基因與病毒復(fù)制的關(guān)系

1、3.1 引言本實驗所研究的BP基因，選自本實驗室博士所做的口蹄疫病毒急性感染BHK-21細胞和持續(xù)感染BHK-21細胞的基因芯片檢測結(jié)果。張虎博士已在他的畢業(yè)論文中初步驗證了BP基因在口蹄疫病毒持續(xù)性感染（持感細胞）中下調(diào)，急性感染細胞（急感細胞）中上調(diào)，與芯片結(jié)果相符。我們選取BP基因做進一步的深入研究，期望能通過檢測其在持感細胞不同代次中表達量隨病毒變化的情況，闡明口蹄疫病毒持續(xù)感染與細胞共存的關(guān)系，也希望得到該基因影響病毒的復(fù)制和持感穩(wěn)態(tài)的結(jié)果。單細胞實時熒光定量PCR技術(shù)可以在單個細胞中檢測多個基因的表達情況，單細胞水平的檢測可以揭示在群體情況下被平均化掩蓋的關(guān)鍵現(xiàn)象，是目前用于細胞基

2、因轉(zhuǎn)錄譜分析的先進技術(shù)。如有研究報道，通過單細胞轉(zhuǎn)錄譜分析揭示人誘導(dǎo)多能干細胞的異質(zhì)性(Narsinh et al., 2011)，細胞所處的微環(huán)境決定了細胞在病毒感染過程中表現(xiàn)出的異質(zhì)性(Snijder et al., 2009)，這些關(guān)鍵現(xiàn)象都是在群體水平的研究中無法展現(xiàn)出來的問題。而單個細胞中基因表達量的絕對拷貝數(shù)更能真實的反應(yīng)群體細胞之間存在的差異性，而這種差異性在其與病毒或者環(huán)境的相互作用時，是否會提供進化上的優(yōu)勢，也是我們研究持續(xù)感染時所感興趣的科學(xué)問題。3.2 材料和方法3.2.1 材料1病毒與細胞系O型口蹄疫病毒來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。敘利亞倉鼠腎細胞系（BHK-21

3、）來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。持續(xù)感染口蹄疫病毒的BHK-21細胞系（PI）由本實驗室黃璇博士建立并保存。2試劑細胞培養(yǎng)基（MEM），胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自GIBCO公司。胎牛血清購自四季青公司。RNase-free H2O 購自TaKaRa公司。ReverTra Ace® qPCR RT Kit，THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix，THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix均購自TOYOBO公司。細胞總RNA裂解液Trizol購自Invitrogen公司。苯酚，氯仿和乙醇均購自國藥公司。引物，探針合成

4、自Life公司。3.儀器CO2細胞培養(yǎng)箱（2300型）購自Sheldon Manufacturing公司。生物安全柜（ClassBiohazad safty cabinet）購自ESCO公司。程控降溫儀KRYO 560-16購自Planer公司。超低溫-70冰箱和NanoDrop2000c均購自Thermo公司。普通冰箱購自伊萊克斯公司。臺式小型冷凍離心機購自Eppendorf公司。熒光定量PCR儀（CFX96）購自Bio-Rad公司。PCR儀（T-Gradient Thermoblock）購自Biometra公司。毛細管購自南京泉水教學(xué)實驗器材廠。顯微操縱儀、顯微注射儀、拉針器和磨針儀是Na

5、rashige公司的產(chǎn)品。倒置光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司。3.2.2 方法3.2.2.1 TCID50實驗將BHK-21細胞接種于96孔板中，置于37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，匯合度至70%左右即可進行病毒接種。將收集到的持感病毒進行10倍梯度稀釋。棄去96孔板中的上清液，用PBS洗兩次，加入不同稀釋度的病毒液100L，每個稀釋度感染8個復(fù)孔。對照組用100L無血清的MEM代替病毒液，37 5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h，然后補加新鮮的含5%FBS的MEM培養(yǎng)基100L。置于37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況，并做記錄。最后，按照Reed-Muench公式計算

