微生物檢驗(yàn)操作指導(dǎo)書

1、34化驗(yàn)室操作指導(dǎo)書（受控）0微生物實(shí)驗(yàn)室操作指導(dǎo)書目錄（一）安全守則（二）檢驗(yàn)總則（三）基本技術(shù)要求（四）食品平板菌落計(jì)數(shù)（五）食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法（六）沙門氏菌檢驗(yàn)（七）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)（八）霉菌計(jì)數(shù)（九）革蘭氏染色（十）空氣中微生物的檢驗(yàn)（十一） 水中微生物的檢驗(yàn)（十二）食品接觸面的微生物檢驗(yàn)（十三）蔬菜農(nóng)殘的快速檢測審核： 編制： （一）安全守則1 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。2 在進(jìn)行高壓、干燥、消毒等工作時，工作人員不得擅自離開現(xiàn)場，認(rèn)真觀察溫度、時間，蒸餾易揮發(fā)、易燃液體時，不準(zhǔn)直接加熱，應(yīng)置水浴鍋上進(jìn)行。3 嚴(yán)禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌

2、操作進(jìn)行，如發(fā)生菌液、病原體濺出容器外時，應(yīng)立即用有效消毒劑進(jìn)行徹底消毒，安全處理后方能離開現(xiàn)場。4 工作完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時可用（殺菌劑）新潔爾滅、過氧乙酸液浸泡手，然后用水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時高壓消毒。5 實(shí)驗(yàn)完畢，及時清理現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)用具，對染菌帶毒物品，進(jìn)行消毒滅菌處理，并填寫日常工作記錄。6 每日下班，認(rèn)真檢查水、相關(guān)電源是否關(guān)閉和正在使用的設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，并認(rèn)真記錄。下班前關(guān)好門窗，方可離去。（二）檢驗(yàn)總則1 主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了微生物檢驗(yàn)一般規(guī)則。本文適用于食品中微生物學(xué)檢驗(yàn)的采樣、檢驗(yàn)及結(jié)果報(bào)告。2 樣品的采集2.1 采樣目的確保采集的樣

3、品能代表全部被檢驗(yàn)的物質(zhì)，使檢驗(yàn)分析更具代表性。2.2 采樣原則2.2.1 采集的樣品要有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，檢查是否有污染源存在，同時能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。2.2.2 應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況，在進(jìn)行檢驗(yàn)前不得污染，不發(fā)生變化。2.2.3 采樣必須遵循無菌操作程，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。2.3 采樣數(shù)量取樣數(shù)量的確定，應(yīng)考慮分析項(xiàng)目的要求、分析方法

4、的要求及被檢物的均勻程度三個因素。樣品應(yīng)一式三份，分別供檢驗(yàn)、復(fù)檢及備查使用，每份樣品數(shù)量一般不少于200g。根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品一般為25克。2.4 采樣方法2.4.1 采取隨機(jī)抽樣的方式。2.4.2 直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。2.4.3 如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至04。2.4.4 不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌增殖。2.4.5 在將冷凍食品送到實(shí)驗(yàn)室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。2.5 樣品的保存和運(yùn)送2.5.1 樣品采集完后，應(yīng)迅速送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，送檢過

5、程中一般不超過3h，如路程較遠(yuǎn)，可保存在15環(huán)境中，如需冷凍者，則在冷凍狀態(tài)下送檢。2.5.2 冷凍樣品應(yīng)存放在15以下冰箱內(nèi)；冷卻和易腐食品應(yīng)存放在05冰箱或冷卻庫內(nèi)；其它食品可放在常溫冷暗處。2.5.3 運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。2.5.4 待檢樣品存放時間一般不應(yīng)超過36小時。3 檢驗(yàn)樣品的制備3.1 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。3.2 檢驗(yàn)冷凍樣品前應(yīng)先使其融化?？稍?4融化，時間不超過18小時，也可在溫度不超過45的環(huán)境中融化，時間不超過15分鐘。3.3 檢驗(yàn)液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速

