(jié)亞基(r)和兩個(gè)相同的催化亞基(c)。全酶的分子量為150-170kd。 c亞基具有催化活性,r亞基具有調(diào)節(jié)功能,有兩個(gè)camp結(jié)合位點(diǎn)。r亞基對(duì)c亞基具有抑制作用,所以,r和c聚合后的全酶(r2c2)無(wú)催化活性。r亞基與camp的結(jié)合導(dǎo)致c亞基解離并表現(xiàn)出催化活性。 激素與其受體在肌肉細(xì)胞外表面相結(jié)合,誘發(fā)細(xì)胞質(zhì)camp的合成并活化a激酶,再將活化磷酸基團(tuán)傳遞給無(wú)活性的磷酸化酶激酶,活化糖原磷酸化酶,最終將糖原磷酸化,進(jìn)入糖酵解并提供atp。5. c激酶與激酶與pip2、ip3和和dag 磷酸肌醇級(jí)聯(lián)放大的細(xì)胞內(nèi)信使是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(pip2)的兩個(gè)酶解 產(chǎn)物:肌醇1
11、,4,5-三磷酸(ip3)和二?;视停╠ag)。c激酶(pkc)是依賴于ca2+的蛋白質(zhì)激酶。由于ip3所引起的細(xì)胞質(zhì)ca2+濃度升高,導(dǎo)致c激酶從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靠原生質(zhì)膜內(nèi)側(cè)處,并被dag和ca2+的雙重影響所激活。 c激酶的活性也受磷脂酰絲氨酸的影響,原因是后者大大提高了c激酶對(duì)于ca2+的親和力,從而使得c激酶能被生理水平的ca2+離子所活化。c激酶主要實(shí)施對(duì)絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化,它具有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)域。6. cam激酶及激酶及map激酶激酶 ca2+的細(xì)胞學(xué)功能主要通過(guò)鈣調(diào)蛋白激酶(cam-kinase)來(lái)實(shí)現(xiàn),它們也是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶,但僅應(yīng)答于細(xì)胞內(nèi)ca2+水平。
12、map激酶(mitogen-activated proteinkinase, map-kinase,又稱為extracellular-signal-regulated kinase,erks)活性受許多外源 細(xì)胞生長(zhǎng)、分化因子的誘導(dǎo),也受到酪氨酸蛋白激酶及g蛋白受體系統(tǒng)的調(diào)控。map-激酶的活性取決于該蛋白中僅有一個(gè)氨基酸之隔的酪氨酸、絲氨酸殘基是否都被磷酸化??茖W(xué)家把能同時(shí)催化這兩個(gè)氨基酸殘基磷酸化的酶稱為map-激酶-激酶,它的反應(yīng)底物是map激酶。map-激酶-激酶本身能被map-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活,后者能同時(shí)被c激酶或酪氨酸激酶家族的ras蛋白等激活,從而在信息傳導(dǎo)中發(fā)揮功能
13、。7. 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 對(duì)于許多生長(zhǎng)因子受體的研究表明,跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息傳遞過(guò)程中起著重要作用。表皮生長(zhǎng)因子(egf)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)受體都擁有定位于胞內(nèi)的酪氨酸激酶功能區(qū)域和膜外區(qū)。 具有受體功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, rptk)。包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域:胞外的配體結(jié)合區(qū),細(xì)胞內(nèi)部具有酪氨酸蛋白激酶活性的區(qū)域和連接這兩個(gè)區(qū)域的跨膜結(jié)構(gòu)。胞外配體結(jié)合區(qū):rptk的n端大約500-85
14、0個(gè)氨基酸組成親水性胞外配體結(jié)合區(qū)域,氨基酸序列變化較大,是不同rptk與相應(yīng)配體特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 跨膜結(jié)構(gòu)區(qū):是連接受體細(xì)胞內(nèi)、外兩部分,鑲嵌在細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu),在靠近膜內(nèi)側(cè)c端常常是由堿性氨基酸形成簇狀結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)活性區(qū):保守性較高,由三個(gè)不同的部分組成。與跨膜區(qū)相連的近膜區(qū)包括41-50個(gè)氨基酸,可能是rptk活性的功能的調(diào)節(jié)部位。第二部分為活性位點(diǎn)所在的催化區(qū),其氨基酸組成具有很高的保守性。該區(qū)含有atp結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn),可能是不同類型rptk底物特異性的決定區(qū)域。第三部分是多變的c末端,包括70-200個(gè)氨基酸,主要是由小分子量氨基酸組成的親水性結(jié)構(gòu),具有高度的可塑性。 沒(méi)有
15、cyclin,cdk無(wú)活性。 cyclin的合成和積累。 形成cyclin和cdk復(fù)合物。tyr磷酸化阻礙了atp的結(jié)合,cdk仍然無(wú)活性。 t-環(huán)中的thr被磷酸化,tyr上的磷酸基團(tuán)被去掉,cdk活性大為增強(qiáng)。 cdk使磷酸酯酶磷酸化,進(jìn)一步提高其活性。 cdk使dbrp磷酸化,具有酶活性。 在dbrp的幫助下,泛素連接酶把泛素加到cyclin上。 cyclin被降解,cdk失活。見(jiàn)lehninger, figure 13-33。 cdk通過(guò)蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程控制細(xì)胞分裂。沒(méi)有被磷酸化的prb能與轉(zhuǎn)錄因子e2f相結(jié)合并使后者不能激活一系列與dna合成有關(guān)的酶,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法由g1進(jìn)入s。 er
