2細胞培養(yǎng)技術(shù)每代細胞

1、每代細胞每代細胞每代細胞每代細胞滯留期滯留期 lag phase概述概述 傳代傳代: :恢復(fù)期恢復(fù)期 適應(yīng)期適應(yīng)期 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng): :開始開始時細胞時細胞 必須經(jīng)歷的時期必須經(jīng)歷的時期2 2種情況種情況 分散細胞接種分散細胞接種: :游離游離- - - 吸附吸附- - -潛伏期潛伏期 組織塊組織塊: : 潛伏期潛伏期 滯留期滯留期原因原因: :操作時，細胞表面上與其它細胞及支持物操作時，細胞表面上與其它細胞及支持物 黏附與連接的分子被破壞，細胞受到損傷黏附與連接的分子被破壞，細胞受到損傷 接種接種細胞細胞: : 適應(yīng)，恢復(fù)，積累適應(yīng)，恢復(fù)，積累( (代謝中間產(chǎn)物代謝中間產(chǎn)物) )組織塊組織

2、塊: : 細胞遷移出細胞遷移出一般經(jīng)數(shù)小時一般經(jīng)數(shù)小時- - -幾天幾天滯留期滯留期過程過程: : 游離游離: :懸浮懸浮, ,胞質(zhì)回縮胞質(zhì)回縮, , 全部細胞全部細胞變?yōu)樽優(yōu)閳A球形圓球形 吸附吸附: :貼附底物貼附底物, ,一般一般2424小時內(nèi)小時內(nèi) 貼壁貼壁 潛伏期潛伏期: :可有可有運動活動運動活動, ,基本基本無增殖無增殖, , 少見分裂相少見分裂相 滯留期滯留期影響因素影響因素滯留期的長短與細胞種類、按種的細胞密度、培滯留期的長短與細胞種類、按種的細胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。養(yǎng)條件等因素有關(guān)。1.1.細胞密度細胞密度 接種分散細胞接種分散細胞, ,接種的接種的密度越大密度越大、數(shù)

3、量越多，、數(shù)量越多， 細胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，細胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短潛伏期就短。 相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)， 如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長 滯留期滯留期- -影響因素影響因素2.細胞類型細胞類型傳代傳代培養(yǎng)培養(yǎng)的細胞之滯留期的細胞之滯留期 比原代培養(yǎng)的比原代培養(yǎng)的細胞短細胞短。 單個細胞快單個細胞快, ,細胞大團慢細胞大團慢, ,組織塊慢組織塊慢連續(xù)細胞系連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細胞轉(zhuǎn)化的細胞 比有限細胞系與正常二倍體細胞的比有限細胞系與正常二倍體細胞的短短來源來源 胚胎胚胎組

4、織組織: :短短, , 成體成體: :長長 滯留期滯留期-影響因素影響因素3.細胞機能狀態(tài)細胞機能狀態(tài) 不良者慢不良者慢4.培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 培養(yǎng)液培養(yǎng)液,ph,底物底物 不利不利:污染污染,有毒有毒 指數(shù)生長期指數(shù)生長期 exponential (log) phase概述概述 潛伏期結(jié)束后潛伏期結(jié)束后 即開始指數(shù)生長期，即開始指數(shù)生長期， 或稱或稱對數(shù)生長期對數(shù)生長期。 細胞生長所需細胞生長所需 各種營養(yǎng)條件具備后各種營養(yǎng)條件具備后進入進入特點特點 是細胞是細胞增生最活躍增生最活躍、活力最旺盛活力最旺盛的階段的階段 培養(yǎng)物中培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長細胞數(shù)量呈指數(shù)增長, , 細胞群體均一細胞

5、群體均一 實驗理想實驗理想 判斷判斷細胞生長細胞生長的的指標(biāo)指標(biāo)判斷細胞生長的指標(biāo)判斷細胞生長的指標(biāo)指數(shù)生長期內(nèi)指數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂活動的程度細胞分裂活動的程度(增殖活性增殖活性) 可作為可作為判斷細胞生長判斷細胞生長是否旺盛的重要是否旺盛的重要指標(biāo)指標(biāo)1.1.有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(mi): :培養(yǎng)物中培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占分裂相數(shù)量占 全部細胞數(shù)量的百分比全部細胞數(shù)量的百分比 統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞。個細胞。 一般一般細胞的細胞的mi約為約為0.10.5% 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)物的物的mimi比繼代培養(yǎng)物比繼代培養(yǎng)物低。低。 連續(xù)細胞系連續(xù)細胞系和和腫瘤細胞