6、翻轉(zhuǎn)25次；如未裝滿，可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動25次。從混樣到檢驗(yàn)間隔時間不應(yīng)超過3分鐘。3.4 開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75乙醇消毒開啟部位及其周圍。3.5 非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)，吸管插入樣品內(nèi)的深度不應(yīng)超過2.5cm,也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。3.6 粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。3.7 固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進(jìn)行均質(zhì)，從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種，相隔時間不應(yīng)超過15分鐘。4 檢驗(yàn)4.1 實(shí)驗(yàn)室收到樣品后，首先進(jìn)行外觀檢驗(yàn)，及時按

7、照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)過程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。4.2 檢驗(yàn)所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過有效的滅菌。4.3 實(shí)驗(yàn)室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。4.4 制備試劑和培養(yǎng)基所用的水，應(yīng)為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。4.5 檢驗(yàn)結(jié)束后，所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。5 檢驗(yàn)記錄和結(jié)果的報(bào)告5.1 經(jīng)檢驗(yàn)的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗(yàn)記錄。樣品檢驗(yàn)過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗(yàn)記錄，以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不

8、得涂改和偽造。5.2 檢驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，及時填寫檢驗(yàn)報(bào)告書，簽字并經(jīng)負(fù)責(zé)人審核簽字后發(fā)出。（三）基本技術(shù)要求1 無菌操作要求微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員，必須有嚴(yán)格的無菌觀念，許多實(shí)驗(yàn)要求在無菌的條件下進(jìn)行，主要原因，一是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個人污染。要求如下：1.1 接種細(xì)菌時必須穿工作服、帶工作帽；1.2 進(jìn)行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用；1.3 接種食品樣品時，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?.4 進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅

9、菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用；1.5 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊；1.6 接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌活樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；1.7 接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到針和環(huán)與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼；1.8 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。2 無菌間使用要求2.1 無菌間應(yīng)密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門，另盡量設(shè)有的小窗，以備進(jìn)入無

10、菌間后傳遞物品。2.2 無菌間應(yīng)保持清潔，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與試驗(yàn)無關(guān)的物品。2.3 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸掉紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離工作臺1m處，照射時間不少于30分鐘，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。2.4 處理和接種食品標(biāo)本時，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。2.5 在無菌間需用安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。3 消毒滅菌要求微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須

11、經(jīng)滅菌后方能使用。3.1 滅菌前準(zhǔn)備3.1.1 所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。3.1.2 裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。3.2 裝放3.2.1 大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品不應(yīng)超過鍋內(nèi)容積的80%，物品應(yīng)放置鍋內(nèi)擱架上或鐵絲筐中。3.2.2 手提式高壓鍋：將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。3.3 設(shè)備檢查3.3.1 檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。3.3.2 壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度

12、計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。3.3.3 對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。3.4 滅菌處理手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行：3.4.1 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)使用時應(yīng)將水量補(bǔ)足，水變混濁需要更換）。3.4.2 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。3.4.3 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣（水沸騰后排氣1015min）。3.4.4 關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升

13、到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）。3.4.5 達(dá)到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸汽，待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至60后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60以下再打開蓋取物，以防止突然減壓液體劇烈沸騰活容器爆破。3.5 滅菌溫度與時間3.5.1 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見下表：物 品滅菌時間，min115121不含糖等耐熱培養(yǎng)基15含糖類等耐熱培養(yǎng)基1520染菌培養(yǎng)物30器械器皿303.6 滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查，以免再度污染。3.6.1 物

14、品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用。3.6.2 取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用。3.6.3 培養(yǎng)基或試劑等，應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達(dá)到者應(yīng)廢棄。3.6.4 取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。3.6.5 取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。3.6.6 凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。3.6.7 每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。4 有毒有菌污物處理要求微生物實(shí)驗(yàn)室所用實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律

15、不得帶出實(shí)驗(yàn)室。4.1 經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點(diǎn)，待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。4.2 經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121，30min高壓滅菌。4.3 染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小時，再經(jīng)121，30min高壓滅菌。4.4 涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗(yàn)用的玻片或平皿，必須經(jīng)高壓滅菌后洗滌。4.5 打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。4.6 污染的工作服或進(jìn)行烈性菌試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等