16、bb原癌基因其實(shí)編碼了一個(gè)突變的egf受體蛋白,它的胞內(nèi)激酶活性區(qū)被永久性激活(相當(dāng)于egf到正常egf受體上)。因此,erbb導(dǎo)致了細(xì)胞的永久型分裂。8. 蛋白磷酸酯酶蛋白磷酸酯酶 ser/thr蛋白磷酸酯酶主要包括:pp-1,pp-2a,pp-2b和pp-2c四類。 pp-1是糖代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶,具有很高的活性,其催化亞基為38kda,可以與其它組分或調(diào)節(jié)亞基組成全酶。pp-2a全酶包括一個(gè)36kda的催化亞基和一個(gè)65kda的調(diào)節(jié)亞基。pp-2b是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一受ca和cam調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶,催化了磷酸化酶激酶亞基的脫磷酸化作用。由61kda的a亞基和16kda的b亞基組成。a為催化
17、亞基。pp-2c的分子量為43-48kda,其活性需要mmol/l水平的mg2+,現(xiàn)對(duì)其參與調(diào)節(jié)的生理過(guò)程知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶(ptp)主要有:胞內(nèi)型,跨膜受體型。兩類ptp的共同點(diǎn)是它們 的催化域中氨基酸順序極為相似,共有240個(gè)氨基酸,內(nèi)含-hcxgxxr(s/t)g-的signature motif。胞內(nèi)型ptp只有一個(gè)催化域。受體型中常有兩個(gè)催化區(qū),其不同類型的胞外結(jié)構(gòu)往往不同。ptp1b(胞內(nèi)型)是一個(gè)37kda的胞內(nèi)酶,在氨基酸水平上與cd45(跨膜受體型)的胞內(nèi)部分有很高的同源性。 cd45是一類在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的,高分子量(150-280kd)跨膜蛋白,具有與受體極為相似的
18、結(jié)構(gòu)特點(diǎn),在免疫t細(xì)胞和b細(xì)胞中含量極高。 9.蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 處于信號(hào)傳遞鏈終端的蛋白質(zhì)磷酸化既能對(duì)許多酶蛋白及生理代謝過(guò)程起直接的調(diào)節(jié)作用,又能通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)基因活性。a. 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子核定位的調(diào)節(jié) sv40抗原未磷酸化時(shí)存在于胞質(zhì),其111和112位殘基被酪蛋白激酶ii(ckii)磷酸化后,其分子內(nèi)的核轉(zhuǎn)位信號(hào)結(jié)構(gòu)域(nuclear transport signal,nts)變構(gòu)而易于進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。 轉(zhuǎn)錄因子swi5只在g1期存在于細(xì)胞核內(nèi),激活核酸內(nèi)切酶基因轉(zhuǎn)錄。在其它時(shí)期則以磷酸化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。cdc2使其核轉(zhuǎn)位信號(hào)結(jié)構(gòu)域附近的3
19、個(gè)ser殘基磷酸化,使之無(wú)法進(jìn)入核內(nèi),失去激活基因轉(zhuǎn)錄功能。 有時(shí)轉(zhuǎn)錄因子上存在一種抑制結(jié)構(gòu)(r),掩蓋了它的nts功能區(qū), 從而不能進(jìn)入核內(nèi);磷酸化使該區(qū)暴露,從而易于進(jìn)入核內(nèi)。有時(shí),非磷酸化狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子與胞質(zhì)錨定或抑制亞基結(jié)合,掩蓋其nts結(jié)構(gòu)使之不能進(jìn)入核內(nèi)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子本身或者其抑制亞基被磷酸化,使nts結(jié)構(gòu)暴露,進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮功能。轉(zhuǎn)錄因子nf-kb常與ikb結(jié)合成復(fù)合體存在于胞質(zhì)中。只有在被各種刺激因子或佛波脂(pkc激活劑)作用后ikb磷酸化并與nf-kb解離,后者才能進(jìn)入核內(nèi)。b. 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子dna結(jié)合活性的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子上的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dbd)或其附近殘基被磷酸化后,由于負(fù)電荷增加而減弱了轉(zhuǎn)錄因子dbd和dna序列的靜電相互作用。 靜止態(tài)細(xì)胞中,ap-1復(fù)合體中轉(zhuǎn)錄因子c-jun dbd附近的3個(gè)氨基酸殘基(thr231,ser243和ser249)被gsk-3和ckii磷酸化,不能與dna結(jié)合。受到生長(zhǎng)因子等刺激
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