6、高腫瘤細胞高，可達可達3%5%。2.2.細胞群體倍增時間細胞群體倍增時間: :培養(yǎng)物中培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間細胞數(shù)量翻倍的平均時間間接反映細胞活力和增殖活動強弱，有間接反映細胞活力和增殖活動強弱，有3.3.mtt法法：反映細胞內(nèi)一種酶活性程度反映細胞內(nèi)一種酶活性程度4.4.標(biāo)記核苷酸標(biāo)記核苷酸(3h-tdr)摻入量：摻入量：反映反映dna合成細胞的增殖活性細胞的增殖活性與細胞種類、供體年齡以及培養(yǎng)與細胞種類、供體年齡以及培養(yǎng)條件等條件等多種因素密切相關(guān)多種因素密切相關(guān)。細胞生長一定階段細胞生長一定階段(指數(shù)生長期一般持續(xù)指數(shù)生長期一般持續(xù)35 d35 d）, ,即可即可長滿培養(yǎng)器皿長滿

7、培養(yǎng)器皿，相互匯合成片相互匯合成片 (鋪滿鋪滿 confluence匯合匯合) 鋪滿：細胞彼此連接成層長滿器皿底壁。鋪滿：細胞彼此連接成層長滿器皿底壁。( (細胞相互之間緊密接細胞相互之間緊密接 觸，所有可供生長的區(qū)域己被利用觸，所有可供生長的區(qū)域己被利用) )。正常細胞正常細胞(非轉(zhuǎn)化細胞非轉(zhuǎn)化細胞)，當(dāng)，當(dāng)細胞相互接觸細胞相互接觸 連接成片連接成片，出現(xiàn)，出現(xiàn)接觸抑制接觸抑制 接觸抑制以后接觸抑制以后，雖然運動受抑制，雖然運動受抑制， 但只要但只要營養(yǎng)成分充足營養(yǎng)成分充足，仍可，仍可短期短期的的分裂增殖分裂增殖 只有當(dāng)只有當(dāng)細胞細胞密度增大密度增大到一定程度，到一定程度， 細胞便細胞便不再

8、分裂增殖不再分裂增殖。 為為密度依賴性密度依賴性細胞細胞生長抑制生長抑制當(dāng)當(dāng)細胞細胞分裂停止分裂停止后，細胞數(shù)量即不再增加后，細胞數(shù)量即不再增加 進入平臺期進入平臺期 平臺期平臺期 plateau (stationary) phase概述概述 細胞細胞鋪滿后鋪滿后再再1-2倍增倍增, , 進入進入 細胞達細胞達飽和密度飽和密度, , 可可存活存活 仍有代謝活動，但仍有代謝活動，但基本不分裂基本不分裂 細胞數(shù)量維持在某一水平上，細胞數(shù)量維持在某一水平上， 生長活動停滯生長活動停滯. . 飽和密度飽和密度：在培養(yǎng)細胞的平臺期，可供細胞：在培養(yǎng)細胞的平臺期，可供細胞 生長的底物面枳己被生長的細胞所占

9、滿，細生長的底物面枳己被生長的細胞所占滿，細 胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。細胞數(shù)目胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。細胞數(shù)目 不再增加時，即達細胞生長的飽和密度不再增加時，即達細胞生長的飽和密度 特點特點 (1)(1)細胞數(shù)量細胞數(shù)量 細胞達細胞達飽和密度飽和密度 密度抑制密度抑制 停止生長原因停止生長原因: : 細胞數(shù)量多、生長細胞數(shù)量多、生長地區(qū)占滿地區(qū)占滿、 營養(yǎng)消耗營養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多廢物積聚漸多 細胞停止生長細胞停止生長。即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，。即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液， 細胞也會變性細胞也會變性, ,從生長基質(zhì)表面脫落、死亡從生長基質(zhì)表面脫落、死亡 唯有唯有進行進行傳代傳代方可緩解方可緩解特點特點 (2)(2)細胞活動小細胞活動小, , 細胞膜的活動小細胞膜的活動小(3)(3)生長組分下降生長組分下降: : 010%(4)(4)及時轉(zhuǎn)代及時轉(zhuǎn)代 若細胞若細胞已中毒已中毒，即使，即使傳代傳代， 也會也會影響下一代細胞影響下一代細胞的功能狀況的功能狀況 培養(yǎng)細胞的生長曲線培養(yǎng)細胞的生長曲線培養(yǎng)細胞都可在培養(yǎng)細胞都可在接種以后接種以后的的不同培養(yǎng)時間