16、，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。5 玻璃器皿的清洗要求5.1 目的 為了保證微生物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，必須把器皿徹底清洗干凈。5.2 注意事項(xiàng)5.2.1 任何洗滌方法，都不應(yīng)對玻璃器皿有所損傷，不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。5.2.2 一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時，后用水沖洗干凈。5.2.3 用過的器皿應(yīng)立即洗滌，放置太久會增加洗滌困難。5.2.4 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品，都不能倒在洗滌槽內(nèi)，以免污染環(huán)境水質(zhì)，必須倒在廢水缸中。5.2.5 含有對人體有傳染性病菌的器具，應(yīng)先

17、煮沸滅菌后再進(jìn)行洗滌。5.2.6 難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起，以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起，否則使本來無油的器皿沾上了油垢，浪費(fèi)藥劑和時間。5.3 洗滌劑的種類：水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂5.4 洗滌方法5.4.1 含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法：事先應(yīng)將器皿中的瓊脂刮去，然后用清水洗滌，并用試管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自來水沖洗。洗好后的器皿應(yīng)倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。5.4.2 載玻片及蓋玻片的洗滌法：新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗23次，最后用蒸餾水換洗23

18、次。用過的載玻片及蓋玻片，應(yīng)用紙擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小時，再用自來水沖洗至中性。5.4.3 移液管、倒管的洗滌方法：新的移液管及倒管先在的鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗幾次，最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液，再放在洗衣粉水中浸泡一小時以上，再用自來水沖洗至管內(nèi)壁無殘?jiān)?，最后用蒸餾水換洗次，晾干后入恒溫干燥箱中烘干。6 培養(yǎng)基、無菌水的制備6.1 基本原理培養(yǎng)基的種類很多，不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型。目前所用培養(yǎng)基均為已配制好的生物試劑

19、和紙片。6.2 器材三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、角匙、杜氏小管、硅膠塞、電爐6.3 培養(yǎng)基的種類營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(附加抗菌素)、平板計(jì)數(shù)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白凍肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、EC肉湯、高鹽察氏瓊脂、三糖鐵瓊脂等6.4 方法步驟6.4.1 培養(yǎng)基的制備：6.4.2 稱量：根據(jù)培養(yǎng)基的配方，稱取適量藥品于搪瓷杯中；6.4.3 溶解：用量筒量取所需水量，置電爐上加熱，一邊攪拌，至完全溶解，加熱至沸騰，拔掉電源，待冷卻；6.4.4 分裝：根據(jù)不同需要，立即趁熱分裝入三角瓶或試管中，分裝

20、三角瓶以不超過三角瓶一半為宜，分裝試管一般為管長的1/5（需根據(jù)試管的大小而定）。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。6.4.5 塞硅膠塞：裝好培養(yǎng)基的試管應(yīng)塞上硅膠塞，松緊合適，緊貼管壁，不留縫隙，約1/2塞入內(nèi)，這樣即可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。6.4.6 包裝：三角瓶棉塞頭部應(yīng)用錫箔紙包扎，試管集中于試管簍。6.5 無菌水的制備：6.5.1 用10ml移液管量取9.2ml蒸餾水（稀釋水）裝入試管中。6.5.2 用100ml量筒量取95ml蒸餾水（稀釋水）裝入150ml的三角瓶中。可置少許玻璃珠于三角瓶內(nèi)，防止暴沸。6.5.3 量取240ml蒸餾水（稀

21、釋水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮紙包扎好，高壓滅菌備用。7 設(shè)備使用原則7.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用由實(shí)驗(yàn)員嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行，其他人員不得隨意操作。7.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備的日常維護(hù)保養(yǎng)由實(shí)驗(yàn)員根據(jù)設(shè)備操作說明書進(jìn)行，出現(xiàn)不可排除的故障時，經(jīng)部門總經(jīng)理批準(zhǔn)，商請專業(yè)人員維修。7.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行計(jì)量檢測，確保儀器的準(zhǔn)確性。7.4 實(shí)驗(yàn)員應(yīng)愛護(hù)儀器設(shè)備，使用前應(yīng)檢查，使用后應(yīng)及時清理清潔，并定期維護(hù)保養(yǎng)，下班前應(yīng)檢查設(shè)備電源是否關(guān)閉。（四）食品平板菌落計(jì)數(shù)1 主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了食品平板菌落計(jì)數(shù)的方法。本文適用于航空配餐的各種半成品、成品及原料，有專門規(guī)定的檢驗(yàn)方法的除外。2

