《酵母RNA的提取》PPT課件

1、酵母RNA的提取1 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 1、掌握稀堿法提取、掌握稀堿法提取RNARNA的原理和方的原理和方法法 2 2、學(xué)習(xí)和了解其它提取、學(xué)習(xí)和了解其它提取RNARNA的方法的方法和原理和原理2、實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)和難點(diǎn) 離心機(jī)的運(yùn)用 提取RNA的實(shí)驗(yàn)原理3 3、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理 普通的生物細(xì)胞中同時(shí)含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多， RNA2.6710.0%，DNA那么少于2(O.03O.516)，在實(shí)驗(yàn)室常用酵母作為RNA提取的資料。假設(shè)要制備具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；假設(shè)對(duì)生物活性沒(méi)有要求，那么可運(yùn)用濃鹽

2、法，稀堿法等。工業(yè)中用稀堿法或濃鹽法，主要用于制備核苷酸的原料. 苯酚法：組織勻漿用苯酚處置并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)那么留在酚層中，向水層參與乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。 濃鹽法：在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改動(dòng)細(xì)胞膜的透性，使RNA 釋放出來(lái)，再利用等電點(diǎn)pH為2.02.5沉淀。此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。鹽濃度需求控制，太低，RNA不易從細(xì)胞中釋放出來(lái)，太高，細(xì)胞急劇收縮不利于抽提。普通80120g/L為宜。 稀堿法：利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，稀堿法：利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，使使RNARNA釋放出來(lái)，這種方法提

3、取時(shí)間短，釋放出來(lái)，這種方法提取時(shí)間短，但但RNA RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；分解； 本實(shí)驗(yàn)采用的稀堿，既可加速細(xì)胞的破本實(shí)驗(yàn)采用的稀堿，既可加速細(xì)胞的破裂，又可增大裂，又可增大 RNARNA的溶解度。當(dāng)堿被中的溶解度。當(dāng)堿被中和后，可用乙醇和后，可用乙醇( (或者異丙醇將或者異丙醇將RNARNA沉沉淀，或用等電點(diǎn)沉淀淀，或用等電點(diǎn)沉淀RNA(RNA(應(yīng)嚴(yán)厲控制應(yīng)嚴(yán)厲控制pH,pH,緩慢調(diào)緩慢調(diào)),),此為此為 RNARNA的粗品。的粗品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水和磷酸各組分。

4、加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測(cè)出上述組分的解，從水解液中可以測(cè)出上述組分的存在。存在。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖堿基堿基水水解解 1 1嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。呤銀化合物沉淀。 2 2磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀磷鉬酸銨沉淀(NH4)3PO412MoO3,(NH4)3PO412MoO3,有有復(fù)原劑存在時(shí)，構(gòu)成藍(lán)色鉬藍(lán)。復(fù)原劑存在時(shí)，構(gòu)成藍(lán)色鉬藍(lán)。 (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2S

5、O4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3MoO3鉬藍(lán)鉬藍(lán) 復(fù)原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長(zhǎng)復(fù)原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長(zhǎng)660nm660nm測(cè)定吸光值，當(dāng)無(wú)機(jī)磷含量在測(cè)定吸光值，當(dāng)無(wú)機(jī)磷含量在125g 125g 范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。 RNA RNA的含磷量為的含磷量為9.5%9.5%，即，即1g RNA1g RNA磷相當(dāng)于磷相當(dāng)于10.5 10.5 g RNAg RNA。DNADNA的含磷量

6、平均為的含磷量平均為9.9%9.9%。Vit C 3 3地衣酚地衣酚( (苔黑酚顯色法：苔黑酚顯色法：RNARNA與酸共與酸共熱時(shí)降解，構(gòu)成戊糖，繼而構(gòu)成糠醛熱時(shí)降解，構(gòu)成戊糖，繼而構(gòu)成糠醛-呋喃甲醛，糠醛與地衣酚呋喃甲醛，糠醛與地衣酚3 3，5-5-二羥基二羥基甲苯反響，構(gòu)成鮮綠色復(fù)合物，可用比甲苯反響，構(gòu)成鮮綠色復(fù)合物，可用比色法測(cè)定。當(dāng)色法測(cè)定。當(dāng) 核糖核酸濃度在核糖核酸濃度在 10 10100g/ml 100g/ml 范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線性關(guān)系需求性關(guān)系需求FeCl3FeCl3或或Cu2+Cu2+作催化劑。作催化劑。4、實(shí)驗(yàn)操作( (一一)RNA)RNA