6、TCID50值。3.2.2.2 單細胞的挑取和裂解1.單細胞貯存液的制備在挑取單細胞前，需預(yù)先分好單細胞的儲存液，儲存液的配置比例為5%的RNase抑制劑和95%的RNase-free H2O。將混合好的儲存液分到RNase-free PCR管中，每管5L，一批32個PCR管，放入4冰箱待用。2. 單細胞的挑取所有被挑取的細胞均是在T25瓶中生長至傳代匯合度，去掉培養(yǎng)基加入1mL胰酶消化5min細胞變圓脫落后，向培養(yǎng)瓶中加入9mL10% FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基中和，充分吹散細胞，調(diào)整細胞濃度為104-105個/mL，然后取1mL細胞懸液于直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿中，進行單細胞的挑取。用拉針器和

7、磨針儀制作精細的細胞挑針，通過與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡可直接觀察到待分離的細胞并能隨時監(jiān)控整個分離挑取單細胞的過程，準確快速地獲得所需的單細胞樣品。具體操作步驟是首先將細胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡（balance）旋鈕使提供的平衡壓減?。幢憩F(xiàn)為毛細管向內(nèi)吸液），然后再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿中至液面下，在顯微鏡下挑取單個細胞。吸入一個單細胞后，將帶有單細胞的挑針提起伸入RNase-free PCR管液面下，增大平衡壓，將細胞吹入盛有細胞儲存液的PCR管中，即完成一個細胞的挑取，當完成一批32個細胞的挑取時，一輪單細胞的挑取即完成，需馬上進行后續(xù)處理。3. 單細胞的裂

8、解一批32個細胞的挑取一般控制在30min內(nèi)完成，在此時間內(nèi)細胞能最大限度的維持原狀。首先，將單細胞樣品放入PCR儀中，進行98熱變性處理，使細胞膜破裂，熱處理3min后再浸入液氮速凍3min。然后取出放入37水浴鍋中溶解1min,如此反復(fù)循環(huán)三次。得到的裂解好的單細胞樣品可暫時放置于-80冰箱保存，直至進行后續(xù)熒光定量RT-PCR的檢測。3.2.2.3 單細胞技術(shù)運用于群體細胞的挑取和裂解將單細胞技術(shù)運用于群體細胞的挑取，將細胞貯存液體積等比例放大，即挑取10個細胞到50L貯存液，50個細胞到250L貯存液，貯存液的配置方法如前所述。群體細胞的裂解方法也與單細胞相同。3.2.2.4 群體細胞

9、的相對熒光定量RT-PCR檢測1.逆轉(zhuǎn)錄取1ugRNA加入無RNA酶的PCR管中，補RNase-free H2O至7L。放入PCR儀中，65反應(yīng)5min，然后置于冰上。該步驟可以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，增強逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)效率。然后每管加入反應(yīng)體系：5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L 總體積 10L然后混勻組分放入PCR儀中 37 °C 15 min 進行逆轉(zhuǎn)錄，98 °C 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。最后將cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。2.定量PCR檢測先將cDNA稀釋10倍。在

10、相對熒光定量PCR中，每個樣品的cDNA既要檢測內(nèi)參基因（GAPDH），還要檢測目的基因（BP）。相對定量不需要標曲，只得到目的基因在不同細胞中表達量的相對變化情況。內(nèi)參基因的檢測是為了去除細胞量的影響，在這里需假設(shè)內(nèi)參基因在細胞量一致的情況下，表達量是相同的。不同基因反應(yīng)組分的配比和實驗條件均是相同的。只是在PCR過程中，分別使用各自的引物即可。具體反應(yīng)體系如下：THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix 12.5LForward Primer（25M）0.5LReverse Primer（25M）0.5L cDNA樣品5L RNase-free H20 6.5

11、L總體積 25LPCR反應(yīng)程序為：95 1min95 15s60 1min 讀取熒光值 39cycles60到95每增加0.5反應(yīng)0.05s然后讀取熒光信號。做相對熒光定量PCR時需繪制出每個樣品的溶解曲線來確定樣品是否被專一的擴增。3.2.2.5 單細胞實時熒光定量RT-PCR本實驗采取兩步法，首先將單細胞的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成其cDNA鏈，然后將cDNA稀釋，分成三份分別檢測三個不同基因（GAPDH，BP，F(xiàn)MDV-3D）的表達水平。引入看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為對照基因以確保分離裂解單細胞過程的真實有效。GAPDH和FMDV-3D基因的單細胞熒光定量檢測方法是本實