22、設(shè)備和材料超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱（36±1）、均質(zhì)器、振蕩器、吸管（1ml、10ml）、平皿、稀釋瓶、天平等3 培養(yǎng)基和試劑平板計(jì)數(shù)瓊脂、75乙醇、磷酸鹽緩沖稀釋液4 操作程序4.1 樣品制備4.1.1 以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有包裝，則用75乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。4.1.2 制備樣品勻液以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時間超過2min，應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。4.2 稀釋樣品勻液4.2.1 用10ml滅菌吸管準(zhǔn)確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有9

23、0ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。振搖時，幅度為30cm，7s內(nèi)振搖25次。從容器中吸取樣品勻液和以后的稀釋操作中，吸管尖不要碰著瓶口。吸入的液體應(yīng)先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內(nèi)壁將液體調(diào)至所要求的刻度。4.3 平板接種4.3.1 對于每個樣品，選用合適的三個連續(xù)稀釋度的樣品液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。4.3.2 分別用滅菌吸管吸取1ml樣品液放入作了適宜標(biāo)志的平皿內(nèi)。每個稀釋度的樣品液用兩個平皿。4.3.3 分別加12-15ml平板計(jì)數(shù)瓊脂（約45左右）到平皿內(nèi)。立即將平皿內(nèi)的樣品液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合。要防止把混合物濺到平

24、皿壁和蓋上。同時將平板計(jì)數(shù)瓊脂傾入加有1ml稀釋劑的另一滅菌平皿作空白對照。將樣品液加入平皿后應(yīng)立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。4.4 培養(yǎng)待瓊脂凝固后將平皿翻轉(zhuǎn)，立即放進(jìn)36±1的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48±2h。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過15。4.5 菌落計(jì)數(shù)和記錄4.5.1 培養(yǎng)后，立即計(jì)數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。25-250個菌落為合適范圍。如不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板存放于0-4，但不得超過24h。4.5.2 操作者對同一平板復(fù)核自己的計(jì)數(shù)結(jié)果，其差異應(yīng)在5之內(nèi)，而其他人對這一平板重復(fù)計(jì)數(shù)，

25、其差異應(yīng)在10這內(nèi)。否則，應(yīng)找出原因，加以校正。4.6 計(jì)算和記錄數(shù)字適宜稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值或兩個稀釋度的平板菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋度倍數(shù)計(jì)算出每克（毫升）樣品中平板菌落數(shù)。記錄時，只有在換算到每克（毫升）樣品中平板菌落數(shù)時，才能定下兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)字采用四舍五入的方法記錄。也可將樣品的平板菌落數(shù)記錄為10的指數(shù)形式。5 結(jié)果報(bào)告報(bào)告每克（毫升）樣品中平板菌落數(shù)或估計(jì)的平板菌落數(shù)。注：本文參照SN0168-92出口食品平板計(jì)數(shù)（五）食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法1 主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法。本文適用于航空食品的檢

26、驗(yàn)。2 設(shè)備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1、44.5±0.5）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等3 培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、營養(yǎng)瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR-PV培養(yǎng)基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、生理鹽水、革蘭氏染色液、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑、甲基紅指示劑、Voges-pros kauer（V-P）試劑、4 樣品制備4.1 以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有

27、包裝，則用75乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。4.2 制備樣品勻液以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時間超過2min，應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。4.3 稀釋樣品勻液用10ml滅菌吸管準(zhǔn)確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。5 大腸菌群的測定5.1 大腸菌群MPN值的測定5.1.1 對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯，每管接種1ml。5.1.2

28、 將接種管置于36±1的培養(yǎng)48±2h。5.1.3 觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn)。5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)5.2.1 將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。5.2.2 置BGLB肉湯管于36±1的培養(yǎng)48±2h。5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。5.2.4 結(jié)果報(bào)告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。6 糞大腸菌群測定6.