7、的提取的提取1 1稱稱5g5g干酵母粉于干酵母粉于150 ml150 ml三角燒瓶中，加三角燒瓶中，加25ml O.225ml O.2的的 NaOHNaOH，沸水浴中攪拌提取，沸水浴中攪拌提取20 min20 min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性，性，pHpH約約5-65-6，目的是去除蛋白質(zhì)。，目的是去除蛋白質(zhì)。2 2離心離心(4000 r(4000 rminmin，13 min)13 min)，去除沉淀。上清液冰浴。，去除沉淀。上清液冰浴。3 3向上清液中參與向上清液中參與20 ml20 ml約上清液的兩倍體積約上清液的兩倍體積9595乙醇，乙醇，稍攪拌后靜置冰浴約

8、稍攪拌后靜置冰浴約10min10min。待完全沉淀后離心。待完全沉淀后離心(4000 r(4000 rminmin，15 min) 15 min) ，去上清液。，去上清液。4 4沉淀用沉淀用9595乙醇洗兩次如沉淀浮起需再次離心，每乙醇洗兩次如沉淀浮起需再次離心，每次約次約10mL;10mL;用乙醚洗兩次，每次用乙醚洗兩次，每次10mL10mL。目的是去除脂溶性物質(zhì)。目的是去除脂溶性物質(zhì)和水，乙醚的沸點(diǎn)比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的和水，乙醚的沸點(diǎn)比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的枯燥?？菰?。( (二二)RNA)RNA的鑒定的鑒定 取沉淀約取沉淀約1g1g，加，加10 ml 101

9、0 ml 10H2SO4H2SO4沸水浴中加熱沸水浴中加熱30 min30 min。5 5嘌呤堿嘌呤堿 取水解液取水解液2mL2mL參與參與2mL2mL濃氨水，然后參與濃氨水，然后參與約約1mL 5%1mL 5%硝酸銀溶液，察看有無(wú)嘌呤堿的銀化合物沉淀。硝酸銀溶液，察看有無(wú)嘌呤堿的銀化合物沉淀。漸漸參與嘌呤堿時(shí)，沉淀上浮，搖勻，沉淀下沉漸漸參與嘌呤堿時(shí)，沉淀上浮，搖勻，沉淀下沉6 6核糖核糖 取取1 1支試管參與水解液支試管參與水解液0.5mL0.5mL、1mL1mL苔黑酚三苔黑酚三氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中2 2分鐘。留意溶液能否分鐘。留意溶液能否變成綠色，闡明

10、核糖的存在。時(shí)間久了會(huì)有黑色沉淀，變成綠色，闡明核糖的存在。時(shí)間久了會(huì)有黑色沉淀，是濃度高，產(chǎn)物結(jié)晶出來(lái)了。是濃度高，產(chǎn)物結(jié)晶出來(lái)了。5 5、本卷須知、本卷須知 避開(kāi)磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍避開(kāi)磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍20207070，防止，防止RNA RNA 降解。在降解。在9090100100條件下加條件下加熱可使蛋白量變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯熱可使蛋白量變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于酶，有利于RNA RNA 的提取。的提取。 在調(diào)在調(diào)pH pH 值時(shí)，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)值時(shí)，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)展。展。 在洗滌時(shí)，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否那在洗滌時(shí)，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否那么將導(dǎo)致么將導(dǎo)致RNA RNA 部分溶解而呵斥損失，降低部分溶解而呵斥損失，降低RNA RNA 提提取率。取率。 提取提取 RNA RNA 時(shí)必需用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，時(shí)必需用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，NaOH NaOH 必需實(shí)現(xiàn)預(yù)熱。必需實(shí)現(xiàn)預(yù)熱。 用乙酸調(diào)用乙酸調(diào) pH5pH56 6 必需有，目的可以除去一些必需有，目的可以除去一些雜質(zhì)。雜質(zhì)。 最后過(guò)濾前必需將乙醇瀝干，不能帶水，否那最后過(guò)濾前必