12、驗室已建立的成熟技術(shù)。檢測GAPDH的引物序列為：上游引物，F(xiàn)P-GAPDH:5-AAGGCCATCACCATCTTCCA-3下游引物，RT-GAPDH: 5-GCCAGTAGACTCCACAACATAC -3熒光探針序列為:Probe-GAPDH:5FAM-AGCGAGATCCCACCAACATCAAATGGG-BHQ1-3擴增子的大小為87bp。檢測FMDV-3D的引物序列為：上游引物，F(xiàn)P-3D： 5-GAACACATTCTTTACACCAGGAT -3下游引物，RT-3D： 5-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG -3熒光探針序列為：Probe-3D：5FAM-ACAAC

13、CTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA -3擴增子的大小為121bp。BP基因的序列相關(guān)信息見2.2.2.4本實驗的第一步逆轉(zhuǎn)錄過程，運用ReverTra Ace® qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對細胞內(nèi)的所有RNA進行無差別的逆轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系和步驟如下：先將含有5L單細胞裂解液的PCR管放入PCR儀中，65反應(yīng)5min，然后置于冰上。該步驟可以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，增強逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)效率。然后每管加入反應(yīng)體系：Nuclease-free H20 2L 5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L

14、總體積 10L混勻組分放入PCR儀中， 37 °C 15 min 進行逆轉(zhuǎn)錄，98 °C 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。最后將cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。第二步qPCR過程是在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀中進行的。樣品cDNA先需加入5L Nuclease-free H20稀釋混勻，標準品為體外克隆得到的質(zhì)粒DNA。具體反應(yīng)體系如下：THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 12.5L Forward Primer（25M） 0.5LReverse Primer （25M） 0.5L Probe 0.25L

15、 cDNA樣品/標準品 5LRNase-free H20 6.25L總體積 25LqPCR反應(yīng)程序為：95 1min95 15s60 1min 讀取熒光值 39cycles3.3 結(jié)果與分析3.3.1 持感細胞胞外病毒的感染性實驗將PI22、PI33、PI58代次持感細胞培養(yǎng)時的上清液轉(zhuǎn)移至T25瓶BHK-21細胞中，12h后觀察持感細胞胞外病毒對正常BHK-21細胞的細胞致病變效應(yīng)（CPE）。如圖3-1，持續(xù)感染細胞上清液中有口蹄疫病毒感染性顆粒的釋放，該持感病毒可以使正常BHK-21發(fā)生CPE。圖3-1 持感細胞上清液感染正常BHK-21細胞照片(感染12h，×100)A：正常B

16、HK-21細胞，B：持感細胞PI22代次感染BHK-21細胞，C：持感細胞PI33代次感染BHK-21細胞，D：持感細胞PI58代次感染BHK-21細胞3.3.2持感細胞胞內(nèi)病毒載量的檢測然后，我們選取持感細胞PI32，PI48，PI63代次測定胞內(nèi)活病毒的載量。取匯合度達90%的三種細胞T25瓶，棄去上清液，加入6mL無血清新鮮MEM培養(yǎng)基，于-80冰箱冷凍過夜。裂解細胞，收集病毒液，分管保存在-80冰箱，取一只用于TCID50的檢測。結(jié)果如圖3-1，三個代次持感細胞胞內(nèi)均含有具有感染性的活病毒，其中PI32代次時胞內(nèi)病毒載量最低，為每毫升病毒原液含102.75個活病毒。PI48代次時病毒載

17、量最高，為每毫升病毒原液含103.6個活病毒。本實驗的結(jié)果還證明了持感細胞胞內(nèi)的病毒具有感染正常BHK-21細胞的能力。圖3-2不同代次病毒持感細胞胞內(nèi)病毒載量(TCID50滴度)3.3.3單細胞與群體細胞數(shù)據(jù)平均化后的比較用單細胞技術(shù)挑取群體細胞10個和50個各三組，使用單細胞裂解方法獲得細胞RNA、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR測定GAPDH基因和BP基因的表達量。將單細胞的值平均化與群體細胞平均值做對比，發(fā)現(xiàn)如圖3-3，單細胞的均值并不在群體細胞均值繪制的趨勢線上，單細胞數(shù)據(jù)具有相當大的標準偏差，這是細胞異質(zhì)性的表現(xiàn)。群體細胞的平均值無法體現(xiàn)細胞的異質(zhì)性，單個細胞基因的表達是具有波動性的。對單個