29、1 用接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入44.5±0.5水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽性和陰性對照。6.3 記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。6.4 結(jié)果報(bào)告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。7 大腸桿菌測定7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅

30、美藍(lán)（EMB）平板，36±1的培養(yǎng)24±2h。7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。7.3 如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，36±1的培養(yǎng)18-24h。7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)。7.4.1 色氨酸肉湯：在36±1的培養(yǎng)24±2h后，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1的培養(yǎng)48±2h后。以無菌操

31、作移取培養(yǎng)物1ml至13mm*100mm試管中，加5-萘酚乙醇溶液0.6ml，40氫氧化鉀溶液0.2ml和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h，如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗(yàn)陽性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。7.4.3 Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36±1的培養(yǎng)96h記錄有無生長。7.4.4 LST肉湯：于36±1的培養(yǎng)48±2h，觀察試管中是否產(chǎn)氣。7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下靛基質(zhì)

32、MRVP枸掾酸鹽鑒定（型別）+-+-典型大腸桿菌非典型大腸桿菌+-+-+典型中間型非典型中間型-+-+典型產(chǎn)氣腸桿菌非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時做重復(fù)試驗(yàn)。7.5 結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗(yàn)為+-或-+-，再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表，報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。注：本文參照SN0169-92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法（六）沙門氏菌檢驗(yàn)1 主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。本文適用于航空食品的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料吸管（1ml、1

33、0ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1、42）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡、接種棒等3 培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水（BP）、氯化鎂孔雀綠增菌液、四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、DHL瓊脂、HE瓊脂、WS瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、ONPG培養(yǎng)基、半固體瓊脂、丙二酸鈉培養(yǎng)基、沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進(jìn)一步分型；163種用于詳細(xì)分型。4 檢驗(yàn)程序檢樣25g+225mlBP胨水沙門氏菌檢驗(yàn)程序如下：

34、36±1 4h10ml勻液+SC100ml10ml勻液+MM(或TTB)100ml42 18-24h36±1 18-24hDHLBS36±1 40-48h36±1 18-24h挑取可疑菌落TSI（斜面、底層、產(chǎn)氣、H2S），蛋白胨水（），尿素（PH7.2），KCN, 賴氨酸非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果H2S -靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+/-H2S +靛基質(zhì)+尿素-KCN-賴氨酸+H2S +靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+ONPG甘露醇、山梨醇非沙門氏菌沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)非沙門氏菌報(bào)告5 操作步驟5.1 前增菌取檢樣25g，加入225mL緩沖

35、蛋白胨水于均質(zhì)杯內(nèi)。用均質(zhì)器以800010000r/min打碎1min，于36±1培養(yǎng)4h(干蛋品培養(yǎng)1824h)，移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）或四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液內(nèi)，于42培養(yǎng)1824h。同時，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽骯氨酸（SC）增菌液內(nèi)，于36±1培養(yǎng)1824h。5.2 分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36±1分別培養(yǎng)1824h(DHL)或4048h(BS)，觀察各個平板上生長的菌落，沙門氏菌、和沙門氏菌在各個平板上的菌落特征見

36、表1。表1沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌、沙門氏菌（即亞利桑那菌）BS瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)硫化氫，形成灰綠色的菌落周圍培養(yǎng)基不變黑色有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明；產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與沙門氏菌、相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色5.3 生化試驗(yàn)5.3.1 自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內(nèi)，腸桿菌科常見屬種的反應(yīng)結(jié)果見表2。表2腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種-+/-

37、+沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+/-+沙門氏菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬-+-傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+/-大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌說明：在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除，其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。5.3.2 在接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN

38、)培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各1管，于36±1培養(yǎng)1824h，必要時可延長至48h，按表3判定結(jié)果。按反應(yīng)序號分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B1，其他5種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。表3腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫靛基質(zhì)尿素氰化鉀賴氨酸判定菌屬A1+-+沙門氏菌屬A2+-+沙門氏菌屬（少見）緩慢愛德華氏菌A3+-+-弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4+-普通變形桿菌B1-+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬B2-+-+-大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3-+/-+-克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4-+/

39、-+-摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬5.3.3 反應(yīng)序號A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常，則按A3判定為弗勞地氏檸檬酸桿菌。表4尿素氰化鉀賴氨酸判定結(jié)果-+-+-+甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌或（要求符合本群生化特性）沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）5.3.4 反應(yīng)序號A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，按表5判定結(jié)果。表5甘露醇山梨醇判定結(jié)果+-+-沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）緩慢愛德華氏菌5.3.5 反應(yīng)序號B1：補(bǔ)做ONPG。ONPG十為大腸埃希氏菌，ONPG為沙門氏菌。同時，沙門氏

40、菌應(yīng)為賴氨酸，但甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸。5.3.6 必要時按表6進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。表6沙門氏菌屬各生化群的鑒別項(xiàng)目衛(wèi)矛醇山梨醇水楊苷ONPG丙二酸鹽KCN+-+-+-+-+-+-+-+-+-5.4 血清學(xué)分型鑒定具體內(nèi)容見GB/T4789.4-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)中6.4。5.5 菌型的判定和結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照GB/T4789.4-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)中表8或有關(guān)沙門氏菌屬抗原表判定菌型，并報(bào)告結(jié)果。注：本文參照GB/T4789.4-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)（七）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)1 主題內(nèi)容

41、與適用范圍本文規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本文適用于航空食品的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡、接種棒等3 培養(yǎng)基和試劑普通肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、BairdPrker瓊脂平板、緩沖蛋白胨水（BP）、凝固酶試驗(yàn)凍干血漿4 檢驗(yàn)程序（非選擇性增菌法）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序如下：檢樣25g+225mlBP胨水10ml勻液+10ml雙料胰胨肉湯上述混合液+20ml20NaCl單料胰胨肉湯36±1 2hB-P平板36±1 24h36±1 48h挑可疑菌落，移種到

42、肉湯培養(yǎng)基36±1 24h涂片染色凝固酶試驗(yàn)觀察溶血報(bào)告5 操作步驟5.1 稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mLBP胨水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。5.2 吸取10mL上述混懸液，接種于10mL雙料胰蛋白胨大豆肉湯中，置36±1培養(yǎng)2h。5.3 再加入20ml 含20NaCl的單料胰蛋白胨大豆肉湯，置36±1培養(yǎng)24±2h。5.4 劃線轉(zhuǎn)種2個表面干燥的BairdParker瓊脂平板上，36±1培養(yǎng)46±2h。5.5 挑取可疑菌落移種到肉湯培養(yǎng)基中，置36±1溫箱培養(yǎng)24h。5.6 取肉湯培養(yǎng)物

43、0.3ml同0.5ml凝固酶試驗(yàn)凍干血漿于8mm*100mm試管內(nèi)充分混合，置36±1培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h，以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動為陽性。試驗(yàn)中需同時做已知陽性和陰性對照。對可疑結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗(yàn)。5.7 本菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.51m。在BairdParker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明

44、圈。5.8 報(bào)告結(jié)果如發(fā)現(xiàn)有凝固酶試驗(yàn)陽性的菌落，即報(bào)告1g(ml)食品中有金黃色葡萄球菌存在，否則為陰性。注：本文參照SN0172-92出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法（八）霉菌計(jì)數(shù)1 主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了食品和飲料霉菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)方法。本文適用于航空食品和飲料中霉菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料溫箱（2528）、振蕩器、天平、玻塞三角瓶（500mL）、平皿（直徑9cm）、吸管（1mL及10mL）、酒精燈等。3 培養(yǎng)基和試劑高鹽察氏培養(yǎng)基、滅菌蒸餾水、乙醇4 操作步驟4.1 無菌操作稱取檢樣25g(或25mL)，放人含有225mL滅菌水的玻塞三角瓶中，振搖30min，即為1：10稀釋液。4

45、.2 用滅菌吸管吸取110稀釋液10mL，注入試管中，另用帶橡皮乳頭的1mL滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。4.3 取1mL110稀釋液注入含有9mL滅菌水的試管中，另換一支1mL滅菌吸管吹吸5次，此液為1100稀釋液。4.4 按上述操作順序做10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1mL滅菌吸管，根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì)，選擇3個合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿，然后將涼至45左右的培養(yǎng)基注入平皿中，待瓊脂凝固后，倒置于2528溫箱中，3d后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。4.5 計(jì)算方法：通常選擇菌落數(shù)在10150之間的平皿進(jìn)行