18、細胞基因表達量的研究更能發(fā)現(xiàn)細胞與細胞之間的差異性，而這種差異往往被群體實驗方法的隨意平均化所掩蓋。圖3-3單細胞和群體細胞的平均基因表達（單細胞：平均值±方差；10、50群體細胞：平均值±方差）3.3.4 正常BHK-21細胞與不同代次持感細胞的形態(tài)學(xué)特征挑選的正常細胞和持感細胞都是狀態(tài)良好，且具有代表意義的（圖3-4）。PI28代次是持續(xù)感染建立已經(jīng)穩(wěn)定的早中期，在初期持續(xù)感染的建立過程中，前10代次的傳代都是需要加入誘導(dǎo)持感形成的試劑NH4Cl的。故10代之后的細胞在很長一段時間的傳代時還需一個適應(yīng)的過程，即適應(yīng)沒有NH4Cl堿性選擇環(huán)境。因此，20代次前仍然是持感細

19、胞的不穩(wěn)定狀態(tài)，故選取早代次持感細胞時從PI28代次開始。持感細胞在傳代到末期時會發(fā)生兩種情況，一種是脫毒，這種情況并不是培養(yǎng)方式不當產(chǎn)生的，Domingo實驗室建立的C型口蹄疫持感細胞在傳代過程中也會發(fā)生脫毒現(xiàn)象，該現(xiàn)象被認為是細胞進化的結(jié)果，脫毒后的細胞與正常細胞相比對野生型病毒和持感病毒都表現(xiàn)出更強的抵抗力(de la Torre et al., 1985; Herrera et al., 2008)。第二種情況是，發(fā)生致細胞病變現(xiàn)象(CPE)。該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因應(yīng)該是細胞與病毒共生的平衡被打破，細胞不再耐受病毒的持續(xù)感染，選擇了死亡的方式?；谏鲜鰞牲c的考慮，我們選取的持感晚代次在PI6

20、8代次。本實驗對持感細胞的研究跨越40個代次，已包括持感細胞生活周期的所有典型時期，具有代表意義。圖3-4的形態(tài)學(xué)照片顯示，PI28細胞，PI38細胞，PI55細胞，PI68細胞與正常BHK-21細胞的形態(tài)無明顯差異，具備病毒持續(xù)感染細胞的基本特征。圖3-4. 正常BHK-21與持感細胞形態(tài)學(xué)照片(×100)A:正常BHK-21細胞，B:PI28細胞，C:PI38細胞，D:PI55細胞，E:PI68細胞3.3.5正常BHK-21細胞和不同代次的持感細胞中BP基因和病毒3D基因的表達量差異病毒持感細胞隨著傳代的進行，病毒量在不同代次中會發(fā)生變化，本實驗室黃璇博士論文中已有相關(guān)結(jié)果。首先

21、我們想知道在病毒持感群體水平，宿主細胞BP基因在不同代次之間的表達量和病毒量之間是什么關(guān)系。用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測了細胞BP基因和病毒3D蛋白的表達量，結(jié)果如圖3-4顯示，BP基因在PI55代次細胞中表達量最高，其次是PI38代，而PI68代次表達量最低。同時3D基因的表達與BP基因趨勢一致的有PI28代次和PI68代次，表達量都是BP基因低時，3D基因的表達量也低。在所有檢測的持感代次中，病毒量最高的代次是PI38代次，這與實驗室黃璇博士畢業(yè)論文中所描述的持感PI36代時病毒量達到頂峰的結(jié)果相一致。這些代次的持感細胞在收取群體樣品時，分別進行了單細胞的挑取。我們試圖用單細胞分析

22、技術(shù)窺探宿主BP基因與病毒3D基因的關(guān)系，初步探討B(tài)P基因與持感的建立和穩(wěn)定傳代之間的關(guān)系，揭示影響宿主與病毒共進化進程的內(nèi)在因素。AB圖3-5. 正常BHK-21細胞與持感不同代次群體細胞中BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達量A：正常BHK-21細胞與持感不同代次群體細胞中BP基因的表達量 B：正常BHK-21細胞與持感不同代次群體細胞中3D基因的表達量3.3.6 正常BHK-21細胞與傳代持感單細胞中BP基因和FMDV-3D基因的正態(tài)分布在2005年，Martin Bengtsson發(fā)表了一篇在單細胞領(lǐng)域造成深遠影響的文章，指出來自拉格漢斯胰島（The pancreatic islets