46、計(jì)數(shù)，同稀釋度的2個平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克(或毫升)檢樣中所含霉菌數(shù)。4.6 報(bào)告：每克(或毫升)食品所含霉菌以個/g(個/mL)表示。注：本文參照GB/T4789.15-2003食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)（九）革蘭氏染色1 原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的鑒別染色法，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌和陰性菌兩大類。其過程是：草酸銨結(jié)晶紫初染路哥爾氏碘液媒染95%乙醇脫色蕃紅花紅復(fù)染。若細(xì)胞能保持結(jié)晶紫與碘所形成的復(fù)合物而不被乙醇脫色，則細(xì)菌呈紫色，稱革蘭氏陽性菌，若被乙醇脫色而被蕃紅復(fù)染成紅色，則稱革蘭氏陰性菌，2 藥品與材料革蘭氏染色液（草酸銨結(jié)晶紫液路哥爾氏碘

47、液95%乙醇蕃紅花紅）、蒸餾水、菌落培養(yǎng)物（培養(yǎng)1824小時）、二甲苯、香柏油3 器具及其它載玻片、蓋玻片、酒精燈、廢液缸、洗瓶、吸水紙、接種環(huán)、顯微鏡、鑷子4 操作程序涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫初染水洗碘液媒染95%酒精脫色2030秒水洗蕃紅花紅液復(fù)染水洗干燥鏡檢4.1 涂片：先滴一小滴蒸餾水于載玻片中央，然后用接種環(huán)取少量菌體輕輕混入水中，涂成一薄層并使細(xì)胞均勻分散。4.2 干燥：在空氣中令其自然干燥或在酒精燈火焰上端高處微微加溫但勿靠近火焰。4.3 固定：把涂有細(xì)菌的面朝上，在酒精燈火焰上通過三次，目的是殺死菌體細(xì)胞以及改變對染色劑的通透性，同時使涂片的菌體緊貼載玻片而不易被水沖洗脫落。4

48、.4 初染：用草酸銨結(jié)晶紫液初染1分鐘，水洗、吸干。4.5 媒染：加一滴路哥爾氏碘液媒染1分鐘、水洗。（此時結(jié)晶紫與碘液成復(fù)合物）4.6 脫色：斜置載玻片，用95%酒精沖洗約2030秒種，立即水洗，吸干。4.7 復(fù)染：用蕃紅花紅液復(fù)染12分種，水洗晾干或用吸水紙吸干。4.8 鏡檢：在顯微鏡油浸鏡下檢查革蘭氏陽性菌和陰性菌染色的差異，并觀察菌體形態(tài)。5 革蘭氏染色成敗的控制點(diǎn)5.1 涂片厚度：涂片過厚，細(xì)胞重疊，無法較好地觀察單個細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，涂片過薄，細(xì)胞數(shù)量少，不利于觀察；5.2 染色時間。染色時間過長,結(jié)晶紫與細(xì)胞結(jié)合，脫色不易，染色不夠，結(jié)晶紫尚未與細(xì)胞結(jié)合。染色控制不好，易引起誤判；5

49、.3 乙醇脫色的程度。如脫色過度，則陽性菌被誤染為陰性菌；若脫色不夠，則陰性菌被誤染為陽性菌。（十）空氣中微生物的檢驗(yàn)1 目的了解空氣中微生物的狀況，掌握空氣中微生物的檢驗(yàn)方法，分析引起食品中微生物的來源因素，及時控制餐食衛(wèi)生質(zhì)量。2 原理根據(jù)空氣中微生物一般吸附在塵埃中，由于地心引力塵埃下沉到地面或物體表面原理制定的。3 器材培養(yǎng)皿、生化培養(yǎng)箱、營養(yǎng)瓊脂4 方法（沉降法）4.1 以無菌操作將已融化并冷卻至50的營養(yǎng)瓊脂倒入培養(yǎng)皿中，放置凝固。4.2 在不同地點(diǎn)將培養(yǎng)皿分別打開，在空氣中暴露15分鐘，立即將培養(yǎng)皿蓋好，作上記號，并作一空白對照。4.3 將培養(yǎng)皿放置37恒溫培養(yǎng)48小時，取出觀察

50、其結(jié)果并計(jì)算出菌落數(shù)。4.4 計(jì)算公式：每立方米空氣中細(xì)菌數(shù)50000N/(A×t)N：為培養(yǎng)皿經(jīng)培養(yǎng)后的菌落數(shù)A：為所用平皿面積(cm2)，平皿直徑(ø)9cmt：為平皿暴露于空氣中的時間(t=15分鐘)（這個公式根據(jù)：根據(jù)15分鐘內(nèi)在100 cm2面積上降落的細(xì)菌數(shù)約等于10升空氣中的含菌數(shù)而估計(jì)的。）注：本文參照GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)附錄E（十一） 水中微生物的檢驗(yàn)1 基本原理細(xì)菌總數(shù)是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)?？偞竽c菌群系指一群在37培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主

51、要來源于人畜糞便，具有指示菌的一般特征，故以此作為糞便污染指標(biāo)評價飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。水中總大腸菌群數(shù)系以100ml水樣中污染的總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。按國家飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，1毫升自來水中雜菌數(shù)不得超過100個，大腸菌群數(shù)1000毫升水中不得超過3個才算合格。2 材料營養(yǎng)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、酒精、棉簽、培養(yǎng)皿、無菌廣口瓶3 方法3.1 采樣（自來水）：先將水龍頭打開，放水12分鐘后，關(guān)閉水龍頭。用酒精棉球灼燒龍頭三分鐘滅菌，再開放水龍頭使水流5分鐘，用無菌瓶收集水樣。3.2 細(xì)菌總數(shù)檢查：3.2.1 用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中，共做2個。3.2.2 分別傾注約1

52、5ml已熔化冷卻至45左右的營養(yǎng)瓊脂，混勻后置37培養(yǎng)24小時進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時應(yīng)作一空白對照。兩個培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)即為水樣1ml中的細(xì)菌總數(shù)。3.3 大腸菌群數(shù)檢查：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)報(bào)告3.3.1 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：自來水的接種方法：在2個裝有50ml三倍料乳糖膽鹽發(fā)酵液的三角瓶中，各加入100ml水樣；在10支裝有5ml同樣發(fā)酵的試管中，各加入10ml水樣，混勻。將上述各發(fā)酵管（瓶）置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時，觀察結(jié)果。如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。3.3.2 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管用接種環(huán)分別以劃線法轉(zhuǎn)

53、接于伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時，取出觀察菌落形態(tài)。3.3.3 證實(shí)試驗(yàn)：在每個平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫紅色，有或略有或沒有金屬光澤的菌落)12個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1培養(yǎng)24±2小時進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的芽孢桿菌即可報(bào)告為大腸菌群陽性。4 報(bào)告每毫升自來水所含菌落數(shù)以個/mL表示；根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查大腸菌群檢索表，報(bào)告每升水樣的大腸菌群的最可能數(shù)。注：本文參照GB5750-85生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法（十二）食品接觸面的微生物檢驗(yàn)1 原理食品接觸面分為

54、人員手、設(shè)備、器具等食品直接接觸，其表面存在有微生物，為更好控制微生物生長繁殖，以大腸菌群、菌落總數(shù)為主要檢測指標(biāo)。2 檢驗(yàn)材料虎紅瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液、無菌棉球、無菌水、酒精棉球、酒精燈、鑷子3 檢驗(yàn)方法3.1 人員手檢驗(yàn)（發(fā)酵法）3.1.1 樣品采集被檢人雙手五指并攏，用一浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10ml滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)。3.1.2 細(xì)菌菌落總數(shù)的檢測將已采集的樣品在6h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，每支采樣管充分混勻后取1ml樣液，放入滅菌平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個樣品平行接種兩塊平皿，置36±1培養(yǎng)48小時，計(jì)數(shù)平板上細(xì)菌菌落數(shù)。YA*10（Y為工人手表面細(xì)菌菌落總數(shù)，cfu/只手；A為平