23、of Langerhans）的單細胞基因表達譜揭示mRNA水平的對數(shù)分布特性(Bengtsson et al., 2005)。為了呈現(xiàn)單細胞群體的基因表達譜，我們繪制了正常細胞與各代次持感細胞BP基因和3D基因的正態(tài)分布圖(圖3-6)。在對數(shù)正態(tài)分布中，隨機獨立性是趨于增加的，同時它們是正常分布的附加產(chǎn)物。細菌不同克隆之間指數(shù)生長的細菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)正態(tài)分布就是生物系統(tǒng)中的一個經(jīng)典例子(Limpert et al., 2001)。細胞中mRNA水平基因表達的這種變化反應(yīng)了真實的生物差異（biological variability）。如圖3-6，本實驗研究的五組細胞兩種基因的表達也均符合正態(tài)分布，

24、單細胞數(shù)據(jù)真實有效，隨后對其進行統(tǒng)計與分析并繪制相互關(guān)系圖。符合對數(shù)分布的群體其峰值與幾何平均值相當，即代表大部分細胞所分布的范圍。如圖3-6所示，在BP基因的正態(tài)分布圖中，只有PI28代次的峰值（Log2.3）在正常BHK-21（Log2）右側(cè)，說明PI28代次時陽性細胞中BP基因的表達量比正常細胞要高。在3D基因的正態(tài)分布圖中，PI38代次的峰值（Log2.6）最靠右，PI68代次的峰值（Log1.7）最靠左，幾乎相差了一個數(shù)量級，它們代表了口蹄疫病毒3D基因表達量最高和最低的兩個細胞代次。表3-1的數(shù)據(jù)是根據(jù)正態(tài)分布圖中的細胞數(shù)統(tǒng)計的，顯示各代次細胞兩種基因的陽性率情況和單細胞平均值。所

25、有單細胞均檢測了其看家基因（GAPDH）的表達，參與統(tǒng)計的數(shù)據(jù)均代表一個細胞內(nèi)基因表達的真實情況。數(shù)據(jù)顯示，正常BHK-21細胞中BP的檢出率最高，有96.8%的細胞都檢測到了BP基因的表達。而持感細胞中BP的檢出率都比正常細胞要低，可見，病毒的存在對宿主細胞BP基因的表達是有影響的。表達病毒3D蛋白的細胞比率隨著持感代次的增長而趨于穩(wěn)定，在早代次持感細胞PI28中，只有66.7%的細胞檢測到病毒3D蛋白，說明此時的持感細胞一個混合群體，其中即有攜帶病毒的持感細胞，也還存在正常未感染病毒的正常細胞。而當代次到達38代時，幾乎所有細胞都能檢測到病毒3D基因的表達，此時的持感細胞已可以說處于病毒與

26、細胞共生的穩(wěn)定狀態(tài)，高代次持感細胞病毒3D基因的檢測，也得到相同的結(jié)果，證實口蹄疫病毒穩(wěn)定存在于宿主細胞中，形成穩(wěn)定的持續(xù)感染狀態(tài)。而宿主BP基因的表達量卻是隨著持續(xù)感染細胞代次的升高逐漸降低的。AB圖3-6. 正常細胞與各代次持感細胞BP基因和3D基因的正態(tài)分布圖A：正常細胞與各代次持感細胞BP基因的正態(tài)分布圖；B：正常細胞與各代次持感細胞3D基因的正態(tài)分布圖表3-1正常細胞和各代次持感細胞單細胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計BHK-21PI28PI38PI55PI68細胞樣品總數(shù)(411)9381798771BP陽性細胞數(shù)（337）（陽性率）90(96.8%)65(80.2%)55(69.6%）72(82.8%

27、)55(77.5%）3D陽性細胞數(shù)（287）（陽性率）N/A54(66.7%）78(98.7%)87(100%)68(95.8%)BP平均（copies/cell）17321510160463D平均（copies/cell）N/A42616246682003.3.7 各代次持感單細胞BP基因與3D基因的關(guān)系分析散點圖3-7是以口蹄疫病毒3D基因的表達量為X軸，以BHK-21細胞BP基因的表達量為Y軸繪制而成的。同時以PI28代次3D基因的單細胞平均值繪制一條與X軸相交的豎線，以正常細胞BP基因的單細胞平均值繪制另一條與Y軸相交的橫線。如將該散點圖分成四個象限，R1，R2，R3，R4。R1代表B

28、P表達量高/3D表達量低區(qū)域，R2代表BP表達量高/3D表達量高區(qū)域，R3代表BP表達量低/3D表達量低區(qū)域，R4代表BP表達量低/3D表達量高區(qū)域。扇形圖則是將分布于4個區(qū)域中的細胞計數(shù)，計算出百分比含量后繪制而成的。圖3-7. 傳代持感單細胞BP基因相對病毒3D基因散點分布圖和扇形圖A、B、C、D：分別為PI28、PI38、PI55、PI68代次持感細胞的散點圖；E、F、G、H：分別為PI28、PI38、PI55、PI68代次持感細胞的扇形圖從圖3-7中可以看出，在持感細胞PI28代次時，BP基因上調(diào)的細胞比例（圖E：R1+R2）最大，有高達62.9%的細胞都分布在正常BHK-21細胞BP

29、基因均值線以上。當持感細胞傳代至PI38代時，宿主BP基因的表達逐漸降低，表達量低于正常細胞均值的細胞（圖F：R3+R4）占總數(shù)的78.2%。單細胞中病毒3D基因表達量高于PI28代次單細胞的均值的細胞比例（圖F：R2+R4）為66.7%，單個細胞中3D基因的含量最高值達17576 copies/cell。當持感細胞代次到達PI55和PI68時，病毒與宿主細胞已趨于平衡，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達均逐漸降低，在PI68代次時降至最低值。宿主BP基因下調(diào)細胞比例（圖H：R3+R4）為95.6%，病毒3D基因下調(diào)細胞（圖H：R1+R3）比例為91.2%。其中代表BP基因和3D基因均上調(diào)

30、的R2區(qū)域的細胞數(shù)在PI68代次時下降到了0。代表BP基因和3D基因均下調(diào)的R3區(qū)域所占的比例隨著持感代次的增加而增加，在PI68代次中達到了86.8%。這種數(shù)據(jù)只有從單細胞水平的檢測分析中才能得到。3.4 討論本實驗選取了持感細胞傳代過程中具有代表性的幾個代次，來深入研究持感細胞不同代次中宿主BP基因與病毒3D基因的相互關(guān)系。選取的持感細胞涵蓋早中晚四個代次，橫跨40代，每個代次檢測的單細胞數(shù)量均在70個以上，總計檢測持感單細胞樣品318個，具有統(tǒng)計學(xué)意義。并與正常BHK-21單細胞結(jié)果，一起做了比較與分析。對每一個單細胞我們都同時檢測了看家基因(GAPDH)，宿主基因（BP）和口蹄疫病毒基

31、因（3D）。看家基因的檢測使單細胞的數(shù)據(jù)更可信也更有說服力，也是我們確定BP基因陰性和3D基因陰性的依據(jù)。在持感細胞不同代次中，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達量都符合正態(tài)分布的規(guī)律，與文獻報道的相符。然后我們運用該數(shù)據(jù)將所有代次持感細胞的BP基因的表達量相對于病毒3D基因作圖，得到了兩個基因在持感細胞不同代次中表達量的變化情況。通過對持續(xù)感染細胞代次由低到高的跟蹤檢測，發(fā)現(xiàn)在病毒與細胞共進化的過程中，存在病毒復(fù)制效率與宿主細胞基因表達之間相互制約的過程。單細胞水平的實驗結(jié)果充分證實，持感細胞在其早代次PI28代時并不是每個細胞都感染上了病毒，3D基因的陽性率為66.7%，在持感細胞群體中還存在約三分之一的未感染細胞，這些未感染細胞會被持感病毒感染，成為新的持感細胞。有諸多研究表明，在持感形成的過程中細胞起到關(guān)鍵性的作用，是因為細胞自